本发明涉及植物有效部位的提取分离及应用技术领域，具体涉及汉桃叶有效部位及其制备方法。
背景技术
疼痛是临床常见症状，很多疾病的并发症都伴随疼痛，给患者带来很大的痛苦。目前临床上常用的止痛药是指可部分或完全缓解疼痛的药物，有非甾体抗炎药和中枢性止痛药两类。常见止痛药有阿司匹林、去痛片、扑热息痛、保泰松、罗非昔布等。但长期使用，胃肠道反应及肾毒性增加，不良反应大，不利于病人疾病的治疗及恢复，有的麻醉类的具有成瘾性，故不能长期应用。而传统中医药在治疗疼痛或并发症时具有显著改善临床症状与体征，如延胡索、三七等，具有不良反应少且轻等优势。汉桃叶在治疗坐骨神经痛、三叉神经痛等顽劣疼痛的特殊功效引起了人们越来越多的关注。
汉桃叶，是一味具有广西民族特色的中药材，收载于《广西中草药》，为五加科植物广西鹅掌柴schefllerakwangsiensismerr.exli的干燥带叶茎枝或茎枝。其性味微苦、涩，温，具有祛风止痛，舒筋活络等功效。主要用于治疗风湿关节痛，坐骨神经痛，三叉神经痛及肾、胆道疼痛等疾病。汉桃叶主产于广西，主要分布于广西的武鸣、扶绥等县。《广西民族药简编》中对汉桃叶的功效及常用方法有描述：根、茎水煎服，治风湿性心脏病，经前腹痛、感冒；水煎、冲酒服，治风湿腰痛；水煎服兼洗身，治水肿；捣烂敷患处，治骨折；捣烂敷伤口周围，治毒蛇咬伤。目前国内对汉桃叶的研究报道不多，刘娴等发表论文《汉桃叶抗炎镇痛作用有效部位的筛选》中，对汉桃叶的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位进行初步筛选，结果表明，乙酸乙酯部位具有较显著的镇痛抗炎效果，但未见有适用于规模化生产的进一步提取纯化方法及应用的报道。胡书平等对汉桃叶有机酸类成分研究及软膏剂开发，采用离子交换色谱法和现代分离技术确定总有机酸的最佳提取工艺，并进行药理研究，但提取方法复杂、生产成本高，不适用于工业化大生产。本发明进一步研究汉桃叶止疼痛的有效活性成分，通过优化提取纯化方法筛选出了更有效的止疼痛有效部位及适用于规模化生产的提取方法，目前，尚未见相关报道。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从汉桃叶中提取的具有止疼痛作用的有效部位及其制备方法和其在制备预防或治疗疼痛症状的保健品或药物方面的应用。
一种汉桃叶有效部位，该有效部位为汉桃叶药材经粉碎后，用5％的碳酸氢钠溶液浸润，再用30-40％乙醇加热回流提取，滤过，滤液在0-4℃冷库中静置24-48小时，滤过，滤液减压回收乙醇后得浸膏，加水，混匀，用酸调节溶液ph值为3-4，再用水饱和的正丁醇溶液萃取，萃取液减压回收正丁醇，得到的提取物即为汉桃叶有效部位。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，包括以下步骤：
s1.取汉桃叶药材，粉碎，用5％的碳酸氢钠溶液浸润，再用30-40％乙醇加热回流提取，滤过，得初滤液；
s2.将初滤液在0-4℃冷库中静置24-48小时，滤过，滤液减压回收乙醇后得浸膏；
s3.在浸膏中加入水，混匀，用酸调节溶液ph值为3-4；
s4.用水饱和的正丁醇溶液萃取，萃取液减压回收正丁醇，干燥，得到的提取物即为汉桃叶有效部位。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，所述步骤s1中粉碎汉桃叶药材优选粉碎成粗粉。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，所述步骤s1中5％的碳酸氢钠溶液的用量优选为药材重量的1-1.2倍量，浸润时间优选为20-30分钟。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，所述步骤s1中加热回流提取次数优选为2-3次。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，所述步骤s1中加入30-40％乙醇量优选为汉桃叶药材重量的6-8倍量。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，所述步骤s3中加水量优选为浸膏重量的4-6倍量。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，所述步骤s3中的酸优选为盐酸或硫酸。
以上所述的汉桃叶有效部位的制备方法，所述步骤s4中用水饱和的正丁醇溶液优选萃取2-3次。
以上所述的汉桃叶有效部位的应用，所述汉桃叶有效部位在制备预防或治疗疼痛症状的保健品或药物方面的应用，特别是风湿关节痛、坐骨神经痛、三叉神经痛及肾、胆道等疼痛。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过现代化提取分离方法，结合药理实验筛选，优选得到具有止疼痛作用显著的汉桃叶有效部位，该有效部位中反丁烯二酸的提取收率高达82％以上；体内和体外药效试验表明，均具有显著的镇痛、抗炎作用，且较文献报道的汉桃叶有效部位活性强、药效好。
2、本发明提供的具有止疼痛作用的汉桃叶有效部位可制备成药物或保健品，能方便临床应用。同时本发明提供的汉桃叶有效部位的制备方法，操作简单易行，提取的有效部位收率高，可操作性强，生产成本低，适合工业规模化大生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围。本发明实施例所用的汉桃叶药材，购买自玉林药材市场，批号为20171105，各实施例所用药材均为同一批次。
一、本发明汉桃叶有效部位的制备
实施例1
汉桃叶有效部位的制备方法，包括以下步骤：
s1.取汉桃叶药材5kg，粉碎成粗粉，用5％的碳酸氢钠溶液5kg浸润20分钟，再用6倍量30乙醇加热回流提取2次，每次1小时，滤过，得初滤液；
s2.将初滤液在0-4℃冷库中静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇后得浸膏；
s3.在浸膏中加入4倍量水，混匀，用盐酸溶液调节溶液ph值为3；
s4.用水饱和的正丁醇溶液萃取2次，萃取液减压回收正丁醇，干燥，得到的提取物即为汉桃叶有效部位。
实施例2
汉桃叶有效部位的制备方法，包括以下步骤：
s1.取汉桃叶药材5kg，粉碎成粗粉，用5％的碳酸氢钠溶液6kg浸润30分钟，再用8倍量40％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，滤过，得初滤液；
s2.将初滤液在0-4℃冷库中静置48小时，滤过，滤液减压回收乙醇后得浸膏；
s3.在浸膏中加入6倍量水，混匀，用硫酸溶液调节溶液ph值为4；
s4.用水饱和的正丁醇溶液萃取3次，萃取液减压回收正丁醇，干燥，得到的提取物即为汉桃叶有效部位。
实施例3
汉桃叶有效部位的制备方法，包括以下步骤：
s1.取汉桃叶药材5kg，粉碎成粗粉，用5％的碳酸氢钠溶液5.5kg浸润25分钟，再用7倍量35％乙醇加热回流提取2次，每次1.5小时，滤过，得初滤液；
s2.将初滤液在0-4℃冷库中静置32小时，滤过，滤液减压回收乙醇后得浸膏；
s3.在浸膏中加入5倍量水，混匀，用盐酸溶液调节溶液ph值为3.5；
s4.用水饱和的正丁醇溶液萃取3次，萃取液减压回收正丁醇，干燥，得到的提取物即为汉桃叶有效部位。
实施例4
汉桃叶有效部位的制备方法，包括以下步骤：
s1.取汉桃叶药材5kg，粉碎成粗粉，用5％的碳酸氢钠溶液4kg浸润20分钟，再用8倍量40％乙醇加热回流提取3次，每次1小时，滤过，得初滤液；
s2.将初滤液在0-4℃冷库中静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇后得浸膏；
s3.在浸膏中加入4倍量水，混匀，用硫酸溶液调节溶液ph值为4；
s4.用水饱和的正丁醇溶液萃取3次，萃取液减压回收正丁醇，干燥，得到的提取物即为汉桃叶有效部位。
二、对比文献汉桃叶抗炎镇痛作用有效部位的制备
对比实施例
取汉桃叶药材0.5kg，粉碎成粗粉，用75％乙醇加热回流3次，每次1小时，滤过，合并提取液，回收乙醇，真空干燥得干膏粉。用石油醚(60-90℃)加热回流提取3次，每次1小时，弃去石油醚提取液，取提取残渣，再用乙酸乙酯加热回流提取3次，每次1小时，滤过，合并提取液，滤过，滤液回收乙酸乙酯，干燥，得到抗炎镇痛作用有效部位对比实施例样品。
三、实施例样品含量测定
1.色谱条件
色谱柱为岛津vp-ods柱(250mmx4.6mm):流动相为甲醇-0.2％磷酸溶液(5:95)；流速为1.oml/min，柱温为室温；检测器为日本岛津spd-m10avp紫外检测器，检测波民为210nm。
2.溶液的配置
对照品溶液的制备：精密称取反丁烯二酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。
样品溶液的制备：取上述本实施例1-4、对比实施例样品各1g，精密称定，分别置100ml锥形瓶中，加50％乙醇溶液50ml，称定重量，水浴加热回流2h，放冷，加50％乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45μl微孔滤膜滤过，即得。
3.试验结果
取上述实施例1-4、对比实施例样品制备得到的样品溶液，以反丁烯二酸为含量测定的考核指标，测定结果见表1，并计算提取收率。
表1实施例样品含量测定结果表
上述试验结果表明，本发明实施例1-4样品中的反丁烯二酸含量均大于对比实施例组，提取收率高均为82％以上，较对比实施例组含量高30％以上，说明本发明经发明人优化筛选的提取方法，汉桃叶药材中有机酸类的提取较完全，提取效率高，有效活性成分的含量高。
四、体内药效学试验
1.材料
1.1实验试药
样品：分别取实施例3、对比实施例中制备所得的汉桃叶有效部位，临用前加水研磨配制成不同浓度的混悬液，作为供试品溶液；阳性对照：阿司匹林片，临用前配成溶液，备用。
试药：大鼠、小鼠、家兔维持饲料(武汉市万千佳兴生物科技有限公司)；95％食用级酒精为化学纯，其余试剂均为分析纯。
1.2实验仪器
电子天平(0.1g-1000g，浙江凯丰集团公司)；数显恒温水浴锅(hh-6，常州普天仪器制造有限公司)；离心机(5430r，eppendorf台式多功能冷冻离心机)；电热恒温箱(dnp-9052a，邢台润联科技开发有限公司)。
1.3实验动物
清洁级昆明种小鼠，体重19～21g；清洁级wistar大鼠，体重150-200g；普通级新西兰兔，体重2.0～2.5kg；动物雌雄兼用，根据不同试验要求选择动物性别。动物来源于广西医科大学。饲养条件：室温25±5℃，湿度60±20％。提供饲料，自由摄食、饮水。
2.实验方法
2.1镇痛试验
2.1.1热板法先将水浴箱里放空烧杯，水浴箱中加水量以烧杯不浮起偏倒为度，设定水浴箱温度为55℃，待温度升至55℃并稳定后，取100只体重为19～21g雌性小鼠置于空烧杯内，以小鼠舔后足反应的潜伏期(秒)为痛阈指标，选出反应潜伏期在5秒和30秒间的小鼠(跳跃的小鼠予以剔除)，测定并记录每只小鼠的痛觉反应潜伏期(作为药前痛阈值)。将合格小鼠随机分为空白对照组、阳性药对照组(阿司匹林片)，以及实施例3高剂量组、低剂量组，对比实施例高剂量组，每组12只。分组后开始灌胃给予相应的受试药物，每天1次，连续3天，末次给药后1小时后测定各组小鼠的痛觉反应潜伏期(大于60秒者以60秒计)，以药后与药前的痛阈值差值评价药物镇痛效果(如药后与药前的痛阈值差值为负值则以0计)。
2.2.2扭体法取小鼠60只，体重19～21g，随机分为空白对照组、阳性药对照组(阿司匹林片)，以及实施例3高剂量组、低剂量组，对比实施例组高剂量组，每组12只。分组后灌胃给予相应的受试药物，每天1次，连续3天，末次给药1小时后每只鼠分别ip0.6％醋酸溶液0.5ml，观察自注射醋酸溶液后15分钟内各每组每只小鼠出现扭体反应次数，评价药物镇痛效果。
2.2抗炎作用
2.2.1对角叉菜胶性大鼠足关节肿胀的影响
取50只大鼠，随机分为空白对照组、阳性药对照组(阿司匹林片)，以及实施例3高剂量组、低剂量组，对比实施例高剂量组，每组10只。动物分组后，按方法随大鼠开始灌胃给予相应受试药，每天1次，连续3天。第3天给药同时用游标卡尺测量每只大鼠右后肢足跖厚度(mm)，作为药前对照值。给药后30分钟每组每只大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜胶0.1ml/只致炎，致炎后2、4、6h再次测量每只大鼠右后肢足跖厚度(mm)，以致炎后右后肢足跖厚度－致炎前右后肢足跖厚度为肿胀度，计算肿胀率。
3.对家兔膝骨关节的影响
选用体重2.0～2.5kg新西兰兔30只，雌雄各半，按性别随机分为正常对照组、模型对照组，阳性对照组(阿司匹林片)、实施例3高剂量组、低剂量组、对比实施例高剂量组，每组6只。除正常对照组外，将其余各组家兔右膝关节腔内注射1.6％木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5ml，隔3天再注射一次，共注射2次。在造模同时，家兔按组灌胃给予相应药物，每天1次，连续4周。末次给药后第2天，处死家兔，取膝骨关节组织，先大体肉眼观察软骨，然后放入体积分数为10％的福尔马林溶液中浸泡，行苏木素－伊红(he)染色，光镜下观察有关的形态学变化，并进行病理学评分。
3实验结果
3.1镇痛作用
热板法试验结果表明，实施例3高剂量组具有明显的镇痛作用，较阳性对照组、对比实施例高剂量组能延长小鼠热板反应时间，与空白对照组比较均有统计学意义，见表2。扭体法试验结果表明，实施例3高剂量组具有明显的镇痛作用，能明显减少小鼠醋酸注射引起的扭体次数，与空白对照组比较均有统计学意义，见表3。
表2热板法的镇痛作用结果表
与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01
表3扭体法的镇痛作用结果表
与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01
3.2抗炎作用
试验结果表明，本发明实施例3高剂量组、低剂量组及对比实施例高剂量组对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀具有较明显的抗炎作用，见表4。
表4对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响结果表
与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01
3.2.1对家兔膝骨关节的影响
对家兔膝骨关节试验结果表明，本发明实施例3、5可减轻家兔膝关节骨性关节炎的病理学改变，可降低木瓜蛋白酶致家兔膝骨关节炎模型的关节软骨病理学评分分值，见表5。
表5对家兔关节软骨病理学评分的影响结果表
与正常对照组比较：▲▲p<0.01；与模型对照组比较：*p<0.05，**p<0.01
五、体外药效学试验
1.材料
1.1实验试药
样品：分别取实施例3、对比实施例组中制备所得的汉桃叶有效部位1g，临用前加软膏基质9g配置成软膏，作为供试品；阳性对照：扶他林软膏。
试药：大鼠、小鼠维持饲料(武汉市万千佳兴生物科技有限公司)；95％食用级酒精为化学纯，其余试剂均为分析纯。
1.2实验仪器
电子天平(0.1g-1000g，浙江凯丰集团公司)；数显恒温水浴锅(hh-6，常州普天仪器制造有限公司)；离心机(5430r，eppendorf台式多功能冷冻离心机)；电热恒温箱(dnp-9052a，邢台润联科技开发有限公司)。
1.3实验动物
清洁级昆明种小鼠，体重19～21g；清洁级wistar大鼠，体重150-200g；动物雌雄兼用，根据不同试验要求选择动物性别。动物来源于广西医科大学。饲养条件：室温25±5℃，湿度60±20％。提供饲料，自由摄食、饮水。
对醋酸致小鼠扭体反应次数的影响
取小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，即空白对照组、阳性对照组(扶他林软膏)及本发明实施例3、对比实施例组。分别于背部2处剃去1cm2的毛，24小时后将各组样品分别涂布于剃毛部位，涂布的厚度和面积应相等，并用绷带和胶布固定，每天1次。外用给药7天，第8天给药0.5h后，用0.6％醋酸生理盐水水溶液，按0.1ml/10g的用量腹腔注射。观察记录注射醋酸后15min内小鼠扭体反应次数。试验结果见表6，本发明实施例3、对醋酸致小鼠扭体反应次数有较强的抑制作用，说明本发明镇痛效果明显。
表6小鼠扭体反应测定结果
与空白对照组比较，*1p<0.05，*2p<0.01
2.2对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响
取雄性小鼠40只，随机分为4组，即空白对照组、阳性对照组(扶他林软膏)及本发明实施例3、对比实施例组。分别于背部2处剃去1cm2的毛，24小时后将各组样品分别涂布于剃毛部位，涂布的厚度和面积应相等，并用绷带和胶布固定，每天1次。外用给药7d，第8d给药0.5h后，每只小鼠右后足注射1％角叉菜胶20μl致炎，致炎后3h将小鼠脱颈椎处死，于膝关节处剪下两足(剪取后双足相同部位)，分别称左、右足质量，以左、右后足质量差作为肿胀度。试验结果见表7，结果表明：本发明实施例3组足肿胀度明显低于空白对照组，本发明对1％角叉菜胶致小鼠炎足肿胀有较强抑制作用，说明本发明有显著的抗炎作用。
表7对角叉菜胶致小鼠足趾炎症的影响
与空白对照组比较，*1p<0.05，*2p<0.01。