一种有效改善和修复面部激素依赖性皮炎的多肽组合物的制作方法

本发明属于生物医学的多肽药物技术领域，提供了一种用于改善和修复面部激素依赖性皮炎的多肽组合物。

背景技术：

糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的一种甾体类物质，对体内糖、脂肪及蛋白质的生物合成和代谢起着重要的调节作用，特别是对糖的代谢作用较强，因此被称为糖皮质激素。在超过生理剂量的时候，糖皮质激素具有抗炎、抗过敏、抗休克、抑制非特异性免疫及退热等多种作用，因此在临床上被广泛应用。

在皮肤科，糖皮质激素主要被用于治疗皮炎、银屑病、湿疹、寻常性痤疮、脂溢性皮炎等，因其强大的抗炎和免疫抑制作用，起效迅速，可以显著改善皮肤红肿、瘙痒和皮损等症状，是临床上治疗皮肤相关疾病的常用药物之一。然而，正是因为糖皮质激素对很多疾病都有起效快，能够明显缓解症状等作用，其被滥用的现象广泛存在。使用糖皮质激素必须严格遵守医嘱，在医生指导下，根据具体病情选择合适的种类、剂量和确定使用周期。但部分患者在使用糖皮质激素时，片面追求效果，大量应用，或者在停药后病情复发，自行反复使用糖皮质激素，久而久之便产生了对激素的依赖性，特别是在面部脆弱的皮肤长期大量使用糖皮质激素，导致皮肤萎缩变薄、毛细血管扩张、水肿、干燥脱屑等，这便是面部激素依赖性皮炎，又叫激素脸。

除了临床滥用导致的面部激素依赖性皮炎，糖皮质激素被非法添加到化妆品里，长期使用形成依赖后，也会导致面部激素依赖性皮炎。当前我国美容化妆品行业发展迅速，产品良莠不齐。由于糖皮质激素能使血管迅速收缩，迅速消除红血丝，同时细胞活动能力急速降低，细胞免疫能力、皮脂的分泌也被抑制，将其添加到化妆品当中会产生立即白、立即美、立即嫩的功效。这种立竿见影的效果是其他的植物激素、植物提取物、植物活性肽、草本或药材提取物等都无法比拟的。很多不法商家为了追求产品快速起效，罔顾消费者利益，将糖皮质激素非法添加到化妆品当中，使得面部激素依赖性皮炎的发病率逐年上升，且该疾病顽固难愈，严重影响美观，对消费者的身心都造成了巨大的伤害。

对于病情严重的患者，可采用激素递减疗法，短期使用小剂量激素，以维持糖皮质激素水平，避免快速停用激素引起的反跳，还可口服抗过敏、消炎及抗光敏药物。此外，临床上根据患者情况不同，还有免疫抑制剂疗法、中西医结合疗法等，如果患者出现感染，还应结合抗生素治疗。

目前，西医西药对面部激素依赖性皮炎尚无理想疗法。他克莫司作为一种钙调磷酸酶抑制剂，通过抑制t细胞中所产生的钙离子依赖型信息传导路径，从而发挥免疫抑制作用，也会抑制白介素-2的生成，具有抗炎作用，在临床上可外用治疗面部激素依赖性皮炎。但外用他克莫司可能会加重皮肤烧灼感或者出现癌痒，而且为了避免增加他克莫司的全身性吸收，产生系统性的免疫抑制作用，只能短期使用。对于面部激素依赖性皮炎合并感染的患者，不能使用他克莫司，否则会加重感染。

近年来，中医采用内治法、外治法及内外治结合疗法治疗面部激素依赖性皮炎。在临床上，内治法在祛风止痒、清热解毒、凉血养血的基础上进行辨证治疗。外治法多以温和清凉为主，如应用各种天然的植物油，但缺乏明确的治疗原则及用药标准。总的来说，中草药的作用机理尚不明确，还需要进一步的深入研究。此外，中药的提取过程复杂，成本高，这进一步限制了其应用。

多肽作为一种具有多种生理调节功能的活性物质，在美容化妆品行业逐渐受到广泛的关注。现有专利(公开号：cn106176274a)公开了一种具有抗敏作用的多肽组合物，主要用于改善敏感性肌肤的常见问题，如神经性炎症、瘙痒、刺痛、脱屑等，亦可用于修复激素脸。然而，该专利的多肽组合物更侧重于抗炎舒敏的技术效果，组合物中包含较多的降低炎症反应的多肽，本发明人通过减少抗炎作用的多肽种类，增加具有促进胶原蛋白合成、修复皮肤屏障作用的多肽，经对比试验结果发现，本发明的技术方案能够更有针对性地改善和修复面部激素依赖性皮炎，通过多种不同作用靶点的多肽组合，表现出预料不到的技术效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种有效改善和修复面部激素依赖性皮炎的多肽组合物，比分别仅仅使用单一多肽具有更加明显的效果，通过组合物多肽产生的协同增效作用，有效改善和修复面部激素依赖性皮炎。

为实现上述目的，根据皮肤生理生化机制及面部激素依赖性皮炎存在的炎症反应、神经源高反应性和皮肤屏障破坏三大问题，本发明人形成了一套面部激素依赖性皮炎治疗及修复方案，包含减少炎症介质产生降低炎症反应的多肽及/或降低皮肤神经源反应提高皮肤耐受阈值的多肽，再添加可以修复表皮层及基底膜、补充胶原蛋白、层黏连蛋白的多肽及/或修复真皮层、密集补充胶原蛋白、弹性蛋白、粘多糖的多肽及/或能够修复皮肤屏障损伤的多肽。

其中，减少炎症介质产生降低炎症反应的多肽可以是一种或是多种选自以下多肽：棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-33、乙酰基四肽-40、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基六肽-49；

降低皮肤神经源反应提高皮肤耐受阈值的多肽可以是一种或是多种选自以下多肽，包括但不限于乙酰基四肽-15；

修复表皮层及基底膜，补充胶原蛋白、层黏连蛋白的多肽可以是一种或是多种选自以下多肽：六肽-9、三肽-1、棕榈酰四肽-7；

修复真皮层，密集补充胶原蛋白、弹性蛋白、粘多糖的多肽可以是一种或是多种选自以下多肽：棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5；

修复皮肤屏障损伤的多肽可以是一种或是多种选自以下多肽，包括但不限于三肽-1铜；

以上各多肽成分质量浓度为0.0001％-5％。

本发明所述多肽组合物进一步的优选方案可以是棕榈酰三肽-8和棕榈酰四肽-7组合，各多肽成分质量浓度为0.0001％-5％；

本发明所述多肽组合物进一步的优选方案可以是棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-15和棕榈酰四肽-7组合，各多肽成分质量浓度为0.0001％-5％；

本发明所述多肽组合物进一步的优选方案可以是棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-15、棕榈酰四肽-7和棕榈酰五肽-4组合，各多肽成分质量浓度为0.0001％-5％；

本发明所述多肽组合物进一步的优选方案可以是棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-15、棕榈酰四肽-7、棕榈酰五肽-4和三肽-1铜组合，各多肽成分质量浓度为0.0001％-5％；

本发明包括添加保湿剂，优选如甘油、芦荟胶、透明质酸等；多醇类防腐剂，优选辛甘醇；可以进一步添加维持皮肤油水平衡的脂类物质，优选神经酰胺3；或者包括抗菌类维持成分稳定的综合性试剂，优选1,2-己二醇；以上各组分的质量浓度为0.001％-5％(w/w)。

本发明包括ph调节剂，所述ph调节剂选自：三乙醇胺、碳酸氢钠、碳酸氢钾，优选三乙醇胺；组合物ph值范围为3.0～8.0，优选5.0-7.0。

本发明采用复合型多肽组合物主要是制备皮肤外用的护肤产品或医用产品，可以应用于皮肤抗炎抗过敏，缓解红肿、刺痛，修复皮肤损伤，重建皮肤屏障，有效改善和修复面部激素依赖性皮炎。

本发明的多肽组合物可以制成各种剂型，如开发产品剂型主要有精华液、粉剂(胶囊、冻干粉)、乳剂、霜剂、凝胶、面膜、敷料等；产品可以为抗面部激素依赖性皮炎面膜、抗面部激素依赖性皮炎面霜、医用敷料等。

本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：

本发明在临床试验上发现，一些抑制神经性炎症反应的多肽，如棕榈酰三肽-8，能有效抑制uvb诱导的促炎因子白细胞介素-8(il-8)的释放，可以抑制炎症级联反应的前期步骤，有效地预防和减缓由化学刺激引发的炎症及症状，也可以干扰肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的生成，阻止水肿和红血丝等神经性皮炎症状。一些降低皮肤神经源反应，提高皮肤耐受阈值的多肽，如乙酰基四肽-15，能减少人体产生的促炎介质降钙素基因相关肽(cgpr)的数量，降低神经对外界刺激的过度敏感。一些能够修复表皮层的多肽，如棕榈酰四肽-7，能帮助促进胶原蛋白生成，修复增厚表皮层。一些能够修复真皮层的多肽，如棕榈酰五肽-4，能够补充胶原蛋白、多糖类，修复受损肌肤，改善皮肤质量。一些能够修复皮肤屏障损伤的多肽，如三肽-1铜，可以促进胶原蛋白合成和干细胞的分化，修复皮肤屏障；促进伤疤外部大量胶原蛋白集聚物的降解，促进皮肤正常细胞外基质(ecm)生成，促进不同皮肤细胞的生长，还有抗炎、抗氧化的作用。本发明的试验数据显示，这些组合比单一多肽具有更有效的抗炎抗过敏作用，提高皮肤耐受阈值，修复皮肤屏障，更有效地改善面部激素依赖性皮炎的症状，表现出明显的协同作用。

附图说明

图1uvb诱导的不同给药组il-8释放量

图2不同给药组在使用前后皮肤耐受阈值的变化情况

图3各组志愿者治疗前后的客观评价分值情况

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对发明作详细的说明，但并不只限于以下的实施例。

实施例1

处方(1公斤精华液)

配制方法：

将配方量的透明质酸钠加入到水中，搅拌使混合均匀，然后加热到80～85℃，保温搅拌使其分散均匀。温度降到40℃以下，加入甘油、芦荟胶、棕榈酰三肽-8、棕榈酰四肽-7、神经酰胺3、辛甘醇和1，2-己二醇，搅拌均匀。用15％三乙醇胺调溶液的ph值至5.5左右。

实施例2

处方(1公斤精华液)

配制方法：

将配方量的透明质酸钠加入到水中，搅拌使混合均匀，然后加热到80～85℃，保温搅拌使其分散均匀。温度降到40℃以下，加入甘油、芦荟胶、棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-15、棕榈酰四肽-7、神经酰胺3、辛甘醇和1，2-己二醇，搅拌均匀。用15％三乙醇胺调溶液的ph值至5.5左右。

实施例3

处方(1公斤精华液)

配制方法：

将配方量的透明质酸钠加入到水中，搅拌使混合均匀，然后加热到80～85℃，保温搅拌使其分散均匀。温度降到40℃以下，加入甘油、芦荟胶、棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-15、棕榈酰四肽-7、棕榈酰五肽-4、神经酰胺3、辛甘醇和1，2-己二醇，搅拌均匀。用15％三乙醇胺调溶液的ph值至5.5左右。

实施例4

处方(1公斤精华液)

配制方法：

将配方量的透明质酸钠加入到水中，搅拌使混合均匀，然后加热到80～85℃，保温搅拌使其分散均匀。温度降到40℃以下，加入甘油、芦荟胶、棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-15、棕榈酰四肽-7、棕榈酰五肽-4、三肽-1铜、神经酰胺3、辛甘醇和1，2-己二醇，搅拌均匀。用15％三乙醇胺调溶液的ph值至5.5左右。

对比实施例1

处方(1公斤精华液)

配制方法：

将配方量的透明质酸钠加入到水中，搅拌使混合均匀，然后加热到80～85℃，保温搅拌使其分散均匀。温度降到40℃以下，加入甘油、芦荟胶、乙酰基四肽-15、棕榈酰三肽-8、乙酰基四肽-40、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基六肽-49、六肽-9、甘草查尔酮a、辛甘醇和1，2-己二醇，搅拌均匀。用15％三乙醇胺调溶液的ph值至5.5左右。

实施例5抗炎试验

5.1材料与仪器

nctc细胞(来自正常人类皮肤的角质形成细胞)，dmem培养基，胎牛血清，浓度10-11m的α-msh，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的精华液，全自动酶标仪，人白细胞介素-8(il-8)elisa(酶联免疫吸附测定)试剂盒

5.2试验方法

nctc细胞加入dmem培养基(含5％胎牛血清)，置于含5％co2，湿度为95％，恒温37℃的二氧化碳培养箱中培养，培养48h后更换培养液，待细胞长满培养瓶，取出弃去培养液，加入消化液约3ml，以覆满瓶底为限，约2-3分钟后，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，加入dmem培养基终止反应，并制备成单细胞悬液。

nctc细胞经uvb辐照(230mj/cm²)，在含有α-msh、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的精华液、单一多肽以及pbs的培养基中分别培养24h。用pbs(ph7.2-7.4)稀释细胞悬液。通过反复冻融，使细胞破坏并释放出细胞内成份。离心，仔细收集上清备用。

用il-8elisa试剂盒，按照说明书的操作步骤，加样、温育、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止反应后，用酶标仪在450nm波长下测定各孔光密度值(od值)，通过标准曲线计算样品中il-8的含量。

5.3测试结果

多肽组合物抑制uvb诱导的il-8释放的试验结果见下表1及图1：

表1uvb诱导的不同给药组il-8释放量

图1uvb诱导的不同给药组il-8释放量

由图表结果可知，多肽具有类似于α-msh的功效，能够减少由uvb照射所引起的炎症介质il-8的释放，从而抑制神经性炎症反应。相对于单一多肽组，各实施例中的多肽组合物抑制il-8释放的效果更优，而且试验数据表明，在保持活性多肽整体用量不变的前提下，经过各作用机制不同的多肽有机组合之后，随着实施例中活性多肽种类增加，各多肽组合物的效果逐渐增强，其中实施例4的多肽组合物抑制il-8释放的效果最佳，证明各多肽具有明显的协同作用。

实施例6对抗辣椒素引起的皮肤敏感度试验

对皮肤局部使用辣椒素，刺激皮肤的神经末梢，引起皮肤瘙痒、刺痛、火辣的不舒适感觉，然后通过检测皮肤的耐受阈值(以感觉到痛为依据)变化评估使用多肽组合物前后的效果。

选用30位健康志愿者，将志愿者随机分成6组，每组5人，其中一组作为空白对照，其余各组志愿者左手臂给予辣椒素处理，然后在涂抹辣椒素部位分别使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的多肽组合物以及乙酰基四肽-15(作为单一多肽对照组)。

检测使用多肽组合物以及乙酰基四肽-15之前和使用1天之后，皮肤耐受阈值的变化，结果如表2及图2所示。

表2不同给药组在使用前后皮肤耐受阈值的变化情况

图2不同给药组在使用前后皮肤耐受阈值的变化情况

从结果可知，多肽能够提高由辣椒素引起的皮肤瘙痒、刺痛、火辣不舒适感觉的耐受阈值。相对于单一多肽组，各实施例中的多肽组合物对辣椒素的耐受阈值更大，而且试验数据表明，在保持活性多肽整体用量不变的前提下，经过各作用机制不同的多肽有机组合之后，随着实施例中活性多肽种类增加，各多肽组合物的效果逐渐增强，其中实施例4的多肽组合物在检测前后对辣椒素的耐受阈值的变化值最大，提高皮肤耐受阈值的效果最佳，证明多肽组合物从皮肤不同靶点发挥作用，具有显著的协同作用。

实施例7促进胶原蛋白生成的试验

7.1动物试验

健康10周裸鼠，雄性，体重20g左右。

7.2试剂与仪器

皮肤羟脯氨酸测定试剂盒、实施例中各多肽组合物、各单个多肽溶液、分光光度计。

7.3试验方法

在裸鼠右侧耳背涂抹实施例各多肽组合物、各单个多肽溶液，每日早晚各一次涂抹，用药1g。左侧不用药作为对照组。在清洁、通风、干燥、室温22±2℃条件下，相同饲料喂养。用药30天后各取5只，处死，取其药物作用部位及对侧相应部位皮肤。

用天平称45mg(湿重)组织放入洁净试管中，加入羟脯氨酸测定试剂盒中水解液1ml，混匀。加盖沸水浴水解20min，每隔10min混匀一次，以便让水解更加充分。取出试管，冷却后往各管加入试剂盒的指示剂1滴，摇匀。再加入试剂盒中甲液1ml调ph，摇匀。然后采用加样器吸取调ph的乙液，逐滴加入各试管中，直至看到各管中的指示剂变成黄绿色。加入蒸馏水至10ml后混匀。取3ml的水解液加入20-30mg活性炭后混匀，3500rpm离心10min，取上清1ml。

取干净试管加入5μg/ml标准应用液1ml作为标准管。往各管中加入试剂1后混匀，静置10min，再加入试剂2，混匀静置5min，加入试剂3，混匀60℃水浴15min，冷却后3500rpm离心10min，取上清于550nm波长下测定吸光度值。

7.4结果测定与分析

羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特有氨基酸，常以羟脯氨酸的含量换算胶原蛋白的含量。采用分光光度法测定羟脯氨酸的含量，按胶原蛋白中14％的羟脯氨酸换算小鼠皮肤中的胶原蛋白含量，试验结果如表3所示。

表3多肽组合物对小鼠皮肤中胶原蛋白生成的影响

注：*表示多肽组合物组与空白组相比有统计学差异，p<0.05。**表示多肽组合物组与空白组相比差异显著，p<0.01。#表示多肽组合物组与棕榈酰四肽-7组相比有统计学差异，p<0.05。##表示多肽组合物组与棕榈酰四肽-7组相比差异显著，p<0.01。

由表中数据可知，多肽能够促进胶原蛋白的生成，多肽给药组与单个多肽给药组相比，其胶原蛋白含量的百分比明显增大，这说明多肽组合物组具有明显的协同作用，可以通过多肽的不同作用机制促进皮肤的胶原蛋白生成。

实施例8修复面部激素依赖性皮炎试验

8.1试验方法

选择100名身体健康的志愿者，年龄范围25-30岁，这些志愿者均因使用了含有激素的化妆品而导致皮肤屏障受损，脸上出现明显的红肿、发炎、发痒等现象，且久久不能治愈。

将这些志愿者随机分成5组，每天早晚洁脸后，分别使用实施例4的多肽组合物、他克莫司、乙酰基四肽-15、对比实施例1、安慰剂，连续使用4周，早晚各涂抹一次。在治疗前后详细记录患者的客观症状和治疗过程中出现的不良反应情况。

8.2疗效评价指标

分别从客观指标及疗效两方面来评价修复面部激素依赖性皮炎的效果。

客观评价指标如下：a、以红肿、干燥、脱屑等临床症状为评价标准，按照轻重程度进行评分，无上述症状、轻度、中度、重度分别评为0-3分；b、以皮损程度为评价标准，按照轻重程度进行评分，无皮损、轻度皮损、中度皮损、重度皮损分别评为0-3分。

疗效评价指标如下：患处皮损完全消失为治愈；皮损消退面积大于80％为显效；皮损消退面积在60％-80％之间为有效；皮损消退面积小于60％，其他表征无显著改善为无效。愈显率＝(治愈例数+显效例数)/每组志愿者总例数×100％。

8.3试验结果

在治疗过程中，他克莫司给药组有2例志愿者因发生了药物不良反应，皮肤红肿、刺痛等症状加重而中止了治疗。各组志愿者治疗前后的客观评价分值情况见表4及图3。

从图表中数据可知，各组自愿者在治疗后客观评价分值均有所下降，实施例4多肽组合物给药组及他克莫司给药组在治疗前后，下降程度更明显，而实施例4多肽组合物对人体安全无刺激，有望替代他克莫司，在临床上用于改善和修复面部激素依赖性皮炎。同时试验数据也表明，多肽组合物组明显优于单个多肽组，表现出显著的协同作用。

对比实施例1的多肽组合物对志愿者皮肤红肿及炎症症状改善较好，但在修复面部激素依赖性皮炎的皮损方面，其效果不如实施例4多肽组合物。实施例4多肽组合物在减少抗炎作用的多肽种类之后，仍能保持很好的消炎效果，其采用更少的多肽量，通过抗炎舒敏、提高皮肤耐受阈值、促进胶原蛋白合成、修复皮肤屏障等不同作用机制的多肽有机组合，实现了更优的改善和修复面部激素依赖性皮炎的技术效果。

表4各组志愿者治疗前后的客观评价分值情况

注：*表示给药组与安慰剂组相比有统计学差异，p<0.05。**表示给药组与安慰剂组相比差异显著，p<0.01。***表示给药组与安慰剂组相比差异极其显著，p<0.001。

图3各组志愿者治疗前后的客观评价分值情况

治疗4周后，比较各组的愈显率情况，安慰剂组愈显率为5％，他克莫司给药组愈显率为70％，乙酰基四肽-15给药组愈显率为40％，对比实施例1给药组愈显率为65％，实施例4多肽组合物给药组愈显率为80％。各组的疗效评价情况见表5。结果表明，相对于单一多肽组，在保持活性多肽整体用量不变的前提下，经过各作用机制不同的多肽有机组合之后，实施例4的多肽组合物能够更加有效地改善和修复面部激素依赖性皮炎，证明多肽组合物作用于不同的皮肤靶点，表现出显著的协同作用。

相对于对比实施例1的多肽组合物，使用实施例4多肽组合物治疗4周后，面部激素依赖性皮炎的愈显率更高，实施例4多肽组合物在减少抗炎作用多肽的种类及用量后，通过多种不同作用机制的多肽有机组合，出人意料地表现出更优的改善和修复面部激素依赖性皮炎的技术效果。

表5各组志愿者治疗4周后的疗效评价情况

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。