本发明属于天然产物分离提取领域，涉及一种可以促进益生菌生长的杨树皮提取物及其制备方法。
背景技术：
：杨树(populusspp.)是杨柳科(salicaceae)杨属植物的统称。中国有杨树60余种，此外还有很多变种和引种的品种，主要分布在北方和西南地区，遍及全国，资源丰富，是我国绿化、造林的主要树种。杨树具有抗旱、耐寒、生长快、轮伐期短、纤维品质高等特点，在防风固沙、环境保护、水土保持、农田改良等方面起着十分重要的作用，在工业和生活上具有多种用途。同时，杨树还具有抗菌、消炎、镇痛等多种药理作用。在民间，杨树可用来治疗风湿、高血压等疾病。迄今为止，已从杨树植物中分离到黄酮、有机酸、三萜等多种化学成分。杨树芽含有大量的黄酮类化合物，因而具有药用价值，可以利水通便、解热毒、驱虫。有文献报道杨树芽醇提取物成分与蜂胶极为接近，具有较好的开发应用价值。目前已有文献报道从杨树芽中提取黄酮的方法，有蒸馏水、丙酮、乙酸乙酯、乙醇溶剂4种方法，通常认为70％乙醇溶液提取法是比较好的方法。但普遍存在提取率低的问题。杨树皮是在杨树木材加工过程中产生的大量废弃物，相比于杨树芽杨树皮的资源量巨大。但目前，尚未见到从杨树皮中提取黄酮类物质及其对益生菌生长调控作用的报道。技术实现要素：为充分利用杨树资源，提高杨树资源的高效利用和综合利用水平，本发明提供一种可以促进益生菌生长的杨树皮提取物及其制备方法，该方法利用杨树皮提取功能活性成分，提高了杨树皮的总和利用价值，且成本低廉、提取时间短。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种促进益生菌生长的杨树皮提取物，以杨树皮为原料，先采用超声辅助提取剂粗提，离心后，离心液浓缩得到杨树皮粗提液，再活性炭吸附去除小分子物质，大孔树脂纯化、干燥得到杨树皮提取物，得率质量百分比计为1％～2％；所述的杨树皮提取物的主要成分为芦丁和金丝桃苷。制备所述的促进益生菌生长的杨树皮提取物的方法，以杨树皮为原料，先采用超声辅助提取法粗提，离心后，离心液浓缩得到杨树皮粗提液，再脱色后大孔树脂纯化、干燥得到杨树皮提取物。具体步骤为：(1)粗提取：将杨树皮粉加入提取剂中，用超声辅助提取法提取杨树皮中的水溶性成分得提取液，然后将提取液离心除渣，取离心液浓缩，得杨树皮粗提液；其中，提取剂为乙醇溶液；(2)活性炭脱色：将粗提液用活性炭脱色除去色素，过滤，收集滤液；(3)大孔树脂纯化：将粗提液在大孔树脂中进行充分吸附后，然后充分水洗，再用洗脱剂洗脱，最后收集洗脱液进行真空浓缩，分离并回收洗脱剂，得浸膏；其中，洗脱剂为乙醇溶液；(4)干燥得成品：将浸膏进行干燥后，得杨树皮提取物。步骤(1)中杨树皮和提取剂按照料液比1:10～15(kg/l)的量加入。步骤(1)中超声辅助提取法中采用有探头的超声仪，且探头直接作用于提取液；超声辅助提取法的条件为：超声功率1000～4800kw，超声时间1～2h，提取温度25～65℃。步骤(3)中的水洗要求水洗的洗出液检查不出糖为止。提取剂和洗脱剂均为体积浓度30～90％的乙醇溶液。步骤(4)中干燥为真空干燥。步骤(1)中取离心液浓缩步骤中还包括回收提取剂，回收后的提取剂经调配后再次应用于提取；步骤(3)中分离的洗脱剂回收经调配后再次应用于洗脱。所述的促进益生菌生长的杨树皮提取物在促进益生菌生长中的应用。有益效果：1.本发明利用杨树皮为原料，应用超声辅助提取法进行活性成分的提取，超声探头直接作用于料液，提取更加充分。再以活性炭吸附去除粗提液中的色素成分等杂质。最后采用大孔树脂法，利用黄酮类物质结构中的酚羟基与树脂反应吸附，最后以洗脱剂洗脱得到高效纯化的杨树皮活性成分芦丁和金丝桃苷，含量分别可达到19.2％和13.9％。2.洗脱剂可以反复回收利用，洗脱方式简单易行。整个操作过程简单，污染小，成本低廉，且运行时间短。3.经实验验证本发明制备的杨树皮提取物对益生菌生长具有明显的促进作用。很好的证明了杨树皮提取物中对益生菌生长促进的主要成分为芦丁和金丝桃苷。4.本发明不仅可以提高杨树资源的综合利用价值，还可以解决大量杨树皮丢弃后造成环境污染的问题，实现了农林加工废弃物的再利用，具有重要的经济及社会意见。尤其离心液浓缩步骤回收有机溶剂，回收后的有机溶剂经调配后可再次应用；洗脱液进行真空浓缩步骤，分离回收得到洗脱剂，洗脱剂经调配后可继续使用，所用大孔树脂经反复使用后，可再生，继续使用，仍不影响其吸附洗脱性能；做到了环保，循环利用，节约资源的效果。附图说明图1未添加活性炭吸附的提取物谱图。图2芦丁标准曲线。图3本发明方法获得的杨树皮提取物高效液相色谱图。图4杨树皮提取物对长双歧杆菌(a)和嗜酸乳酸杆菌(b)生长的促进作用。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。本发明提供了一种可以促进益生菌生长的杨树皮提取物及其制备方法，包括以下步骤：(1)粗提取：将杨树皮晾干粉碎后加入提取剂中，用超声辅助提取法提取杨树皮中的水溶性成分得提取液，然后将提取液离心除渣，取离心液浓缩，得杨树皮粗提液；其中，提取剂为体积浓度为30～90％的乙醇溶液；超声辅助提取法的条件为：超声功率1000～4800kw，超声时间1～2h，提取温度25～65℃，提取次数2次；(2)活性炭脱色：将粗提液用活性炭脱色除去色素，过滤，收集滤液；其中活性炭的加入量为10～20mg/ml。(3)大孔树脂纯化：将粗提液在大孔树脂中进行充分吸附后，然后充分水洗，再用洗脱剂洗脱，最后收集洗脱液进行真空浓缩，分离并回收洗脱剂，得浸膏；其中，洗脱剂为体积浓度为30～90％的乙醇溶液。(4)干燥得成品：将浸膏进行干燥后，得杨树皮提取物，得率质量百分比计为1％～2％，所述的杨树皮提取物的主要成分为芦丁和金丝桃苷。作为本发明的进一步改进，步骤(1)中杨树皮和提取剂按照料液比1g:10～15l的量加入。作为本发明的进一步改进，步骤(1)中超声辅助提取法中采用有探头的超声仪，且探头直接作用于提取液。作为本发明的进一步改进，步骤(3)中的水洗要求水洗的洗出液检查不出糖为止。作为本发明的进一步改进，步骤(3)中的洗脱剂的体积为2～15bv，洗脱速度为4～9bv/h。作为本发明的进一步改进，步骤(3)中的吸附时间为4～24h。作为本发明的进一步改进，步骤(3)中干燥为真空干燥，条件为预冻温度-20℃，预冻时间12h，干燥时间24h。作为本发明的进一步改进，步骤(1)中取离心液浓缩步骤中还包括回收提取剂，回收后的提取剂经调配后可再次应用于提取；步骤(2)中粗提液用活性炭脱色除去色素；步骤(3)中分离的洗脱剂回收经调配后可再次应用于洗脱。作为本发明的进一步改进，所述提取剂为体积浓度70％的乙醇溶液；所述的超声功率为4800kw，超声时间为2h，提取温度为65℃，提取次数2次；所述的洗脱剂为体积浓度为70％的乙醇溶液。本发明制备的促进益生菌生长的杨树皮提取物其主要成分为芦丁和金丝桃苷。本发明提供了一种可以促进益生菌生长的杨树皮提取物。实施例1以超声辅助提取法提取杨树皮中水溶性成分，将提取液离心除渣，浓缩，去除并回收有机溶剂，得杨树皮粗提液，所用提取剂为体积浓度为70％的乙醇溶液，超声功率4800kw，超声时间2h，提取温度65℃，提取次数2次。粗提液经浓缩除去有机溶剂，水相经冷冻干燥后的杨树皮粗提物，提取得率可达10.7％。取杨树皮粗提物40.0g用200ml的70％乙醇充分溶解，加入4g活性炭稍加热进行脱色，滤去活性炭，滤液上hp-20大孔树脂柱进行充分吸附10h，然后开始水洗，至洗脱液检测不出糖开始用洗脱剂洗脱，所述洗脱剂为体积浓度为70％的乙醇，所述洗脱剂体积为10bv，洗脱速度为4bv/h，洗脱完成后收集洗脱液，进行真空浓缩，分离并回收洗脱剂，洗脱剂经调配后可继续使用，所得浸膏经真空冷冻干燥后，得杨树皮提取物成品8.6g，提取得率2.29％。实施例2以超声辅助提取法提取杨树皮中水溶性成分，将提取液离心除渣，浓缩，去除并回收有机溶剂，得杨树皮粗提液，所用提取剂为体积浓度为50％的乙醇溶液，超声功率3000kw，超声时间2h，提取温度50℃，提取次数2次。粗提液经浓缩除去有机溶剂，水相经冷冻干燥后的杨树皮粗提物，提取得率可达9.1％。取杨树皮粗提物40.0g，用200ml的30％乙醇充分溶解，加入4g活性炭稍加热进行脱色，滤去活性炭，滤液上hp-20大孔树脂柱进行充分吸附2h，然后开始水洗，至洗脱液检测不出糖开始用洗脱剂洗脱，所述洗脱剂为体积浓度为90％的乙醇，所述洗脱剂体积为4bv，洗脱速度为6.5bv/h，洗脱完成后收集洗脱液，进行真空浓缩，分离并回收洗脱剂，洗脱剂经调配后可继续使用，所得浸膏经真空冷冻干燥后，得杨树皮提取物成品9.0g，提取得率2.05％。实施例3以超声辅助提取法提取杨树皮中水溶性成分，将提取液离心除渣，浓缩，去除并回收有机溶剂，得杨树皮粗提液，所用提取剂为体积浓度为30％的乙醇溶液，超声功率1000kw，超声时间2h，提取温度25℃，提取次数2次。粗提液经浓缩除去有机溶剂，水相经冷冻干燥后的杨树皮粗提物，提取得率可达7.3％。将杨树皮粗提物用70％乙醇充分溶解，加入适量活性炭稍加热进行脱色，滤去活性炭，滤液上大孔树脂柱(或罐)进行充分吸附4～24h，然后开始水洗，至洗脱液检测不出糖开始用洗脱剂洗脱，所述洗脱剂为体积浓度为70％的乙醇，所述洗脱剂体积为12bv，洗脱速度为6bv/h，洗脱完成后收集洗脱液，进行真空浓缩，分离并回收洗脱剂，洗脱剂经调配后可继续使用，所得浸膏经真空冷冻干燥后，得杨树皮提取物成品，提取得率1.87％。实施例4以超声辅助提取法提取杨树皮中水溶性成分，杨树皮(不分外皮和内皮)原料23kg，置于通风阴凉处自然风干10天以上，粉碎过5目筛。加入500l提取罐，按照1:15料液比加入345l70％乙醇溶剂进行超声辅助提取可溶性成分，提取温度65℃，超声功率4800kw，提取时间2h，提取次数2次。提取料液经离心过滤分离得约300l滤液，滤液经减压浓缩至无醇，回收酒精，水相进行真空干燥得到杨树皮提取物2680g，收率11.7％，收料封装。取杨树皮粗提物20.0g用100ml70％乙醇充分溶解，加入2g活性炭稍加热进行脱色，滤去活性炭，滤液上d101大孔树脂柱进行充分吸附12h，然后开始水洗，至洗脱液检测不出糖开始用洗脱剂洗脱，所述洗脱剂为体积浓度为70％的乙醇，所述洗脱剂体积为10bv，洗脱速度为6bv/h，洗脱完成后收集洗脱液，进行真空浓缩，分离并回收洗脱剂，洗脱剂经调配后可继续使用，所得浸膏经真空冷冻干燥后，得杨树皮提取物成品1.8g，提取得率1.05％。实施例5以超声辅助提取法提取杨树皮中水溶性成分。阴干的杨树皮(不分外皮和内皮)原料粉碎过5目筛，加入提取罐，按照1:15料液比加入70％乙醇溶剂进行超声辅助提取可溶性成分，提取温度65℃，超声功率4800kw，提取时间2h，提取次数2次。提取料液经离心过滤分离，滤液经减压浓缩除去有机溶剂，回收酒精，水相进行真空干燥得到杨树皮提取物，收率12.0％，收料封装。取杨树皮粗提物20.0g用100ml70％乙醇充分溶解后上d101大孔树脂柱进行充分吸附12h，然后开始水洗，至洗脱液检测不出糖开始用体积百分比浓度为70％的乙醇洗脱剂洗脱，洗脱剂体积为10bv，洗脱速度为6bv/h，洗脱完成后收集洗脱液，进行真空浓缩，分离并回收洗脱剂，洗脱剂经调配后可继续使用，所得浸膏经真空冷冻干燥后，得杨树皮提取物成品2.6g，提取得率1.52％。利用高效液相色谱技术对提取物成分进行了分析(色谱图见图1)，由色谱图可以看出除了含有目标成分芦丁和金丝桃苷外，还含有大量的杂质峰。因此，本发明所述的一种可以促进益生菌生长的杨树皮提取物及其制备方法，其中活性炭脱色是得到目标成分的关键步骤。实施例61.杨树皮提取物中总黄酮含量测定：1.1标准曲线制作精密称取干燥的芦丁标准品25mg置于100ml容量瓶中，加适量80％(体积分数，下同)乙醇使之溶解，再加50％乙醇至刻度摇匀，得对照品溶液。精密量取上述对照品溶液1、2、3、4、5ml分别置于10ml容量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀；精密量取各浓度梯度溶液2ml，置于10ml容量瓶中，加5％亚硝酸钠0.3ml，摇匀，放置6min后，加10％硝酸铝0.3ml，摇匀，放置6min。再加入lmol/l的氢氧化钠4ml，50％乙醇加至刻度，摇匀，以50％乙醇为空白，在510nm处测定吸光度a，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。1.2总黄酮含量测定分别称取一定质量的杨树皮粗提物及利用不同型号大孔树脂纯化得到的提取物，用70％乙醇配置成一定质量浓度的待测样品溶液。待测样品溶液按照标准曲线制备方法操作，相同条件下在510nm处测定吸光度。利用标准曲线方程计算出提取物中总黄酮含量。1.3结果利用标准曲线计算得到：粗提物中黄酮含量为54.24％，经d101大孔吸附树脂纯化得到的提取物中黄酮含量为716.3mg/g(以芦丁量计，下同)，经hp-20大孔吸附树脂纯化得到的提取物中黄酮含量为1151.1mg/g。经d101和hp-20大孔树脂纯化后杨树皮提取物中黄酮含量分别增加了32％和112％。实施例71.杨树皮提取物成分的高效液相色谱分析1.1测定条件色谱柱hypersil,c185(μ)，250mm×4.6mm；流动相为a-甲醇(含0.1％磷酸)，b-水(含0.1％磷酸)；洗脱条件：0-3min，10％a，3-25min，10％-40％a，25-50min，40％-80％a，50-55min，80％-90％a，55-80min，90％a。流速1ml/min；温度21℃；紫外检测波长280nm；试液浓度0.1mg/ml；进样量20μl。质谱条件：电喷雾(esi)正离子电离模式。干燥气(n2)温度325℃，雾化气(n2)压力48.23kpa，干燥气(n2)流量4.00l/min，电喷雾电压4kv，毛细管温度270℃，扫描范围m/z100-600，质谱分析结果借助仪器附带的brukerdataanalysis软件进行处理。1.2结果本发明方法获得的杨树皮提取物的高效液相色谱图见图3。经与标准品对照分析及esi质谱分析，确定其主要成分为芦丁和金丝桃苷。色谱峰1：准分子离子峰m/z为609.7[m-h]-，对m/z为609.7进行二级质谱扫描，出现m/z300.5特征峰，并含有m/z272.7、178.0、151.9特征碎片，可以认定这个是槲皮素离子，说明该化合物是以槲皮素为苷元的化合物。m/z307.9离子碎片为槲皮素上的二糖结构。对比分子量、苷元与糖苷的组成发现，此化合物与芦丁的裂解规律一致。最后通过芦丁对照品对比确定该化合物为芦丁。利用外标法测定了杨树皮提取物中芦丁的含量，为19.2％。色谱峰2：准分子离子峰m/z为462.5[m-h]-，对m/z462.5进行二级质谱扫描，出现m/z301.0特征峰，并含有m/z272.0、180.8、149.8特征碎片，可以判断是m/z301.0是槲皮素离子。m/z162.9离子碎片与六碳糖苷的分子量吻合。对比分子量、苷元与糖苷的分子量和组成发现，此化合物与金丝桃苷的裂解规律一致。最后通过金丝桃苷对照品对比确定改化合物为金丝桃苷。利用外标法测定了杨树皮提取物中金丝桃苷的含量，为13.9％。实施例81.杨树皮提取物对益生菌的促生长作用1.1材料长双歧杆菌atcc15707，嗜酸乳酸杆菌atcc4356，mrs培养基(广东环凯微生物有限公司)，厌氧培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司)；将本发明制备得到的杨树皮提取物配置为浓度为1.0mg/ml的母液。表1标准稀释梯度12345678浓度(μg/ml)100050025012562.531.2515.6257.8125稀释梯度202-12-22-32-42-52-62-7靶向菌种的工作液制备：将活化的长双歧杆菌atcc15707和嗜酸乳酸杆菌atcc4356接种到5mlmrs液体培养基里，37℃静置培养1d。取1ml菌液，用mrs液体培养基稀释至od600在0.5～0.6之间，确定稀释倍数。在将剩余菌液用mrs培养液稀释至确定的od值范围，得工作液。1.2方法1.2.1平板法抑菌圈平板制备：将mrs固体培养基(约5ml)融解并浇筑到一次性培养皿(直径10cm)，厚度3～4mm，静置冷却。浇筑后，在固体培养基凝固前，加入100μl工作液，涂布均匀。将每个平板一分为四区域，每个区域等距离制作3个平行点样孔(直径约2～3mm)。加药：每个浓度梯度做三个平行，每个孔加入5μl表1的药品的梯度稀释液。结果的判断：37℃培养1d后，观察各实验平板，能形成抑菌圈的标“+”，否则标“-”。1.2.2液体法每个1.5ml离心管中加入900μl液体mrs培养基，同时加入100μlod600在0.5～0.6的菌液，混匀备用。每个离心管中，加入20μl上述药品的梯度稀释液，每个浓度做三个平行。结果的判断：37℃培养1d后，测定每个离心管的菌液od600。1.3结果1.3.1平板抑菌圈结果通过平板抑菌实验，可以发现杨树皮提取物对于长双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌(结果见表2)都不具有抑菌效果。表2长双歧杆菌平板抑菌判断结果样品浓度(μg/ml)长双歧杆菌嗜酸乳酸杆菌1000--500--250--125--62.5--31.25--15.63--7.81--1.3.2液体生长调控通过图4可以看出，在实验所测各浓度下，杨树皮提取物对嗜酸乳酸杆菌生长均具有一定的促进作用，尤其是当药品浓度大于250μg/ml时，促进作用更加明显。对于长双歧杆菌，在低提取物浓度下并没有表现出明显的促生长作用，只有当提取物浓度大于150μg/ml时，提取物才对长双歧杆菌均具有促生长效果。当前第1页12