一种细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统的制备及应用的制作方法

本发明属于药物制剂领域，涉及一种细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统的制备及应用。
背景技术：
肥胖是由能量吸收和能量消耗不均衡而导致脂肪在体内过分累积引起的，它是代谢综合征、ii型糖尿病(t2dm)、心血管疾病以及癌症等慢性疾病的导火索，严重影响人类寿命。目前，除了节食和运动外，临床上用于减肥的治疗手段可分为两种，一种为手术治疗，如吸脂手术和胃旁路手术，另一种为药物治疗，如奥利司他，盐酸氯卡色林等。但两种治疗方法都有不同程度的副作用：手术治疗患者的顺应性差，而药物治疗，如奥利司他有严重的胃肠道反应，而盐酸氯卡色林则有心瓣膜受损、头晕、致畸等副作用。因此，研究开发更为安全有效的减肥药物仍是当务之急。罗格列酮(rosiglitazone，rosi)是1999年葛兰素史克公司开发的噻唑烷二酮类药物，此类药物是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pparγ)的外源性激动剂。pparγ是一种核激素受体，它在脂肪细胞分化、葡萄糖稳态和免疫调节方面都发挥着重要作用。激活脂肪组织中的pparγ受体，可提高血管内皮生长因子(vegf)和血管生成素样蛋白4的表达水平来促进血管生长，增加脂质代谢而达到减肥的效果。但是要想达到较好的减肥效果，需要采用较大的给药剂量(小鼠给药剂量为80mg/kg/每两天)，这不仅增加了药物成本，还给制剂制备造成一定困难。西地那非(sildenafil，sild)是特异性5型磷酸二酯酶(pde-5)抑制剂，它通过抑制pde-5，增加脂肪细胞中环鸟苷酸(cgmp)的含量，提高下游因子环腺苷酸反应元素结合蛋白(creb)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mapk)及解偶联蛋白1(ucp1)的表达，来促进白色脂肪组织褐化而达到减肥目的。所以，将西地那非与罗格列酮两种药物联合使用，可通过促脂肪组织血管生长、增加白色脂肪组织褐化两种作用机制达到协同治疗肥胖的目的，；联合用药可降低给药剂量，且有利于制剂的制备和成本的降低。基于可提高药物溶解性、减少副作用、延长血液循环时间、提高疗效等诸多优点，靶向纳米递药系统已广泛用于癌症等诸多疾病的治疗。脂蛋白是一类新型的内源性纳米药物载体，它分为低密度脂蛋白(ldl)、极低密度自蛋白(vldl)、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，hdl)和乳糜微粒(cm)四类。其中，高密度脂蛋白应用最为广泛，它作为药物载体具有安全性高、靶向性强、药物运载高效的优势。然而天然hdl需要从血液中提取获得，大规模的制备具有一定的难度。同时，生物安全性问题以及提取的代价过高也限制了天然hdl作为药物载体的发展潜力。于是，重组高密度脂蛋白(reconstitutedrhdl)这类合成类高密度脂蛋白逐渐进入研究人员视野。rhdl由载脂蛋白ai(apoai)与磷脂、胆固醇等在体外重组形成，在生化特性和功能上与内源性hdl类似，拥有天然hdl作为药物载体的多种优良特性，具有明显的“仿生”特征。rhdl具有高度的安全性、良好的运载性，可通过核心包埋方式荷载脂溶性药物，并可完全被生物降解而不引发免疫反应。因此，我们选择重组高密度脂蛋白作为内核药物载体。然而，研究发现外来纳米粒容易被机体免疫系统识别而清除，即使rhdl纳米粒也不能完全躲避清除。因此，可减少免疫系统识别的细胞膜生物伪装手段变得越来越受欢迎。众所周知，巨噬细胞是免疫细胞的一种，具有吞噬细胞残片、病原体，及激活淋巴球及其它免疫细胞的作用，具有炎症趋向性。而脂肪组织有慢性炎症反应，在脂肪组织中，肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素6(il-6)、白介素1β(il-1β)、趋化因配体2(ccl2)等炎性因子明显增多。虽然与感染、创伤等疾病相比，脂肪组织中的炎性反应温和且局限，但仍能够引起巨噬细胞等免疫细胞浸润。因此，利用巨噬细胞膜(macrophagemembrane，ma)包裹纳米粒运载药物治疗肥胖，不仅可以避免药物在血液中被免疫系统识别清除，还可以通过炎症趋向性增加药物在脂肪组织中的积累而提高疗效。虽然巨噬细胞膜具有一定的脂肪组织靶向性，但为了进一步提高其靶向能力，可采用p3肽(ckggrakdc)对巨噬细胞膜进行修饰。p3肽可作为配体特异性靶向于脂肪组织中的抗增殖蛋白受体，通过该受体介导的内吞机制将纳米粒递送至脂肪细胞内而实现药物的靶向递送。综上所述，本专利以重组高密度脂蛋白(rhdl)包埋抗肥胖药物形成载药内核、p3肽修饰的细胞膜组成仿生外壳，构建一种用于肥胖治疗的仿生靶向纳米粒，该纳米粒特征如下：(1)p3肽修饰的细胞膜仿生外壳具有良好的生物相容性和脂肪组织靶向性，能够降低免疫系统对纳米粒的调理、吞噬作用，延长药物在体内的循环时间，增加药物在脂肪组织的积累；(2)rhdl内核药物载体具有高度的安全性、良好的运载性，可通过核心包埋方式荷载脂溶性药物，并可完全被生物降解而不引发免疫反应；(3)所采用的抗肥胖药物可刺激脂肪组织血管生长、增加白色脂肪组织褐化，机制协同治疗肥胖。技术实现要素：基于以上分析，本专利以脂蛋白中的重组高密度脂蛋白(rhdl)包埋抗肥胖药物形成载药内核、p3肽修饰的细胞膜组成仿生外壳，构建一种用于肥胖治疗的仿生靶向纳米粒，该仿生靶向纳米粒具有良好的运载性、生物相容性和脂肪组织靶向性，能完全生物降解，且能够降低免疫系统对纳米粒的调理、吞噬作用，延长药物在体内的循环时间，同时可刺激脂肪组织血管生长、增加白色脂肪组织褐化，机制协同治疗肥胖。为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：一种细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统，包括药物、内核药物载体、细胞膜伪装外壳和靶向材料，所述药物为罗格列酮和西地那非，所述内核药物载体为重组高密度脂蛋白，其通过物理包埋方式将罗格列酮和西地那非包裹于其疏水性核心中形成载药内核；所述细胞膜伪装外壳为巨噬细胞膜，其利用物理挤出包裹在重组高密度脂蛋白载药内核表面形成仿生载药纳米粒；所述靶向材料为p3肽(ckggrakdc)，所述p3肽修饰在仿生载药纳米粒表面形成细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统。进一步地，所述重组高密度脂蛋白由磷脂、胆固醇、载脂蛋白制备而成。所述磷脂为卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、磷酯酰丝氨酸或磷脂酸中的一种及一种以上；所述载脂蛋白为apoa-i。进一步地，所述p3肽是氨基酸序列为ckggrakdc的九肽，其与硬脂酸(sa)通过酯键连接形成偶联物，记为p3-硬脂酸偶联物。为达到上述目的，本专利通过以下制剂技术来实现：(1)重组高密度脂蛋白载药内核(rhdl/rosi&sild)的制备将一定量的磷脂、胆固醇、罗格列酮和西地那非混合溶解在有机溶剂中，37℃水浴下减压旋蒸得一层薄膜，然后真空干燥过夜以除去多余的有机溶剂，之后加入适量的纯水在40℃水浴中水化至完全，超声分散得含乳光的纳米混悬液；加入一定量的apoa-i的磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)搅拌过夜，去离子水透析12h，去除游离的apoa-i，得到重组高密度脂蛋白载药内核。(2)巨噬细胞膜(ma)的提取将巨噬细胞培养瓶中的培养基倒掉，pbs溶液(ph7.4)洗涤3次后将巨噬细胞吹打下来，1000rpm离心去上清液。在沉淀中加入细胞裂解液(1mm碳酸氢钠，0.2mm乙二胺四乙酸和1mm丝氨酸蛋白酶抑制剂)，4℃裂解过夜，然后探头超声10min，3200×g离心5～10min，弃沉淀，将上清液在4℃18000×g条件下离心45～60min，弃掉上清液，将沉淀重悬于pbs溶液(ph7.4)中得巨噬细胞膜混悬液。(3)细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒(ma/rhdl/rosi&sild)的制备将重组高密度脂蛋白载药内核与巨噬细胞膜混悬液按一定比例混合，然后用物理挤出的方式分别过800nm、400nm和200nm聚碳酸酯膜进行挤出，每种大小的膜来回挤出4～9次后，将得到的液体于6000×g条件下离心2min，除去多余游离膜，得细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒。(4)p3肽修饰的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒(p3-ma/rhdl/rosi&sild)的制备将p3肽-硬脂酸偶联物的pbs溶液(ph7.4)与细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒混悬液按一定比例混合，37℃孵育60min后，用去离子水透析12h，除去游离的肽，得p3肽修饰的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒。进一步地，步骤(1)中所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇中的任意一种或一种以上。磷脂与胆固醇的质量比为8∶1～4∶1，罗格列酮与西地那非的质量比为4∶1～1∶4，磷脂与两药质量之和的比例为20∶1～7∶1，磷脂与apoa-i的质量比为100∶1～10∶1；步骤(3)中重组高密度脂蛋白载药内核与巨噬细胞膜的体积比为1∶1～1∶4；步骤(4)中p3肽-硬脂酸偶联物与细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒的质量比为1∶20～1∶100。进一步地，步骤(1)中的超声频率为200w，工作1s，间歇2s，探头超声总时长为10min；步骤(2)中的超声频率为400w，工作2s，间歇2s，探头超声总时长为10min。发明原理：本发明提供的细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统经静脉注射进入血液，在巨噬细胞膜的保护下，减少体内免疫系统识别清除，有效延长其体内循环时间；巨噬细胞膜的炎症趋向性与p3肽的脂肪组织靶向性有利于该递药系统在脂肪组织的定向累积，从而减少其对其它正常组织的毒副作用；rhdl内核药物载体具有高度的安全性、良好的运载性，可通过核心包埋方式荷载脂溶性药物，并可完全被生物降解而不引发免疫反应；罗格列酮与西地那非可刺激脂肪组织血管生长、增加白色脂肪组织褐化，机制协同治疗肥胖。有益效果：与现有技术相比，本发明有如下优势：(1)本发明采用的抗肥胖药物为西地那非和罗格列酮，两种药物都是fda批准的药物，安全性良好。而且罗格列酮可刺激脂肪组织血管生长，西地那非增加白色脂肪组织褐化，两者可机制协同治疗肥胖。然而两种药物均为疏水性药物，临床使用受限，将其包埋在重组高密度脂蛋白中能增加其水溶性，提高其生物利用度。(2)本发明中的细胞膜伪装外壳为巨噬细胞膜，其利用物理挤出包裹在重组高密度脂蛋白载药内核表面形成仿生载药纳米粒。由于巨噬细胞为内源性免疫细胞，且巨噬细胞具有天然的慢性炎症趋向性。因此，巨噬细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统不仅可以通过减少体内吞噬而延长药物的体内循环，还可以利用炎症趋向性增加纳米粒在脂肪组织的积累，增加治疗效果。(3)本发明将p3肽修饰于细胞膜上，可通过靶向于脂肪组织血管内皮细胞的抗增殖蛋白受体进一步增加细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统在脂肪组织中的定向累积，减少其对其它正常组织的毒副作用。附图说明图1为本发明的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒(ma/rhdl/rosi&sild)的流式荧光标记图。其中，左上图为荧光未标记的ma/rhdl/rosi&sild荧光标记图，右上图为双荧光标记的ma/rhdl/rosi&sild荧光标记图(dii染料标记巨噬细胞膜，香豆素(coumarin)标记重组高密度脂蛋白)，左下图为香豆素的荧光强度，右下图为dii染料的荧光强度。图2为本发明的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(sds-page)。其中，从左到右分别为marker、巨噬细胞膜(ma)、ma/rhdl/rosi&sild和重组高密度脂蛋白载药内核(rhdl/rosi&sild)的蛋白组分。图3为本发明的细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统的粒径与电位图。其中，上半部分从左到右分别为rhdl/rosi&sild、ma、p3肽修饰的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒(p3-ma/rhdl/rosi&sild)的粒径图；下半部分从左到右分别为rhdl/rosi&sild、ma、p3-ma/rhdl/rosi&sild的电位图。图4为本发明的细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统的透射电镜图(tem)。其中，a图为rhdl/rosi&sild纳米粒的电镜图，b图为p3-ma/rhdl/rosi&sild的电镜图。图5为本发明的细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统在肥胖小鼠脂肪组织中的靶向分布图。其中，从左到右依次为游离药物组(free)、rhdl/rosi&sild组、ma/rhdl/rosi&sild组和p3-ma/rhdl/rosi&sild组在6h、12h、24h和48h时在小鼠脂肪组织中的荧光分布图。图6为本发明的细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统在给药后的体重变化图。其中，为生理盐水组(normalsaline)、free组、rhdl/rosi&sild组、ma/rhdl/rosi&sild组、p3-ma/rhdl/rosi&sild组、空白载体组(p3-ma/rhdl)、罗格列酮单载药组(p3-ma/rhdl/rosi)和西地那非单载药组(p3-ma/rhdl/sild)在给药后28天内的体重变化曲线图。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。一、细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统的制备工艺实施例1-61、重组高密度脂蛋白载药内核(rhdl/rosi&sild)的制备称取一定量磷脂、胆固醇、罗格列酮和西地那非混合溶解在有机溶剂中，37℃水浴下减压旋蒸得一层薄膜，然后真空干燥过夜以除去多余的有机溶剂，之后加入适量的纯水在40℃水浴中水化至完全，超声分散得含乳光的纳米混悬液；加入一定量的apoa-i的磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)搅拌过夜，去离子水透析12h，去除游离的apoa-i，得到重组高密度脂蛋白载药内核。将香豆素与双药共同加入，重复上述步骤得荧光标记的rhdl/rosi&sild。其中实施例1-6中重组高密度脂蛋白载药内核的制备工艺条件如表1所示：表1重组高密度脂蛋白载药内核的制备工艺条件实施例7-102、巨噬细胞膜(ma)的提取将巨噬细胞培养瓶中的培养基倒掉，pbs溶液(ph7.4)洗涤3次后将巨噬细胞吹打下来，1000rpm离心去上清液。在沉淀中加入细胞裂解液(1mm碳酸氢钠，0.2mm乙二胺四乙酸和1mm丝氨酸蛋白酶抑制剂)，4℃裂解过夜，然后探头超声10min，3200×g离心5～10min，弃沉淀，将上清液在4℃18000×g条件下离心45～60min，弃掉上清液，将沉淀重悬于pbs溶液(ph7.4)中得巨噬细胞膜混悬液。将diipbs溶液加入制得的巨噬细胞膜混合液中孵育35min，去离子水透析12h得荧光标记的巨噬细胞膜混悬液。其中，实施例7-10中巨噬细胞膜的提取工艺条件如表2所示：表2巨噬细胞膜提取的工艺条件工艺条件实施例7实施例8实施例9实施例10细胞离心时间/min57107上清液离心时间/min45505560实施例7-103、细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒(ma/rhdl/rosi&sild)的制备将重组高密度脂蛋白载药内核与巨噬细胞膜混悬液按一定比例混合，然后用物理挤出的方式分别过800nm、400nm和200nm聚碳酸酯膜进行挤出，每种大小的膜来回挤出4～9次后，将得到的液体于6000×g条件下离心2min，除去多余游离膜，得细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒。其中，实施例11-15中细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒的制备工艺条件如表3所示：表3细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒制备的工艺条件实例16-194、p3肽修饰的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒(p3-ma/rhdl/rosi&sild)的制备将p3肽-硬脂酸偶联物的pbs溶液(ph7.4)与细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒混悬液按一定比例混合，37℃孵育60min后，用去离子水透析12h，除去游离的肽，得p3肽修饰的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒。。其中，实施例16-19中p3肽修饰的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒的制备工艺条件如表4所示：表4p3肽修饰的细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒制备的工艺条件二、细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统的性能表征1、细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒双荧光标记的表征用荧光标记的rhdl/rosi&sild和ma制备双荧光的ma/rhdl/rosi&sild。用荧光未标记的ma/rhdl/rosi&sild为空白组，流式进样发现荧光标记的ma/rhdl/rosi&sild两荧光均具有较高的荧光强度证明巨噬细胞膜包裹重组高密度脂蛋白载药内核成功，结果见附图1。2、细胞膜仿生重组高密度脂蛋白载药纳米粒聚丙烯酰胺凝胶电泳图(sds-page)的表征用sds-page检测rhdl/rosi&sild、ma和ma/rhdl/rosi&sild的蛋白成分。先将rhdl/rosi&sild、ma和ma/rhdl/rosi&sild用细胞裂解液裂解，用bca蛋白定量分析试剂盒进行蛋白浓度初测定。然后再根据凝胶电泳测定方法进行实验，最终可视化。结果显示，ma/rhdl/rosi&sild的蛋白成分与rhdl/rosi&sild及ma的蛋白成分相同，说明ma膜蛋白成功转移至ma/rhdl/rosi&sild纳米粒上，进一步证明巨噬细胞膜成功包裹重组高密度脂蛋白载药内核，因此，该制备方法能够保留巨噬细胞膜天然膜蛋白，为之后体内炎症趋向性实验奠定了实验基础，结果见附图2。3、细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统粒径及电位的表征用激光粒径仪测定rhdl/rosi&sild、ma和p3-ma/rhdl/rosi&sild的水合粒径和zeta电位。结果显示，p3-ma/rhdl/rosi&sild纳米粒的粒径在80nm左右，电位为-23mv，符合纳米粒子要求，有利于纳米粒向脂肪组织的渗透。同时，p3-ma/rhdl/rosi&sild纳米粒的粒径比rhdl/rosi&sild大10nm左右(与一般巨噬细胞膜厚度相仿)，而电位与巨噬细胞膜相似，也从侧面证明巨噬细胞膜成功包裹重组高密度脂蛋白载药内核，结果见附图3。4、细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统透射电镜的表征分别取适量rhdl/rosi&sild、p3-ma/rhdl/rosi&sild，滴加在铜片上，再滴加等量的磷钨酸染色3min拍电镜，结果见附图4，rhdl/rosi&sild、p3-ma/rhdl/rosi&sild均呈现圆形，且粒径与激光粒径仪测定粒径相似。另外，与rhdl/rosi&sild相比，p3-ma/rhdl/rosi&sild最外层有清晰的一层，证明巨噬细胞膜成功修饰了重组高密度脂蛋白载药内核。5、细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统对肥胖小鼠脂肪组织的靶向性评价用香豆素标记的细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统考察体内靶向性，具体制备过程同上。将标记有香豆素的游离组(free)、rhdl/rosi&sild组、ma/rhdl/rosi&sild组及p3-ma/rhdl/rosi&sild组经尾静脉注射注入小鼠体内，在给药后6h、12h、24h和48h处死小鼠，取出脂肪组织，用活体成像系统，检测其荧光强度。实验结果表明，p3-ma/rhdl/rosi&sild组的荧光强度最强，说明其脂肪组织靶向效果最好；ma/rhdl/rosi&sild组，荧光强度次之，其脂肪组织靶向性来源于巨噬细胞的炎症趋向性；rhdl/rosi&sild组又次之，其靶向性可能来源于纳米粒子的被动渗透；free组荧光强度最低。从时间看，p3-ma/rhdl/rosi&sild组与其它组别相比在脂肪组织的滞留时间最长，这更有利于药物在脂肪组织中发挥作用，达到更好的治疗效果，结果见附图5。6、细胞膜仿生脂蛋白靶向纳米递药系统对肥胖小鼠体重的影响将肥胖小鼠随机分为生理盐水组(normalsaline)、游离组(free)、rhdl/rosi&sild组、ma/rhdl/rosi&sild组、p3-ma/rhdl/rosi&sild组、罗格列酮单载药组(p3-ma/rhdl/rosi)、西地那非单载药组(p3-ma/rhdl/sild)及空白载体组(p3-ma/rhdl)。各组小鼠每两天尾静脉注射同等药量的不同制剂，注射28天，观察小鼠的体重变化。实验结果表明，与其它组别相比，p3-ma/rhdl/rosi&sild组的体重最轻，说明其肥胖治疗效果最好。且与p3-ma/rhdl/rosi组、p3-ma/rhdl/sild组这两个单药组相比，p3-ma/rhdl/rosi&sild组这个双药组药效更好，说明罗格列酮和西地那非两种药物具有协同治疗肥胖的作用。当前第1页12