协同脉冲不可逆电穿孔装置的制作方法

本公开涉及医疗器械技术领域，具体而言，涉及一种能够输出协同脉冲的不可逆电穿孔装置。

背景技术：

针对癌症的治疗仪器有多种，近年来随着脉冲生物电学的不断发展，以电场脉冲技术为基础的肿瘤治疗仪器以其非热、微创的生物医学效应引起了生物电磁领域研究人员的广泛关注。

在电场脉冲技术的应用中，不可逆电穿孔技术是一种新型的应用方式。不可逆电穿孔是指通过对靶区细胞发送电场脉冲(典型脉冲参数为：场强1500-3000v/cm，脉冲宽度100μs，重复频率1hz，脉冲个数70-120，单极性方波电场脉冲)，使细胞内外的离子运动并聚集在外膜两侧，引起跨膜电位的急剧变化，细胞膜发生不可逆电穿孔，打破细胞内外平衡，最终引起细胞死亡。不可逆电穿孔技术因其在前期肿瘤消融研究中表现出快捷、可控、可视、微创、选择性、非热机理的优势和特色得以广泛应用。

但是，以不可逆电穿孔技术为基础的治疗仪器仅对尺寸小于3cm的实体肿瘤有效，随着肿瘤尺寸的增长，不可逆电穿孔有效性逐渐降低，对于较大尺寸的肿瘤，更是存在治疗效率较低的问题。如果盲目增加脉冲能量(如电压、脉冲宽度等)，虽可使细胞得到彻底消融，但是会引起热效应，对正常组织如血管也会产生不可逆的破坏；如果增加和优化电极数量，虽然也能够有效消融大尺寸肿瘤，但会增加治疗复杂性和医疗风险，甚至会增加治疗的侵入性。

因此，需要一种能够提供更好的肿瘤治疗效果的技术。

需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现要素：

本公开的目的在于提供一种协同脉冲不可逆电穿孔装置，用于至少在一定程度上克服由于相关技术的限制和缺陷而导致的对大尺寸肿瘤治疗效率低的问题。

根据本公开的一个方面，提供一种协同脉冲不可逆电穿孔装置，包括：

至少一对电极；

协同脉冲发生电路，耦接于所述电极，用于向所述电极输出包括第一脉冲与第二脉冲的协同脉冲，所述第一脉冲的幅值大于所述第二脉冲的幅值，所述第一脉冲的脉冲宽度小于所述第二脉冲的脉冲宽度。

在本公开的示例性实施例中，所述第一脉冲与第二脉冲的延迟时间在500ns—1000s之间。

在本公开的示例性实施例中，所述第一脉冲的脉冲宽度在50ns—10μs之间。

在本公开的示例性实施例中，所述第二脉冲的脉冲宽度在10μs—1000μs之间。

在本公开的示例性实施例中，所述第一脉冲的脉冲幅值在-10kv—+10kv之间。

在本公开的示例性实施例中，所述第二脉冲的脉冲幅值在-3kv—+3kv之间。

在本公开的示例性实施例中，所述第一脉冲与所述第二脉冲包括矩形脉冲、高斯脉冲或指数衰减脉冲。

在本公开的示例性实施例中，所述第一脉冲与所述第二脉冲包括单极性脉冲和双极性脉冲。

在本公开的示例性实施例中，所述第二脉冲包括对称脉冲和不对称脉冲。

在本公开的示例性实施例中，在所述协同脉冲中所述第一脉冲与第二脉冲顺序出现或交替出现。

在本公开的示例性实施例中，所述协同脉冲发生电路包括：

第一直流电压输入端，正极耦接于第一脉冲发生单元，用于接收第一电压；

第二直流电压输入端，正极耦接于第二脉冲发生单元，用于接收第二电压，所述第二电压小于所述第一电压；

所述第一脉冲发生单元耦接于第一控制信号输入端以及第一输出端，用于响应第一控制信号向所述第一输出端输出或停止输出所述第一电压，以形成幅值为所述第一电压的所述第一脉冲；

所述第二脉冲发生单元耦接于第二控制信号输入端以及所述第一输出端，用于响应第二控制信号向所述第一输出端输出或停止输出所述第二电压，以形成幅值为所述第二电压的所述第二脉冲；

第二输出端，耦接于所述第一直流电压输入端的负极、所述第二直流电压输入端的负极、所述第一脉冲发生单元以及所述第二脉冲发生单元，与所述第一输出端同时耦接于所述电极。

在本公开的示例性实施例中，所述第一脉冲发生单元包括：

第一电阻，第一端耦接于所述第一直流电压输入端的正极；

第一电感，第一端与所述第一电阻的第二端耦接于第一节点；

第一电容，耦接于所述第一节点和所述第二输出端；

第一开关元件，漏极耦接于所述第一电感的第二端，源极耦接于第一二极管的正极，栅极耦接于所述第一控制信号输入端；

所述第一二极管的负极耦接于所述第一输出端。

在本公开的示例性实施例中，所述第二脉冲发生单元包括：

第二电阻，第一端耦接于所述第二直流电压输入端的正极；

第二电感，第一端与所述第二电阻耦接于第二节点；

第二电容，耦接于所述第二节点和所述第二输出端；

第二开关元件，漏极耦接于所述第二电感的第二端，源极耦接于第二二极管的正极，栅极耦接于第二控制信号输入端，

所述第二二极管的负极耦接于所述第一输出端。

在本公开的示例性实施例中，所述第一电压在0-3kv之间，所述第二电压在0-3kv之间。

在本公开的示例性实施例中，所述第一电压在-10kv～+10kv之间，所述第二电压在-10kv～+10kv之间。

在本公开的示例性实施例中，所述第一控制信号和所述第二控制信号的导通时间在0.2～100μs之间，导通周期在0.1～10s之间。

根据上述任意一项所述的协同脉冲不可逆电穿孔装置，还包括：

控制模块，耦接于所述协同脉冲发生电路，用于输出所述第一控制信号与所述第二控制信号；

电源模块，耦接于所述控制模块与所述协同脉冲发生电路，用于根据所述控制模块输出的电源控制信号对所述协同脉冲发生电路输出所述第一电压与所述第二电压；

在本公开的示例性实施例中，还包括：

信号转换模块，耦接于所述控制模块、所述电源模块与所述协同脉冲发生电路，用于对所述第一控制信号、所述第二控制信号以及所述电源控制信号进行光/电转换或电/光转换。

在本公开的示例性实施例中，还包括：

脉冲测量模块，耦接于所述控制模块以及所述电极，用于接收并识别所述电极的电信号，并将识别结果发送至所述控制模块。

在本公开的示例性实施例中，还包括：

显示模块，耦接于所述控制模块，用于显示所述第一控制信号、所述第二控制信号、所述电源控制信号的参数以及所述第一脉冲和所述第二脉冲的形态；

输入模块，耦接于所述控制模块，用于传输对于所述第一控制信号、所述第二控制信号、所述电源控制信号的参数的设置指令。

在本公开的示例性实施例中，所述协同脉冲发生电路包括多电平箝位型电路、级联型全桥电路、marx结构电路、ltd结构电路、mmc结构电路或开关串并联结构电路。

本公开实施例提供的协同脉冲不可逆电穿孔装置，通过对电极发送包括高电平/窄脉宽的第一脉冲和低电平/宽脉宽的第二脉冲的协同脉冲，可以同时利用高电压/窄脉宽的脉冲对靶区细胞进行深度穿孔，利用低电压/宽脉宽的脉冲对穿孔区域进行消融，同时克服前者穿孔面积小、后者消融深度小的缺陷，在不增加脉冲能量的情况下既扩大了消融面积，提高了穿孔的不可恢复性，进而提高了对大体积肿瘤的治疗效率。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本公开示例性实施例中协同脉冲不可逆电穿孔装置的方框图。

图2a和图2b是本公开示例性实施例中协同脉冲不可逆电穿孔装置的输出波形示意图。

图3a和图3b是本公开示例性实施例中协同脉冲不可逆电穿孔装置的另一种输出波形示意图。

图4a是第二脉冲在第一脉冲之前的协同脉冲示意图。

图4b是第一脉冲在第二脉冲之前的协同脉冲示意图。

图4c是单极性高频第一脉冲位于第二脉冲之后的协同脉冲示意图。

图4d是双极性第一脉冲位于第二脉冲之后的协同脉冲示意图。

图4e是单极性第一脉冲和单极性第二脉冲同时出现的协同脉冲示意图。

图4f是双极性第一脉冲和双极性第二脉冲同时出现的协同脉冲示意图。

图4g是不同脉冲延迟时间的协同脉冲示意图。

图5a和图5b是第一脉冲和第二脉冲对应的效果施行的原理示意图。

图6a和图6b是第一脉冲和第二脉冲作用下细胞膜上微孔密度的空间分布示意图。

图7a和图7b是第一脉冲和第二脉冲作用下细胞膜上微孔尺寸的空间分布示意图。

图8是本公开示例性实施例中协同脉冲发生电路的方框图。

图9是本公开示例性实施例中协同脉冲发生电路的电路示意图。

图10是本公开一个示例性实施例中另一种协同脉冲不可逆电穿孔装置的方框图。

图11是图10所示实施例中协同脉冲不可逆电穿孔装置的示意图。

图12是使用协同脉冲不可逆电穿孔装置的一个应用场景示意图。

图13是本公开实施例中协同脉冲发生电路的输出波形的效果示意图。

图14是本公开实施例中验证协同脉冲发生电路的输出波形的效果的实验示意图。

图15是图14所示实验的效果示意图。

图16是组织h&e染色结果图。

具体实施方式

现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本公开将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施方式中。在下面的描述中，提供许多具体细节从而给出对本公开的实施方式的充分理解。然而，本领域技术人员将意识到，可以实践本公开的技术方案而省略特定细节中的一个或更多，或者可以采用其它的方法、组元、装置、步骤等。在其它情况下，不详细示出或描述公知技术方案以避免喧宾夺主而使得本公开的各方面变得模糊。

此外，附图仅为本公开的示意性图解，图中相同的附图标记表示相同或类似的部分，因而将省略对它们的重复描述。附图中所示的一些方框图是功能实体，不一定必须与物理或逻辑上独立的实体相对应。可以采用软件形式来实现这些功能实体，或在一个或多个硬件模块或集成电路中实现这些功能实体，或在不同网络和/或处理器装置和/或微控制器装置中实现这些功能实体。

下面结合附图对本公开示例实施方式进行详细说明。

图1是本公开实施例中协同脉冲不可逆电穿孔装置的示意图。

参考图1，协同脉冲不可逆电穿孔装置可以包括：

至少一对电极2；

协同脉冲发生电路1，耦接于电极2，用于向电极2输出包括第一脉冲与第二脉冲的协同脉冲，其中第一脉冲的幅值大于第二脉冲的幅值，第一脉冲的脉冲宽度小于第二脉冲的脉冲宽度。

在图1所示的协同脉冲不可逆电穿孔装置中，第一脉冲可以被称为高电压、窄脉冲，或者高电压/窄脉宽的脉冲；第二脉冲可以被称为低电压、宽脉冲，或者低电压/宽脉宽的脉冲。

在一些实施例中，电极2例如可以为电极针，该电极针可以直接接触肿瘤细胞，以输出协同脉冲，或者通过离体实行、体内实行等方式对靶区细胞施加协同脉冲。

图2a是本公开实施例中协同脉冲的一种形态。

参考图2a，在本公开的一种示例性实施例中，第一脉冲与第二脉冲交替出现，从而形成如图2a所示的脉冲。

图2b是本公开实施例中协同脉冲的另一种形态。

参考图2b，在本公开的一种示例性实施例中，第一脉冲与第二脉冲顺序出现，从而形成如图2b所示的脉冲。

本申请发明人在研究中发现，不同的脉冲参数引起的细胞电生理变化具有较大的差异，不同的脉冲宽度和电场强度引起的细胞电生理响应也不相同。传统的不可逆电穿孔技术一般通过破坏细胞膜诱导细胞坏死，从肿瘤研究的机理出发，对细胞膜的破坏越大，细胞死亡的可能性就会越大，参考以下公式：

其中，e为所施加的脉冲场强，r为细胞膜的半径，θ表示场强方向与细胞膜径向的夹角，t表示脉冲宽度，c表示细胞膜电容，se表示细胞外液电导率，si表示细胞质电导率。

由公式(1)可知，场强越高，细胞膜上产生的穿孔区域就会越大。

为了不引起热效应，需要克制脉冲能量。因此如需使用较高的电场强度，就需要降低脉冲的脉冲宽度。如果将电场脉冲的脉冲宽度降低到百纳秒级，并将电场强度上升至数十kv/cm，或者采用双极性高电压窄微秒脉冲，使电场强度能够同时作用于细胞膜与细胞器膜，可诱导细胞程序性死亡，即凋亡。

这种高电压/窄脉宽的脉冲虽然能够在细胞膜上产生较深的穿孔，但由于脉冲宽度较窄，穿孔尺寸较小，极易恢复，难以出现穿孔不可逆的效果。而如需增加穿孔尺寸，需要增加脉冲宽度，此时在脉冲能量有限的情况下，脉冲的电场强度较小，脉冲对细胞膜的破坏也较小。

因此，为了克服上述脉冲的缺陷、保留上述脉冲的优势，本公开提供一种用于产生具有更高肿瘤治疗效率的协同脉冲的协同脉冲不可逆电穿孔装置。这种协同脉冲可以通过高电压/窄脉宽的脉冲在细胞膜上产生宽范围、高密度的穿孔，诱导细胞内膜穿孔；通过低电压/宽脉宽的脉冲扩大穿孔区域内微孔的尺寸致不可恢复，继而杀死肿瘤细胞或者消融靶向肿瘤组织。因此，本公开提出的协同脉冲不可逆电穿孔装置能有效增强不可逆电穿孔的治疗效果，对较大面积的靶区细胞进行不可逆电穿孔，应用于人体以及动物的生物组织消融。

图3a和图3b分别对应于图2a和图2b中脉冲形态的另一种方案。

参考图3a和图3b，在本公开的一种示例性实施例中，两种脉冲可以分别具有上升时间和下降时间，且上升时间和下降时间可以均为30ns。

在一些实施例中，第一脉冲和第二脉冲之间的间隔即脉冲延迟时间可以在20ns-50μs范围之间(如图4g)或500ns—1000s之间，第一脉冲的脉冲宽度可以是纳秒或微秒级，例如为50ns—10μs；第二脉冲的脉冲宽度可以是微秒级，例如为10μs—1000μs。

此外，第一脉冲的脉冲幅值可以为-10kv—+10kv，对应的，第二脉冲的脉冲幅值可以为-10kv—+10kv，或在-3kv—+3kv之间，即第一脉冲和第二脉冲均可以为单极性脉冲或双极性脉冲。

在一些实施例中，当第二脉冲时双极性脉冲时，既可以是对称脉冲(正负幅值相等)，也可以是不对称脉冲(正负幅值不等)。

在一些实施例中，第一脉冲和第二脉冲的形式可以包括矩形脉冲、高斯脉冲或指数衰减脉冲。

第一脉冲的宽度可以根据细胞膜的充电时间与细胞膜跨膜电压达到阈值所需要的时间确定，第二脉冲的宽度可以根据细胞膜上微孔所发展至不可恢复阶段所需要的时间确定，其中细胞膜的充电时间常数与微孔不可恢复阶段需要的时间可由建立数值模型和实验测定。

图4a-图4f是本公开实施例中一些协同脉冲形态的示意图。

图4a是第二脉冲在第一脉冲之前的协同脉冲示意图。

图4b是第一脉冲在第二脉冲之前的协同脉冲示意图。

图4c是单极性高频第一脉冲位于第二脉冲之后的协同脉冲示意图。

图4d是双极性第一脉冲位于第二脉冲之后的协同脉冲示意图。

图4e是单极性第一脉冲和单极性第二脉冲同时出现的协同脉冲示意图。

图4f是双极性第一脉冲和双极性第二脉冲同时出现的协同脉冲示意图。

图4g是不同脉冲延迟时间的协同脉冲示意图。

本领域技术人员还可以自行设置第一脉冲和第二脉冲的宽度、周期、上升时间等参数以调整协同脉冲的形态，本公开不以此为限。

图5a和图5b是第一脉冲和第二脉冲对应的效果施行的原理示意图。

图6a和图6b是第一脉冲和第二脉冲作用下细胞膜上微孔密度的空间分布示意图。

图7a和图7b是第一脉冲和第二脉冲作用下细胞膜上微孔尺寸的空间分布示意图。

参考图5a、图6a和图7a，第一脉冲作用在靶区组织时，可以同时诱导细胞膜与细胞器膜跨膜电位的上升，进而在细胞膜上产生了高密度的微孔，使部分细胞由于凋亡或坏死而被杀死或抑制。

参考图5b、图6b和图7b，第二脉冲作用在靶区组织时，可以在细胞膜上产生大尺寸微孔，使部分细胞由于坏死而被杀死或抑制。

因此第一脉冲和第二脉冲的组合能够有效增强不可逆电穿孔效果，继提高细胞杀伤效率，有效地提高肿瘤组织的消融区域。

图8示意性示出本公开示例性实施例中协同脉冲发生电路的方框图。

参考图8，协同脉冲发生电路1可以包括：

第一直流电压输入端vi1，正极耦接于第一脉冲发生单元11，用于接收第一电压v1；

第二直流电压输入端vi2，正极耦接于第二脉冲发生单元12，用于接收第二电压v2，第二电压v2小于第一电压v1；

第一脉冲发生单元11耦接于第一控制信号输入端s1以及第一输出端e1，用于响应第一控制信号s1向第一输出端e1输出或停止输出第一电压v1，以形成幅值为第一电压的脉冲；

第二脉冲发生单元12耦接于第二控制信号输入端s2以及第一输出端e1，用于响应第二控制信号s2向第一输出端e1输出或停止输出第二电压v2，以形成幅值为第二电压的脉冲；

第二输出端e2，耦接于第一直流电压输入端vi1、第二直流电压输入端vi2、第一脉冲发生单元11以及第二脉冲发生单元12，与第一输出端e1同时耦接于电极2。

在图8所示的实施例中，两个脉冲单元各自受控输出对应于v1和v2的不同脉宽的脉冲，并共用同一个输出端对电极输出协同脉冲。

在本公开的一种示例性实施例中，第一电压可以定义在0-3kv之间，第二电压可以定义在0-3kv之间，第一控制信号和第二控制信号的导通时间即脉冲宽度在0.2-100μs之间连续可调，第一控制信号和第二控制信号的导通周期即脉冲周期在0.1-10s之间可调。

图9是图8所示协同脉冲发生电路的一个实施例的电路图。

参考图9，第一脉冲发生单元11可以包括：

第一电阻r1，第一端耦接于第一直流电压输入端vi1的正极；

第一电感l1，第一端与第一电阻r1的第二端耦接于第一节点n1；

第一电容c1，耦接于第一节点n1和第二输出端e2；

第一开关元件m1，漏极耦接于第一电感l1的第二端，源极耦接于第一二极管d1的正极，栅极耦接于第一控制信号输入端s1；

第一二极管d1的负极耦接于第一输出端e1。

第二脉冲发生单元12可以包括：

第二电阻r2，第一端耦接于第二直流电压输入端vi2的正极；

第二电感l2，第一端与第二电阻r2耦接于第二节点n2；

第二电容c2，耦接于第二节点n2和第二输出端e2；

第二开关元件m2，漏极耦接于第二电感l2的第二端，源极耦接于第二二极管d2的正极，栅极耦接于第二控制信号输入端s2；

第二二极管d2的负极耦接于第一输出端e1。

在图9所示的电路中，第一直流电压输入端vi1和第二直流电压输入端vi2可以分别通过第一电阻r1和第二电阻r2对第一电容c1和第二电容c2充电，使c1和c2在充电完成后将能量释放到第一输出端e1，经过e1与e2之间的负载后，经由第二输出端e2返回两个直流电压输入端的负极，形成电流回路。电容c1和c2的电容值可以由总脉冲宽度、输出脉冲电压幅值、输出脉冲电压允许降落值、负载电阻值和放电时间常数决定。

设最大总脉冲宽度为τ，输出脉冲电压幅值为v0，输出脉冲电压允许降落值为△vd，负载电阻值为rl，则电容c1和电容c2的最小电容量根据以下公式进行计算：

通过调整电容容值，可以使每个脉冲串放电结束后，电容c1和c2的电压最多降低5％。

此外，电容c1和c2的耐压值可以由脉冲的最大幅值即第一电压和第二电压确定。

在图8和图9所示的实施例中，第一直流电压输入端vi1和第二直流电压输入端vi2的正极和负极均可以通过两个输入端子耦接到外部的电源系统上，以接收第一电压v1和第二电压v2；第一输出端e1和第二输出端e2可以分别耦接两个输出端子(例如为一对电极针)，以配合输出包括高电压/窄脉宽、低电压/宽脉宽两种脉冲的协同脉冲。图9中位于e1和e2之间的电阻指代两个输出端耦接的外部负载，例如为肿瘤。

图9所示电路也可以用以下描述方式描述。

电场脉冲生成电路的输入端包括输入端子a1、输入端子a2、输入端子b1和输入端子b2。电场脉冲生成电路1的输出端包括输出端子e1和输出端子e2。电源系统1连接在输入端子a1和输入端子a2之间。输入端子a1依次串联充电电阻r1和电容c1后连接输入端子a2。图11所示的直流电压输出模块33按照设定的脉冲幅值通过充电电阻r1对储能电容c1进行充电。充电完成后储能电容c1将能量释放给负载。输入端子a1依次串联电阻r1和电感l1后与半导体开关mosfet/igbts1的d极串联。半导体开关mosfet/igbts1的s极串联二极管d1的正极。二极管d1的负极串联负载后与输入端子a2连接。二极管d1的负极串联负载后与输入端子b2连接。电源系统1连接在输入端子b1和输入端子b2之间。输入端子b1依次串联电阻r2和电容c2后与输入端子b2连接。进一步，直流电压输出模块33按照设定的脉冲幅值通过充电电阻r2对储能电容c2进行充电。充电完成后储能电容c2将能量释放给负载。输入端子b1依次串联电感l2和电阻r2后连接半导体开关mosfet/igbts2的d极。半导体开关mosfet/igbts2的s极串联二极管d2的正极。二极管d2的负极串联负载后与输入端子a2连接。二极管d2的负极串联负载后与输入端子b2连接。负载连接在输出端子e1和输出端子e2之间。进一步，电场脉冲生成电路1形成高电压和窄脉冲，再形成低电压和宽脉冲。高电压和窄脉冲、低电压和宽脉冲按顺序出现。通过电场脉冲生成电路1，可以形成新型电场脉冲施加方式，即在传统的低电压、宽脉冲的不可逆电穿孔参数前施加高电压、窄脉冲降低消除阈值场强的影响，从而进一步扩大肿瘤消融区域。也就是说，高电压、窄脉冲在组织上产生较大地穿孔区域，而随后的低电压、宽脉冲无阈值场强的限制，可以在已存在的穿孔区域内产生更大的消融区域。

在本公开的其他实施例中，协同脉冲发生电路还可以有其他实现方式，例如多电平箝位型、级联型全桥、marx结构、ltd结构、mmc结构或开关串并联结构等拓扑的脉冲发生电路，本领域技术人员可以自行设置，只要能够实现图1所示实施例的效果即可。

本发明的技术效果是毋庸置疑的，本发明装置能准确可靠地产生协同脉冲，其能诱导肿瘤细胞膜的跨膜电位大于穿孔阈值，使得细胞膜发生不可逆电穿孔，从而导致肿瘤细胞死亡，同时，采用的协同脉冲电场，能有效突破不可逆电穿孔中阈值场强的限制，实现目标肿瘤组织区域不可逆电穿孔剂量的有效电场范围扩大，解决不可逆电穿孔临床应用中的消融区域较小的问题。

同时，本发明提出的新型电场脉冲施加方式，即在传统的低电压、宽脉冲的不可逆电穿孔参数前施加高电压、窄脉冲降低消除阈值场强的影响，从而能够进一步扩大肿瘤消融区域，即高电压、窄脉冲在组织上产生较大地穿孔区域，而随后的低电压、宽脉冲无阈值场强的限制，在已存在的穿孔区域内产生更大的消融区域。

本发明能够通过施加高场强的电场脉冲作用于生物组织，诱导细胞膜出现不可逆电穿孔，从而导致细胞死亡，并且高强度脉冲作用下，细胞发生不可逆电穿孔，无需施加化疗药物能达到治疗的作用，避免了化疗药物带来的副作用。同时，本发明具有快捷(治疗施加脉冲时间仅为几十秒，全过程也仅需几分钟)、可控(治疗参数可通过三维建模电场计算获取，治疗范围精确、安全)、可视(治疗过程可在超声/ct/mri引导下完成，疗效可通过超声/ct/mri评估)、可选择性(不损伤消融区的胆管，血管及神经等)和非热机理(无热效应，可克服热疗法带来的‘热损伤’与‘热沉’)的优点。

图10协同脉冲不可逆电穿孔装置的另一种示意图。

参考图10，是在本公开的一种示例性实施例中，协同脉冲不可逆电穿孔装置还可以包括：

控制模块3，耦接于协同脉冲发生电路1，用于输出第一控制信号与第二控制信号；

电源模块4，耦接于控制模块3与协同脉冲发生电路1，用于根据控制模块输出的电源控制信号对协同脉冲发生电路输出第一电压与第二电压；

脉冲测量模块5，耦接于控制模块3以及协同脉冲发生电路1的第一输出端与第二输出端，用于接收并识别第一输出端与第二输出端的输出信号，并将识别结果发送至控制模块3。

信号转换模块6，耦接于控制模块3、电源模块4与协同脉冲发生电路1，用于对第一控制信号、第二控制信号以及电源控制信号进行光/电转换或电/光转换。

显示装置7，耦接于控制模块3，用于显示第一控制信号、第二控制信号、电源控制信号的参数以及控制模块3根据脉冲测量模块5输出的识别结果生成的协同脉冲的波形；

输入装置8，耦接于控制模块3，用于传输对于第一控制信号、第二控制信号、电源控制信号的参数的设置指令。

其中，显示装置7例如可以为显示屏，用于实时监测控制模块3接收到的电压信号和电流信号；输入装置8例如可以为键盘、触摸屏等，本公开对此不作特殊限定。

在图10所示实施例中，控制模块3的控制参数可以由操作人员手工设置，也可以由控制模块中的处理器根据预设软件程序和预设输入信号自动设置。

电源模块4的输入电压例如可以为220v，输出电压受控于控制模块3，分为第一电压v1和第二电压v2。

在一个实施例中，控制模块3的控制参数也可以根据电极针间距和靶区细胞参数来确定。例如，可以根据电极针间距确定第一电压和第二电压的电压值范围(推荐参数是第一电压大于3kv/cm，第二电压大于500kv/cm)，并根据靶区组织类型、肿瘤尺寸、组织活检参数等细胞参数来确定第一电压和第二电压的具体电压值，并接受协同脉冲不可逆电穿孔装置的操作人员的手动调整。此外，还可以根据上述靶区细胞参数来确定第一控制信号和第二控制信号的发生模式，即第一电压对应的第一脉冲和第二电压对应的第二脉冲的出现模型，以起到更好的组织细胞消融效果。

图11是图10中协同脉冲不可逆电穿孔装置的一个实施例。

参考图11，电源模块4可以包括交流电源输入端41、电源滤波装置42、直流电压输出模块43以及开关电源模块44，用于向协同脉冲发生电路1、控制模块3、脉冲测量模块5和信号转换模块6供电。

其中，交流电源输入端41可以耦接220v交流电。

开关电源模块44用于将220v交流电转换成12v直流电。

电源滤波装置42的接地端直接接地，用于对开关电源模块44的输出直流电进行过滤，得到一个具有特定频率的电源信号并提供给直流电压输出模块13。电源滤波装置42可以是一种无源双向网络，其输入端、输出端与电源和负载的阻抗适配越大，对信号的过滤就越有效。

直流电压输出模块43受控于控制模块3，耦接于电源滤波装置42，用于向协同脉冲发生电路1的两个直流电压输入端输入第一电压v1和第二电压v2。

脉冲测量模块5可以包括分压器51、电流传感器52和处理电路53。分压器51用于测量协同脉冲发生电路1输出端的电压，电流传感器52用于测量协同脉冲发生电路1输出端的电流。处理电路53用于接收分压器51测量到的电压信号和电流传感器52测量到的电流信号。

控制模块3可以包括fpga模块31、开关控制模块32和单片机模块33。fpga模块31可以接收处理电路53输出端的电压信号和电流信号并对电压信号和电流信号进行运算处理。单片机模块33用于与fpga模块31进行数据交换，并通过开关控制模块32输出第一控制信号s1和第二控制信号s3。控制模块3中可以接收由操作人员手动设置或软件自动设置的脉冲特征参数并通过算法将脉冲特征参数转化为电信号。此外，控制模块3还可以对信号转换模块6中的电压信号和电流信号进行实时监测，以确保输出脉冲参数的准确性。

信号转换模块6可以包括光/电转换器k1、光/电转换器k2、电/光转换器j1、电/光转换器j2。电信号通过信号转换模块6分别传输到协同脉冲发生电路1、电源模块4和脉冲测量模块5中。电/光转换器j1可以将fpga模块31接受到的电信号转换为光信号，光/电转换器k1可以将电/光转换器j1的光信号转换为电信号，光/电转换器k1可以将转换后的电信号传递到电源模块4中。电/光转换器j2可以将fpga模块31接受到的电信号转换为光信号，光/电转换器k2可以将电/光转换器j2的光信号转换为电信号，光/电转换器k2可以将转换后电信号传递到协同脉冲发生电路1中。

在一些实施例中，协同脉冲不可逆电穿孔装置还可以包括pc机，用于提供显示装置和输入装置，由电源模块4向pc机供电。pc机可以用于实时监测控制模块接收到的电压信号和电流信号。

调节脉冲是通过调节电源模块4的输出电压以及高压、低压电路中的固态开关的导通时间、开断时间顺序和开断次数来完成的。

在一些实施例中，可以通过以下方式操作如图11所示的协同脉冲不可逆电穿孔装置：

1)对设备进行初始化。

2)确定电极的形式与施加方式以及协同脉冲的特征参数，以确保电场区域的有效覆盖。

3)设定脉冲宽度、脉冲间隔和脉冲个数。

4)根据患者的特点及其肿瘤组织的具体情况调节协同脉冲装置脉冲参数以及电极的施加方式。值得注意的是，对于体表型肿瘤组织采用夹板电极或吸附式电极；对于体内肿瘤采用针式电极，针式电极的插入位置由肿瘤组织的位置决定，针式电极的深度由肿瘤组织的尺寸决定，常用的施加脉冲的电极针组合为两针电极。

5)通过控制模块设置确定的协同脉冲特征参数，用户设定的脉冲宽度、脉冲间隔以及脉冲个数。

6)对协同脉冲不可逆电穿孔装置进行相应的开关动作从而控制输出的脉冲宽度、个数、脉冲间隔等。

7)将电极施加于患者的肿瘤组织，通过协同脉冲不可逆电穿孔装置产生患者所需的协同脉冲施加于电极上，对患者的肿瘤组织进行脉冲电场刺激，诱导其肿瘤组织发生不可逆电穿孔，从而有效杀伤肿瘤细胞。

8)在施加电极期间，用户通过控制模块对电压信号和电流信号进行实时监测，确保输出脉冲参数的准确性。

9)治疗结束后，用户从患者的肿瘤组织中撤走电极。

图12是使用协同脉冲不可逆电穿孔装置的一个应用场景示意图。

在一个应用场景中，可以配合示波器、温度传感器和电极杯一同使用本公开提供的协同脉冲不可逆电穿孔装置输出低电压、宽脉冲和高电压、窄脉冲来消融细胞与组织。

可以将电极针间距设置为5mm，并通过温度传感器的光纤探头监控电极针的温度并将温度转换成可用的输出信号显示到示波器上，以对热效应的产生起到警示作用。

可以将示波器的电流探头和电压探头耦接协同脉冲不可逆电穿孔装置的输出端，以使示波器将电流探头和电压探头探测到的电信号变换成随时间变化的波形曲线显示在屏幕上，供操作人员监控脉冲参数。

此外，还可以将电极杯的两端分别连接在协同脉冲不可逆电穿孔装置中协同脉冲发生电路的第一输出端和第二输出端，以接收协同脉冲不可逆电穿孔装置输出的脉冲信号，同时根据反馈电压电流信号监控输出脉冲对细胞的影响效果(电极杯用来盛放样本细胞)。

图13是本公开提供的协同脉冲发生电路的输出波形的效果示意图。

图13是以人卵巢癌细胞skov-3为实验对象，并采用正交实验和cck-8活性检测手段得出的治疗效果，该实验步骤如下：

1)首先准备改良型rpmi-1640培养基(hyaline公司)和相应的1640完全培养液，该培养液中含有10％的标准胎牛血清(上海依科赛生物制品有限公司)和1％的双抗(青霉素、链霉素)(genview公司)。并准备btx电极杯，其电极部分长10mm、宽4mm、高20mm。

2)让人卵巢癌细胞skov-3(由重庆医科大学所提供)贴壁生长，将改良型rpmi-1640培养基放置于t25细胞培养瓶(beaverbio)内。

3)将t25细胞培养瓶置于37℃、5％co²细胞培养箱(thermo)内。

4)在超净工作台(苏州净化设备有限公司)中用玻璃吸管吸出长满细胞的t25细胞培养瓶中的改良型rpmi-1640培养基。

5)在t25细胞培养瓶中加入1-2ml的pbs缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，pbs缓冲液对细胞进行浸润冲洗，再将细胞和pbs缓冲液吸出。

6)在t25细胞培养瓶中加入1ml的0.25％的胰蛋白酶，即称取0.25g胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)粉末和0.033gedta(国产分析纯)，再加入pbs缓冲液，直至在t25细胞培养瓶中配制出100ml胰蛋白酶液。

7)胰蛋白酶液对培养瓶内的细胞(skov-3)进行消化，并在大约1分钟后吸出胰酶。将胰酶加入培养基中，终止消化。

8)在培养基内加入5ml的1640完全培养基制备细胞悬液，从而将细胞稀释至5×105cells/ml。

9)实验时将脉冲信号加在电极杯上，每次实验在电极杯中加入100μl细胞悬液进行相应的电刺激。

10)分别对协同脉冲的不同参数进行研究，具体参数如表1。未处理的细胞悬液及空白组作为对照。每组实验重复三次。

表1：

在表1中，场强单位kv/cm是指场强的具体数值根据电极针间距来确定，电极针耦接第一输出端和第二输出端，用于协同输出上述协同脉冲。

11)实验结束后，通过cck-8法检测细胞的存活率，即在实验处理后的细胞加入96孔板中，放在孵箱中培养24小时进行cck-8测定。其中每组参数设置5个复孔。

12)移除培养基，并用pbs冲洗细胞，分别在96孔板的每个孔中加入20μl的cck-8(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)试剂。将无血清培养基摇匀，并在避光37℃条件下孵育2-4小时。

13)小心吸出培养基，分别在96孔板的每个孔中加入二甲基亚砜(dmso，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，并在避光摇床(北京市六一仪器厂沃德生物医学仪器分公司)中孵育20分钟。

14)在450nm波长的酶联免疫检测仪(bio-rad)上测定各组参数孔光的吸收值。记录结果并计算细胞的杀伤率。试验数据以均值±标准差(x±s)表示，并应用graphpadprism5软件进行分析，采用单因素方差分析比较检验。

通过本实验以及图13可以得出，单独施加高电压、窄脉冲时，细胞存活率为62.4％，单独施加低电压、宽脉宽时，细胞存活率为68.8％。

然而，施加协同脉冲(先施加高电压、窄脉冲，后施加低电压、宽脉冲)时，细胞存活率仅为19.0％。协同脉冲相对分别的施加时的高电压、窄脉冲与低电压、宽脉冲，细胞杀伤率都具有显著性差异，且存活率是高电压、窄脉冲的3.28倍，是低电压、宽脉冲的3.62倍。

此结果表明协同脉冲能够提高细胞的杀伤率。高电压、窄脉冲在细胞膜上产生较大地穿孔区域，而随后的低电压、宽脉冲没有阈值和场强的限制，因此协同脉冲能在已存在的细胞膜穿孔区域内产生大尺寸的微孔继而极大地破坏细胞膜，致使细胞极易死亡。

从图13中可以发现，如果先施加低电压、宽脉冲接着再施加高电压、窄脉冲的话其细胞存活率为56.1％，虽然相对高电压、窄脉冲与低电压、宽脉冲分别施加时细胞存活率略有下降，但是并无显著性差异。这表明脉冲的施加顺序不影响杀伤效果。

另一方面，高电压、窄脉冲与低电压宽脉冲的施加间隔时间也会影响癌细胞的存活率。当高电压、窄脉冲与低电压宽脉冲的施加间隔时间延长至100s时，协同脉冲对细胞的破坏程度更加严重，细胞存活率仅为7.9％，与间隔时间为1s的协同脉冲相比，具有显著性的差异，这表明提高间隔时间能够进一步提高细胞的抑制率。

因此，本领域技术人员可以参考本实验调整第一控制信号s1、第二控制信号s2的导通和关断时间来输出具有更好细胞杀伤效果的协同脉冲。

图14和图15是本公开另一个验证实验的过程图。

参考图14，该实验步骤如下：

1)准备8只新西兰大白兔(雌性，6月龄，体重2.5kg±0.2kg)，新西兰大白兔由重庆医科大学动物实验中心提供。并在清洁恒温动物饲养实验室对8只新西兰大白兔进行饲养。本例试验严格执行中华人民共和国《实验动物管理条例》中的相关规定。

2)脉冲处理前10分钟，采用3％的戊巴比妥钠溶液注射新西兰大白兔耳缘静脉(1ml/kg)进行麻醉。麻醉时长约60分钟以上，足够进行实验。实验通过外科手术开腹，实验时，兔子以躺姿的方式固定于手术台上，在其腹腔上半部分打开50mm的开口，以便于将电极针直接插入肝脏组织，实验场景如图14所示。

3)电极针采用spacer，固定其间距为5mm，用支架固定电极针位于图中腹腔正上方，对电极针分别施加不同参数的协同脉冲电场。具体施加的脉冲参数如表2所示。

表2：

4)脉冲处理结束后，采用医用缝合线缝合新西兰大白兔腹部伤口。并将缝合后的新西兰大白兔放在无菌动物实验房中饲养三天。

5)在动物实验房饲养3天后，同样采用3％的戊巴比妥钠溶液麻醉，对新西兰大白兔实行安乐死前实时监测兔的生命特征信号，安乐死后开腹取出兔肝脏组织。取样后将样品放置于10％的福尔马林溶液中浸泡24小时，然后嵌入石蜡中固定，并对其进行切割和h&e染色制作成组织切片。

6)采用aperiolv1数值病例切片扫描仪对切片进行扫描，从而获取组织切片的彩色扫描图像。

实验结果如图15所示，以高电压、窄脉冲参数20个、1600v、2μs脉冲和低电压、窄脉冲参数60个、360v、100μs脉冲为例，单独施加高电压、窄脉冲时，兔肝组织的消融面积是21.7mm²；单独施加低电压、宽脉宽时，兔肝组织的消融面积是23.8mm²。

然而，施加协同脉冲(先高电压、窄脉冲，后施加低电压、宽脉冲)时，兔肝组织的消融面积是50.7mm²。而且协同脉冲相对分别的施加时的高电压、窄脉冲与低电压、宽脉冲，消融面积都具有显著性差异。相对高电压、窄脉冲来说，组织消融面积提高了133.6％，而相对高电压、窄脉冲来说，组织消融面积提高了113.0％。

因此结果表明高电压、窄脉冲在生物组织上可以产生较大的穿孔区域并降低低电压、宽脉冲的阈值场强，因此能够进一步扩大肝脏组织消融区域。

另一方面，根据本实施例可以发现随着低电压、宽脉冲电压的升高，其消融面积越来越大，因此可以通过提高低电压、宽脉冲的电压(第二电压)来提高消融面积。当第二电压加到480v的时候，消融面积可以达86.0mm²，而低电压、宽脉冲单独施加的时候消融面积仅为59.8mm²；施加协同脉冲相对单独施加低电压、宽脉冲的消融面积提高了43.8％。

图16是h&e染色图。

参考图12，对肝脏组织h&e染色扫描后，能更加清晰精准的观察到肝脏组织消融区与正常组织边界。以协同脉冲(高电压、窄脉冲参数20个、1600v、2μs脉冲和低电压、窄脉冲参数60个、480v、100μs脉冲)为例，实际的肝脏组织中由于肝小叶、血管和胆管的组成，其结构的异质性导致了其电气参数的各向异性，因此实际的电场分布并非标准的哑铃型或者椭圆形，图12可以看出消融边界非常清晰，达到了μm级别的消融边界，而且胆管和血管附近的细胞也都被完全消融掉，并没有出现残留肝细胞。

综上，本公开实施例提供的协同脉冲不可逆电穿孔装置，通过对电极发送包括高电平/窄脉宽的第一脉冲和低电平/宽脉宽的第二脉冲的协同脉冲，可以通过电极对肿瘤细胞施加协同脉冲，以同时利用高电压/窄脉宽的脉冲对靶区细胞进行深度穿孔，再通过低电压/宽脉宽的脉冲对穿孔区域进行消融，同时克服而前者穿孔面积小、后者消融深度小的缺陷，在不增加脉冲能量的情况下既扩大了消融面积，提高了穿孔的不可恢复性，进而提高了对大体积肿瘤的治疗效率。

应当注意，尽管在上文详细描述中提及了用于动作执行的设备的若干模块或者单元，但是这种划分并非强制性的。实际上，根据本公开的实施方式，上文描述的两个或更多模块或者单元的特征和功能可以在一个模块或者单元中具体化。反之，上文描述的一个模块或者单元的特征和功能可以进一步划分为由多个模块或者单元来具体化。