虎杖及虎杖苷在治疗代谢综合征中的应用的制作方法

本发明涉及虎杖及虎杖苷在治疗代谢综合征中的应用，所述药物能同时治疗高尿酸血症、高脂血症、高血糖、高同型半胱氨酸血症和肥胖症。

背景技术：

代谢综合征是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群。其具有以下特点：①多种代谢紊乱集于一身，包括肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、高脂肪肝发生率和高胰岛素血症，这些代谢紊乱是心、脑血管病变以及糖尿病的病理基础，由此可见糖尿病不是一个孤立的病，而是代谢综合征的组成部分；②目前多认为肥胖尤其是中心性肥胖造成胰岛素抵抗和高胰岛素血症；以及③可导致多种疾病，如高血压、冠心病、脑卒中、甚至某些癌症，包括与性激素有关的乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌，以及消化系统的胰腺癌、肝胆癌、结肠癌等。

虎杖是我国传统常用中药，为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖(polygonumcuspidatumsieb.etzucc)的干燥根茎和根，又名阴阳莲、紫金龙、苦杖、酸杖、斑杖、土大黄等。主要分布于我国长江以南各地和陕西、湖北及四川等地。具有利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰的功效(参见《中华人民共和国药典》2015年版)。《本草拾遗》记载虎杖“主风在骨节间及血瘀”；《医林纂要》记载虎杖“坚肾，强阳益精，壮筋骨，增气力”；以及《滇南本草》记载虎杖：“攻诸肿毒，止咽喉疼痛，利小便，走经络”。

虎杖中主要成分有蒽醌类、均二苯乙烯类、黄酮类、香豆素类以及一些脂肪酸类化合物等。

有关虎杖研究的相关试验表明：虎杖具有多种药理作用，主要包括对多器官功能障碍综合征的保护作用、对心血管系统的作用，抗菌、抗病毒，抗炎、抗过敏，抗氧化、抗休克，抗肿瘤，抗血栓、抗动脉粥样硬化及肾脏保护作用等。

现有技术中也有关于虎杖苷对糖代谢的影响的报道(《中药药理与临床》，2016；32(3))，作用机制是虎杖苷通过增加胰岛素受体底物(irs)的磷酸化，进而激活蛋白激酶b信号通路，akt激活后，磷酸化下游糖原合成酶激酶(gsk-3)，抑制其活性，促进糖原合成，同时增加肝糖原代谢的关键酶葡萄糖激酶(gck)的表达，降低糖质新生关键酶葡萄糖6磷酸酶(g6pase)的表达，进而使肝糖原合成增加，输出减少，保持血糖的正常。

现有技术中还有关于虎杖苷对脂质代谢影响的报道(《中药药理与临床》，2016；32(3))，显示虎杖苷对肝脂肪变性的保护作用可能与其降低肝脏tnf-α水平，肝脂质过氧化和srebp-1c介导的脂质生成作用有关。hao，j等研究同样证实了虎杖苷能明显降低糖尿病大鼠模型tc、tg和ldl-c的水平，并发现虎杖苷可能是通过akt信号通路调节一些脂肪生成基因，如srebp-1c、进而影响低密度脂蛋白受体(ldlr)的表达来调节脂质生成。

现有技术中关于虎杖苷抗高尿酸血症的报道(《广东化工》，2017年第4期，第44卷总第342期)，显示虎杖苷能够抑制小鼠高尿酸血症以及改善肾功能，其抑制高尿酸症的机制可能是调节了urat1、glut9、abcg2、oat1蛋白在肾脏中的表达，而改善肾功能的机制可能是提高了oct1、oct2、octn1、octn2蛋白在肾脏中的表达。

虎杖研究的相关试验表明：虎杖具有多种药理作用，主要包括对多器官功能障碍综合征的保护作用、对心血管系统的作用，抗菌、抗病毒，抗炎、抗过敏，抗氧化、抗休克，抗肿瘤，抗血栓、抗动脉粥样硬化及肾脏保护作用等。

现有技术中虽然涉及到虎杖苷降血糖、降血脂、降尿酸的作用，但存在以下缺陷：动物模型在造模时因素单一、彼此没有内在联系、与人类疾病发病差别较大；检测指标缺乏动态观察；各指标之间没有内在联系，作用靶点分散。

因此，现有技术中并没有公开虎杖苷或者虎杖通过同一信号通路对代谢综合征起作用，也就是说，现有技术中并无虎杖苷或者虎杖能够同时通过同一信号通路降低血尿酸、血糖、尿糖、血胆固醇、血甘油三脂、血同型半胱氨酸、血肌酐、血尿素氮及尿蛋白的含量的报道。

技术实现要素：

本发明涉及虎杖及虎杖的有效成分虎杖苷在治疗代谢综合征中的应用，尤其涉及虎杖及虎杖的有效成分虎杖苷在制备用于同时治疗高尿酸血症、高脂血症、高血糖、高同型半胱氨酸血症、肥胖症的药物中的应用。所述药物可制成临床上或药学上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂、冻干粉针剂、喷雾剂、栓剂、滴丸等合适的剂型。

第一方面本发明涉及虎杖在制备用于治疗代谢综合征的药物中的应用，其特征在于所述药物能同时治疗高尿酸血症、高脂血症、高血糖、高同型半胱氨酸血症和肥胖症。

第二方面，本发明涉及虎杖苷在制备用于治疗代谢综合征的药物中的应用，其特征在于所述药物能同时治疗高尿酸血症、高脂血症、高血糖、高同型半胱氨酸血症和肥胖症。

本发明的药物可以制成临床上或药学上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂、冻干粉针剂、喷雾剂、栓剂、滴丸等合适的剂型。

本发明的药物能同时降低血尿酸、血糖、尿糖、血胆固醇、血甘油三脂、血同型半胱氨酸、血肌酐、血尿素氮及尿蛋白的含量。

本发明的药物的给药途径包括临床上可接受的口服给药、注射给药、静脉滴注给药、舌下给药、喷雾吸入及直肠给药。

本发明首次发现，虎杖通过干预ampk/inos/nf-κb信号通路发挥作用。

本发明首次发现，虎杖苷通过干预ampk/inos/nf-κb信号通路发挥作用。

具体来说，本发明采用kk-ay合并高脂血症模型小鼠，进行一模型多指标同时检测，评价了虎杖及虎杖的有效成分虎杖苷对代谢综合征的治疗作用，明确了ampk/inos/nf-κb信号通路作为其作用靶点。

本发明采用能更好模拟人类代谢综合征疾病的动物模型，说明虎杖及虎杖的有效成分虎杖苷能同时降低血尿酸、血糖、尿糖、血胆固醇、血甘油三脂、血同型半胱氨酸、血肌酐、血尿素氮及尿蛋白的含量；明确了虎杖及虎杖的有效成分虎杖苷以ampk/inos/nf-κb信号通路作为其治疗代谢综合征的作用靶点。

本发明中首次发现虎杖同时对降血糖、血脂、血尿酸、血同型半胱氨酸、血肌酐、血尿素、尿蛋白、体重有作用，并且能加强肾功能；并且首次发现虎杖苷同时对对降血糖、血脂、血尿酸、血同型半胱氨酸、血肌酐、血尿素、尿蛋白、体重有作用，并且能加强肾功能。

而且，本发明首次采用动物模型kk-ay小鼠(自发性2型糖尿病小鼠)联合高脂饲料造成复合型代谢性疾病模型，更好地模拟了人类疾病的发病状态，与临床更接近；在同一模型上同时对血糖、血脂、血尿酸、血同型半胱氨酸、肾功能及体重进行检测，并对其进行动态观察，更好地反映了虎杖、虎杖苷治疗代谢综合征的有效性及作用特点；采用酵母所致大鼠高尿酸血症模型，同时对血糖、血脂、血尿酸、血同型半胱氨酸、肾功能及体重进行检测，并对其进行了动态观察，与现有方法不同；作用机制为调节免疫-炎性-代谢因子ampk/inos/nf-κb信号通路而发挥作用。作用靶点与已有的报道完全不同，并且首次明确了虎杖及虎杖的有效成分虎杖苷以ampk/inos/nf-κb这同一信号通路作为其治疗代谢综合征的作用靶点。

附图说明：

图1：显示了各组小鼠he染色的情况(he，×200)，其中，a：正常组；b：模型组；c：阳性药物组；g：虎杖苷大剂量组；h：虎杖苷中剂量组；i：虎杖苷小剂量组；m：虎杖水煎剂大剂量组；n：虎杖水煎剂中剂量组；o：虎杖水煎剂小剂量组；

图2：显示了各组小鼠pas染色的情况(he，×400)，其中，a：正常组；b：模型组；c：阳性药物组；g：虎杖苷大剂量组；h：虎杖苷中剂量组；i：虎杖苷小剂量组；m：虎杖水煎剂大剂量组；n：虎杖水煎剂中剂量组；o：虎杖水煎剂小剂量组；

图3：显示了各组小鼠电镜观察情况(×15000)，其中，a：正常组；b：模型组；c：阳性药物组；g：虎杖苷大剂量组；h：虎杖苷中剂量组；i：虎杖苷小剂量组；m：虎杖水煎剂大剂量组；n：虎杖水煎剂中剂量组；o：虎杖水煎剂小剂量组；

图4：显示了各组小鼠he染色的情况(10×20)，其中，a1-a2：正常组；b1-b8：模型组；c1-c4：阳性药物组；g1-g4：虎杖大剂量组；h1-h4：虎杖中剂量组；i1-i4：虎杖小剂量组；

图5：显示了各组小鼠pas染色的情况(10×40)，其中a1-a2：正常组；b1-b4：模型组；c1-c2：阳性药物组；g1-g2：虎杖大剂量组；h1-h2：虎杖中剂量组；i1-i2：虎杖小剂量组；

图6：显示了各组小鼠肾脏电镜检测结果(6000倍)，a1-a6：正常组；b1-b6：模型组；c1-c6：阳性药物组；g1-g6：虎杖大剂量组；h1-h6：虎杖中剂量组；i1-i6：虎杖小剂量组。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。

实施例1：虎杖苷及虎杖水煎剂对自发性2型糖尿病小鼠合并血脂代谢异常模型的影响

实验材料和方法

1.动物模型：

自发性2型糖尿病小鼠(kk-ay小鼠)合并血脂代谢异常模型，spf级雄性8～9周龄，体重30.94+1.67g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司，许可证号scxk(京)2009-0004。雄性c57bl/6j小鼠6只，体重24.57+1.60g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司，许可证号scxk(京)2009-0007。

2.受试药物：

虎杖苷：化学对照品，约20mg包装，批号：111575-200502(中国食品药品检定研究院)

虎杖煎剂的制备：将40g虎杖浓煎成50ml的药液

剂量设计：

虎杖苷大、中、小剂量：用蒸馏水分别配制成13.33mg/(kg·d)、6.67mg/(kg·d)、3.33mg/(kg·d)的大、中、小剂量

虎杖水煎剂大、中、小剂量：分别为20g生药/kg体重；10g生药/kg体重和5g生药/kg体重

3.试验方法：

各动物适应性喂养2周后，kk-ay小鼠予高脂饲料喂养，饲养方式为三天高脂饲料，三天正常饲料，两种配方高脂饲料交替使用，正常对照组c57bl/6j小鼠予普通饲料喂养。高脂饲料诱导3周后检测kk-ay小鼠空腹血糖及24h尿蛋白水平，血糖水平高于13.9mmol/l并且24h尿蛋白高于正常组，视为模型诱导成功。

将模型诱导成功小鼠按血糖及24h尿蛋白水平随机分为9组，分别为模型对照组、阳性药对照组，虎杖苷、虎杖水煎剂各大、中、小剂量组，将c57bl/6j小鼠设为正常对照组，每组6只。各组小鼠每日灌胃1次，连续12周。

4.检测指标：

41每周用电子天平监测小鼠体重：

4.2分别在药物干预的第0、4、8、12周尾尖取血，检测空腹血糖及尿酸值；代谢笼收集24h尿液并记录尿量，-80℃冰箱保存以备24小时尿蛋白、尿微量白蛋白(alb)、尿肌酐(cr)，计算尿白蛋白/肌酐比值检测；

4.3干预12周后，留取血液标本，-80℃冰箱保存以备甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、血清肌酐(scr)、尿素氮(bun)、β2微球蛋白(β2-mg)检测；

4.4取血后摘取新鲜肾组织，将1/2左肾置10％中性福尔马林缓冲液中，供光镜观察；1/2左肾迅速放入2.5％戊二醛用于肾组织电镜观察；

4.5机理研究：麻醉，腹主动脉取血，液氮冻存，以备rt-pcr、westernblot方法检测相关信号通路各指标；

本试验数据均以spss22.0统计处理，p＜0.05表示差异有统计学意义。

5.药效学研究：

在试验过程中，正常对照组各指标在正常范围内波动；模型对照组各指标成稳定升高状态；虎杖、虎杖苷在所试剂量范围内对血尿酸、尿糖、血胆固醇、血甘油三脂、血同型半胱氨酸、血肌酐、血尿素氮及尿蛋白含量等有明显降低作用，与模型对照组比较有显著性差异；

6.机理研究：

虎杖、虎杖的有效成分虎杖苷可明显上调代谢综合征模型小鼠免疫炎性代谢性抑制分子ampk的表达，下调炎性因子inos、nf-κb、tnf-α、il-18的表达。由于ampk可直接或间接参与炎性因子负性调节，可抑制inos表达，进而抑制no产生，抑制炎症反应。ampk还可增强pgc-1α蛋白活性，进而抑制nf-κb活性，抑制下游炎症因子tnf-α、il-18等的表达。ampk激活后还可增强sirt1活性，进而下调nf-κb、组蛋白等乙酰化水平，下调下游炎症相关因子的表达水平，减轻炎症免疫病理损伤。

7.试验结果：

表1虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠空腹血糖的影响

注：与正常组对照比较，##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结果显示：试验期间，模型对照组小鼠从0周至12周空腹血糖水平均处于增高状态，与正常对照组比较具有显著差异(p＜0.01)。虎杖苷及虎杖水煎剂不同剂量组在给药后8周开始对造模后小鼠血糖均有明显降低作用，与模型组比较有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。

表2虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠甘油三酯、总胆固醇的影响

注：与正常组比较，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结果显示：造模后模型对照组血甘油三酯、总胆固醇水平显著升高，与正常对照组比较具有显著性差异(p＜0.01＝；将虎杖苷及虎杖水煎剂连续给药12周后，三个剂量组可明显降低血甘油三脂含量，与模型对照组比较具有显著性差异(p＜0.05＝；各药物在所试剂量范围内对血总胆固醇无降低作用。

表3虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠血尿酸的影响

结果显示：造模后模型对照组血尿酸值水平显著升高，与正常对照组比较具有显著性差异(p＜0.01)；将虎杖苷及虎杖水煎剂连续给药12周后，三个剂量组从给药4周后可明显降低血尿酸值含量，与模型对照组比较具有显著性差异(p＜0.05)。

表4虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠血肌酐、尿素氮的影响

注：与正常组比较，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结果显示：造模后模型对照组血肌酐明显升高，与正常对照组比较有显著性差异(p＜0.01)；模型组尿素氮无明显变化。将虎杖苷三个剂量组连续给药12周后，对血肌酐及尿素氮值均有明显降低作用；虎杖水煎剂对血肌酐有明显降低作用，与模型对照组比较有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01)。

实施例2：虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠肾组织病理改变的影响：

1.he染色

模型对照组肾小球病变、肾小管病变、肾间质炎性浸润及病变总积分均明显增高，与正常对照组比较有显著性差异(p＜0.1)；虎杖苷及虎杖水煎剂连续给药12周后在所试剂量范围内均可不同程度减轻肾小球病变、肾小管病变及肾间质炎性浸润，降低病变总积分，与模型对照组比较有显著性差异(p＜0.1)。

表5虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠各组肾脏病变分类积分

注：与正常组比较，*p＜0.05；与模型组比较：#p＜0.05。

表6虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠各组小鼠肾脏病变总积分

注：与正常组比较，#p＜0.05；与模型组比较：*p＜0.05。

2.pas染色

与正常组比较，模型组ecm明显增高，差异具有统计学意义(p＜0.01)。与模型组比较虎杖组及其有效成分虎杖苷组ecm明显减少，差异具有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)。

表7虎杖及其有效成分虎杖苷对kk-ay小鼠各组肾小球基质ecm情况

注：与正常组比较，**p＜0.01；与模型组比较：#p＜0.05，##p＜0.01。

3.电镜观察

正常组基底膜较均一，组织紧密，极少量足突倒伏、融合。模型组基底膜增厚，足突倒伏、融合，肾小球部分纤维化。阳性药基底膜较均一，足突部分倒伏、融合，肾小球未见纤维化改变。虎杖苷大剂量组肾小球损伤明显，肾小球固化，可见纤维化；中剂量组基底膜较均一，少量足突倒伏、融合；小剂量组基底膜欠均一，部分足突倒伏、融合。虎杖水煎剂大、中剂量组基底膜厚薄不一，可见部分足突倒伏、融合，可见肾间质纤维化；小剂量组基部分增厚，部分足突融合、倒伏，未见间质纤维化；肾小球均未见固化、纤维化。综上，与模型组比较，各用药组肾小球及肾小管损伤均较轻，详见图3。

实施例3：虎杖水煎剂对酵母所致大鼠高尿酸血症模型的影响

1.试验药物：

药虎杖煎剂的制备：将40g虎杖浓煎成50ml的药液

剂量设置：虎杖水煎剂大鼠用量为10g生药/kg体重；5g生药/kg体重和2.5g生药/kg体重灌胃。

2.实验动物：雄性sd大鼠，spf级，体重200±10g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2012-0001。

3.试验方法：大鼠适应性喂养1周后，将腺嘌呤溶于0.5％羧甲基纤维素钠溶液中，按100mg/kg/d灌胃，同时给予10％酵母饲料100g/kg/d喂养，连续18d后，眼眶内眦取血测定血尿酸水平，与正常组比较差异具有统计学意义，视为高尿酸血症模型大鼠造模成功。

将造模成功的60只大鼠随机分为模型对照组，阳性药对照组，虎杖煎剂大、中、小剂量组，每组12只，另设正常对照组6只。各给药组按10ml/kg体重灌胃给药，每日给药1次，连续6周，正常组及模型组在同等条件下给于蒸馏水。

4.检测指标：

4.1分别于给药0、2、4、6周取血测定血尿酸(sua)、血肌酐(scr)、尿酸氮(bun)生化指标；采用代谢笼收集各组大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白水平；

4.2给药6周后，腹主动脉取血，测定血糖、血甘油三酯、血胆固醇；

4.3给药6周后，麻醉、处死各组大鼠，摘取肾脏称重。左肾沿外侧缘纵切，后面1/210％中性福尔马林溶液固定，以备光镜观测；前面1/22.5％戊二醛溶液固定，以备电镜检测；

本试验数据均以spss22.0统计处理，p＜0.05表示差异有统计学意义。

5.试验结果：

表8各组大鼠不同时间点血尿酸水平比较

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结果显示：造模后(给药前)各组大鼠血尿酸均匀增高，与正常对照组比较均有显著性差异(p＜0.01)；试验期间模型对照组尿酸值稳定在高水平。虎杖煎剂从给药后4周开始克明显降低大鼠血尿酸值，与模型对照立足比较有显著性差异(p＜0.01或p＜0.05)。

表9对大鼠高尿酸血症模型血脂、血糖的的影响

与空白对照组比较：##p＜0.01，与模型对照组比较：**p＜0.01

表10各组大鼠不同时间点血肌酐水平比较

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结果显示：造模后(给药前)各组大鼠血肌酐值均匀增高，与正常对照组比较均有显著性差异(p＜0.01)；试验期间模型对照组尿肌酐值稳定在高水平。虎杖煎剂各剂量组从给药后2周开始可明显降低大鼠血肌酐值，与模型对照组比较有显著性差异(p＜0.01或p＜0.05)。

表11各组大鼠不同时间点尿素氮水平比较

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结果显示：造模后(给药前)各组大鼠血尿素氮值均匀增高，与正常对照组比较均有显著性差异(p＜0.01)；试验期间模型对照组血尿素氮值稳定在高水平。虎杖煎剂各剂量组从给药后2周开始可明显降低大鼠血尿素氮值，与模型对照组比较有显著性差异(p＜0.01或p＜0.05)。

表12各组大鼠不同时间点24小时尿蛋白水平比较

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

结果显示：造模后(给药前)各组大鼠尿蛋白值均匀增高，与正常对照组比较均有显著性差异(p＜0.01)；试验期间模型对照组尿蛋白值稳定在高水平。虎杖煎剂各剂量组从给药后4周开始可明显降低大鼠尿蛋白值，与模型对照组比较有显著性差异(p＜0.01或p＜0.05)。

6.he染色切片显微镜观察结果

正常对照组大鼠肾脏肾小管上皮未见有萎缩，小管上皮未见空泡变，管内未见蛋白，未见有结晶，间质未见炎症，结构正常。

模型组大鼠肾脏组织有不同程度小管上皮细胞变性坏死，小管有大小不等的囊性扩张，扩张小管内大量中性分叶核形成特殊管型。肾间质有大面积炎症细胞浸润，主要以中性粒细胞为主，淋巴细胞、单核细胞、浆细胞。间质有纤维增生，肾皮髓质间质及曲管内可见大小不等棕色结晶沉积，结晶处有马蹄样多核巨细胞出现，部分肾集合管内或间质内有大片状特殊蛋白管型及红细胞管型。肾小球有不同程度增大，不明显。小球内有充血，肾小球包氏囊内壁层细胞增多、肥大，内膜有增厚，并有少量血浆渗出，被染成粉色。模型组的肾脏各部分病变与对照组比较，均有统计学差异(p＜0.05)。

给药6周虎杖不同剂量组、阳性药组所送检动物肾脏组织病变如肾曲管肿胀、变性坏死、间质炎症，肾集合管蛋白管型沉积、嘌呤沉积，及肾小球损伤程度均较模型组有所改善。6周时，虎杖大、中剂量组肾小管上皮萎缩变性，肾间质嘌呤沉积情况与模型组比较差异具有统计学意义(p＜0.01或p＜0.05)。6周时，虎杖组肾脏病变情况与阳性药组比较无统计学差异(p＞0.05)。

表13各组大鼠6周时肾小管上皮萎缩变性，肾间质嘌呤沉积情况比较

注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；

表14各组大鼠6周时肾间质炎症、集合管蛋白管型沉积情况比较

注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；

表15各组大鼠6周时肾小球病变情况比较

注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；

参见图4，a1显示了正常对照组大鼠肾脏肾小球和曲管正常结构，间质未见有炎症，未见嘌呤沉积；a2显示了正常对照组大鼠大鼠肾曲管、上皮细胞未见肿胀，未见有蛋白管型；b1显示了模型组大鼠肾曲管扩张，管内大量炎症细胞管型，间质炎症细胞增多，嘌呤沉积；b2显示了模型组大鼠肾曲管肿胀。明显间质炎症，大量大小不等棕色嘌呤沉积；b3显示了模型组大鼠肾曲管扩张囊性变，间质大量炎症细胞增生；b4显示了模型组大鼠肾小球包氏囊内膜细胞增生、肥大，曲管间质炎症较多见；b5显示了模型组大鼠肾脏曲管间质炎症浸润，曲管扩张；b6显示了模型组大鼠肾脏肾小球内毛细血管瘀血，系膜细胞增多；b7显示了模型组大鼠肾脏集合管内有蛋白沉积；b8显示了模型组大鼠肾脏间质炎症，曲管肿胀，大量嘌呤沉积；c1显示了阳性药组大鼠肾脏肾小球结构较正常，曲管肿胀、间质炎症病变改善；c2显示了大鼠肾脏集曲管肿胀、间质炎症有恢复；c3显示了大鼠肾脏曲管肿胀、间质炎症减轻；c4显示了大鼠肾小球病变减轻；g1显示了虎杖大剂量组大鼠肾曲管坏死上皮已在恢复，嘌呤沉积减轻；g2显示了虎杖大剂量组大鼠肾小球病变减轻，曲管间质炎症改善；g3显示了虎杖大剂量组大鼠肾曲管肿胀、蛋白沉积减轻；g4显示了虎杖大剂量组大鼠肾间质炎症减轻，肾小球瘀血、包氏囊增厚改善；h1显示了虎杖中剂量组大鼠肾小球病变明显减轻；h2显示了虎杖中剂量组大鼠肾曲管间质炎症、嘌呤沉积减轻；h3显示了虎杖中剂量组大鼠肾小球病变及间质炎症明显减轻；h4显示了虎杖中剂量组大鼠肾曲管间质炎症及嘌呤沉积明显减轻；i1显示了虎杖小剂量组大鼠肾小球病变及间质炎症减轻，嘌呤沉积改善；i2显示了虎杖小剂量组大鼠肾间质炎症减轻，嘌呤沉积减少；i3显示了虎杖小剂量组大鼠肾小球有瘀血，间质有轻度炎症，嘌呤沉积减轻；i4显示了虎杖小剂量组大鼠肾间质炎症减轻，有明显恢复。

7.pas染色切片显微镜观察结果

正常对照组大鼠肾脏肾小球微血管正常，pas染色均匀一致，基质、小球基底膜，小球包氏囊未见增厚，结构正常。模型组6周大鼠肾脏肾小球pas染色，着色不均匀，部分小球基质及基底膜有不同程度增厚。阳性药组6周大鼠，虎杖给药6周不同剂量组的肾小球pas染色差色，比模型组肾小球内基质增厚有不同程度改善或减轻。

详见表16，图5。参见图5，a1显示了正常对照组大鼠肾小球基质均匀一致，正常结构；a2显示了正常对照组大鼠肾小球基质均匀一致，结构正常；b1显示了模型组大鼠肾小球基质有大片状节段性增厚；b2显示了模型组大鼠肾小球基质有大片状节段性增厚；b3显示了模型组大鼠肾小球基质有节段性增厚；b4显示了模型组大鼠肾小球基质有增厚；c1显示了阳性药组大鼠肾小球内基质染色均匀一致，较正常；c2显示了阳性药组大鼠肾小球内基质染色均匀一致，较正常；c3显示了大鼠肾小球内基质未见有明显病变；c4显示了大鼠肾小球内基质未见有明显病变；g1显示了虎杖大剂量组大鼠肾小球内基质增厚不明显，包氏囊壁层有增厚；g2显示了虎杖大剂量组大鼠肾小球内基质有灶状增厚；h1显示了虎杖中剂量组大鼠肾小球内基质增厚不明显，包氏囊壁层有增厚；h2显示了虎杖中剂量组大鼠肾小球内基质有灶状增厚；i1显示了虎杖小剂量组大鼠肾小球内基质有灶状增厚，包氏囊增厚；i2显示了虎杖小剂量组大鼠肾小球内基质有灶状增厚，包氏囊增厚。

表16各组大鼠6周时肾小球基质、基底膜病变情况比较

注：与正常组比较，#p＜0.05；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

图6显示了各小鼠组的电镜检测结果，a1-a6分别显示了正常对照组大鼠：肾小管及肾间质未见明显异常；肾小管及肾间质未见明显异常；肾小球基本正常，基底膜较均一；肾小管管壁完整，基底部局部稍增厚，肾间质未见纤维化；肾小管管壁完整，基底膜部分厚薄不均，肾间质未见纤维化；肾小球基本正常，基底膜薄厚较均一，少量足突倒伏；b1-b6分别显示了模型组大鼠：肾间质扩张，严重纤维化；肾小球基底膜节段性增厚，足突融合；肾小球基底膜增厚，足突严重融合、部分缺失；肾小管基底膜变薄、断裂，肾间质明显纤维化；肾间质水肿、扩张，间质纤维化，肾小管基底膜厚薄不一；肾小球基底膜增厚，足突严重融合；c1-c6分别显示了阳性药组大鼠：肾小球基底膜较均一，囊壁扩张、纤维化，足突融合，间质可见纤维化，肾小管基底膜较均一；肾间质纤维化，肾小管管壁完整，基底膜厚薄不一；肾小球基底膜较均一，足突倒伏、融合；肾间质纤维化，肾小管管壁完整，基底膜疏松、扩张；肾小管管壁完整，基底膜局部肿胀、扩张，间质纤维化；肾小球基底膜较均一，足突倒伏，部分融合；g1-g6分别显示了虎杖大组大鼠：肾小管管壁完整，基底膜较均一，间质少量纤维化；肾小管管壁完整，基底膜欠均一；肾小球基底部局部增厚，足突部分融合；肾小管管壁完整，部分基底膜肿胀、扩张；肾小球基底膜较均一，足突部分融合，囊壁尚可；肾小球基底膜局部增厚，足突部分融合；h1-h6分别显示了虎杖中组大鼠：肾小球基底膜较均一，足突部分倒伏，囊壁尚可，肾小管基底膜尚可，间质未见纤维化；肾小球基底膜较均一，足突幼稚，囊壁肿胀、扩张，肾小管基底膜变薄；肾小球基底膜较均一，足突偏幼稚，部分融合；肾小球基底膜较均一，足突幼稚，部分融合，囊壁局部肿胀、扩张，肾小管基底膜局部增厚，间质未见明显纤维化；肾小球基底膜较均一，足突幼稚，囊壁肿胀、扩张；肾小球基底膜较均一，少量足突幼稚，部分融合；i1-i6分别显示了虎杖小组大鼠：肾小管管壁完整，基底膜局部增厚；肾小球基底膜较均一，足突部分融合，囊壁肿胀、扩张，间质纤维化；肾小球基底膜较均一，足突幼稚；肾小管管壁完整，基底膜部分肿胀、扩张；肾小球基底膜均一，足突部分融合，囊壁肿胀、扩张，间质可见纤维化；肾小球基底膜局部增厚，足突倒伏、融合。

实例4：虎杖苷及虎杖水煎剂对自发性2型糖尿病小鼠合并血脂代谢异常模型ampk/inos/nf-κb信号通路的影响

1.受试药物：

乙药：虎杖苷标准品，约20mg包装，批号：111575-200502(中国食品药品检定研究院)

丁药：虎杖煎剂

虎杖煎剂的制备：将40g虎杖浓煎成50ml的药液。

2.实验动物：spf级雄性8-9周龄kk-ay小鼠，体重(30.94±1.67)g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司，许可证号scxk(京)2009-0004。雄性c57bl/6j小鼠6只，体重(24.57土1.60)g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司，许可证号scxk(京)2009-0007。适应性喂养2周后，kk-ay小鼠予高脂饲料喂养，饲养方式为三天高脂饲料，三天正常饲料，两种配方高脂饲料交替使用，正常对照组c57bl/6j小鼠予普通饲料喂养。高脂饲料诱导3周后检测kid-ay小鼠空腹血糖及24h尿蛋白水平，血糖水平大于13.9mmol/l并且24h尿蛋白高于正常组，视为模型诱导成功。

将模型成功小鼠按血糖及24h尿蛋白水平随机分为模型组，阳性药组，虎杖苷及虎杖水煎剂大、中、小剂量组，将c57bl/6j小鼠设为正常对照组，每组6只。各组小鼠每日灌胃1次，连续12周。

干预12周后，麻醉，腹主动脉取血，液氮冻存，以备rt-pcr、westernblot方法检测。

本试验数据均以spss22.0统计处理，p＜0.05为差异有统计学意义。

3.检测：

(1)rt-pcr检测：用trizol提取腹主动脉血rna，进行反转录得到cdna溶液后，进行实时荧光定量pcr反应：powersybrgreen17.2μl，反应体系cdna2μl，10μm引物各0.4μl。反应条件：42℃灭活5min，95℃下变性10秒、退火5秒，60℃延伸34秒，共计40个循环。反应结束后分析熔解曲线，鉴定pcr产物的特异性。利用sequencedetectionsystem软件，分析pcr过程各检测样本的ct值。

(2)westernblot检测：向腹主动脉血(1ml)中加入200μl蛋白裂解液，混匀，充分裂解。离心后取上清，用bca试剂盒测定蛋白浓度。将样本蛋白浓度调至相同，加载样缓冲液，95℃变性5min，保存备用。采用sds聚丙烯凝胶电泳，配制10％分离胶，5％浓缩胶，加样电泳，浓缩胶90v，分离胶120v，当溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。湿法转膜约150min。用含5％bsa-tbst的封闭液封闭pvdf膜，室温摇动封闭2h。按比例稀释i抗，与膜一起孵育，4℃过夜。按1：5000比例稀释hrp标记的二抗，与膜共同孵育2h。ecl显色，凝胶图像分析系统对蛋白条带进行扫描，gel-pro软件分析图像灰度。相对含量的变化＝目的蛋白灰度/actin灰度。

(3)elisa检测，按照elisa试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)说明书操作。

4.试验结果：

表17各组ampkmrna转录及蛋白表达(westernblot)水平

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.05；

结果显示：与正常组比较，模型组小鼠ampkmrna转录及蛋白表达水平明显下降(p＜0.01)。与模型组比较，虎杖苷组ampkmrna表达水平及蛋白表达水平明显上调(p＜0.01，p＜0.05)。

表18各组inosmrna转录及蛋白表达(westernblot)水平

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.05；

结果显示：与正常组比较，模型组小鼠inosmrna转录及蛋白表达水平明显上升(p＜0.01)。与模型组比较，虎杖苷及虎杖水煎剂不同剂量组inosmrna表达水平明显下调(p＜0.01，p＜0.05)。

表19各组nf-κbmrna转录及蛋白表达(westernblot)水平比较

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.05；

结果显示：与正常组比较，模型组小鼠p65mrna转录及蛋白表达水平明显上升(p＜0.01)。与模型组比较，虎杖苷及虎杖水煎剂各剂量组p65mrna转录及蛋白表达水平明显下调(p＜0.01)。

表20各组tnf-αmrna转录及蛋白表达(elisa)水平比较

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.05；

结果显示：与正常组比较，模型组小鼠tnf-αmrna转录及蛋白表达水平明显上升(p＜0.01)。与模型组比较，虎杖苷及虎杖水煎剂各剂量组tnf-amrna转录及蛋白表达水平明显下调(p＜0.01)。

表21各组il-18mrna转录及蛋白表达(elisa)水平比较

注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比牧，*p＜0.05，**p＜0.05；

结果显示：与正常组比较，模型组小鼠il-18mrna转录及蛋白表达水平明显上升(p＜0.01)。与模型组比较，虎杖苷及虎杖水煎剂各剂量组il-18mrna转录水平明显下调(p＜0.01)。

结论：虎杖及虎杖有效成分虎杖苷可明显上调代谢综合征模型小鼠免疫炎性代谢性抑制分子ampk表达，下调炎性因子inos、nf-κb、tnf-α、il-18表达。由于ampk可直接或间接参与炎性因子负性调节，可抑制inos表达，进而抑制no产生，抑制炎症反应。ampk还可增强pgc-1α蛋白活性，进而抑制nf-κb活性，抑制下游炎症因子tnf-α、il-18等表达。ampk激活后还可增强sirt1活性，进而下调nf-κb、组蛋白等乙酰化水平，下调下游炎症相关因子表达水平，减轻炎症免疫病理损伤。