治疗肝癌的碘125粒子和自然杀伤细胞组合产品及其应用方法与流程

本发明为一种药物组合，包括(a)碘125粒子，和(b)高活性自然杀伤(hank)细胞，同时、分开或顺序应用治疗晚期肝细胞癌(hcc)；所述药物组合在治疗晚期hcc中的应用；治疗晚期hcc的方法，所述方法包括向肝癌患者施用有效剂量的所述药物组合联合治疗。
背景技术：
：将碘125粒子植入肿瘤部位已广泛用于肝癌的治疗。碘125粒子可释放27.4～31.4kev的x射线和35.5kev的γ射线，通过产生的自由基和电离杀死肿瘤细胞，而且碘125粒子植入可促进抗癌免疫应答，激活cd3+和cd4+t细胞。对晚期hcc患者的治疗中，射频消融联合经皮碘125粒子植入可以获得比单独射频更好的5年生存率。但与单纯射频消融相比，hcc患者的肝功能检查有轻度异常，碘125粒子内爆后ast(65iu/l)和alt(60iu/l)轻度升高。肝移植(lt)是目前治疗晚期hcc的最佳方案。但大多数hcc患者在lt后存在肝癌复发的风险，并且lt后肝癌复发是一个普遍存在的临床难题。lt后需要使用免疫抑制药物来对抗自身排斥反应，而免疫抑制是恰恰又是肝癌复发的诱因。因此，对lt后免疫抑制的患者迫切需要有效的替代疗法。自然杀伤(nk)细胞是天然免疫应答的最有效成分之一，同时也参与获得性免疫应答。hank细胞具有抗肿瘤活性，并已用于癌症的过继免疫治疗。技术实现要素：针对不适合lt或lt后复发的hcc患者的上述问题，本发明提供了一种药物组合产品。其特征在于，包括nk细胞和碘125粒子，同时、分开或顺序应用于治疗肝癌，所述的nk细胞为高活性nk(hank)细胞。所述hank细胞是通过活化以下至少一种单核细胞而获得的。所述单核细胞选自患者本人的外周血、与患者半相合的外周血或无关的异体外周血、以及脐带血，优先选择同种异体外周血。所述药物组合产品，为顺序给予碘125粒子和hank细胞，优选给予碘125粒子后0.5-1.5个月给予hank细胞；hank细胞采取每月两个疗程的治疗方案，每个疗程输注三次，连续3天，每天一次。优选地，所述hank细胞的输注方式为静脉滴注。hank细胞的剂量约为1×1010个。在hank细胞治疗时应当筛选杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)及其配体-人类白细胞抗原(hla)i类分子错配的同种异体反应性供者。所述组合产品中的hank细胞可以是自体的，也可以是异体的，或来自脐带血的。优选的，hank细胞供者为其hla与患者的kir错配的。本发明所述的hank细胞为高活性自然杀伤细胞。本发明的优势本发明表明了碘125粒子植入联合异体hank细胞治疗在肝癌lt后复发治疗中的潜在效果。48岁男性原发性肝癌和胰腺转移患者，lt后采用碘125粒子植入联合异体hank细胞治疗，经过15个月的随访，肝脏肿瘤的大小和转移显著减少。临床数据表明，同种异体hank细胞免疫治疗取得了部分临床反应，提高了患者的生活质量，没有移植物与宿主反应(gvhr)或任何其他局部或全身副作用的迹象。附图说明图1扩增前cd56+cd3-nk细胞纯度分析图2扩增第9天cd56+cd3-nk细胞纯度分析图3肝功能alt水平检测图4肝功能ast水平检测图5肝功能alp水平检测图6肝功能ggt水平检测图7碘125粒子及同种异体hank细胞治疗后全部淋巴细胞亚群检测图8碘125粒子包埋联合同种异体hank细胞治疗后，肿瘤标记ca19-9检测图9患者治疗前后mri对比a：治疗前肿瘤2.2x1.9厘米b：碘125粒子包埋后2个月肿瘤2.0x0.9厘米c：同种异体hank细胞治疗后5个月肿瘤块1.7x1.2厘米d：治疗后3年肿瘤块1.8x0.9厘米具体实施方式实施例1：kir错配供体选择本发明采用人hank细胞体外制备试剂盒诱导kir失配的hank细胞扩增活化。对于同种异体hank细胞免疫治疗，根据患者外周血抑制性kir与供者hlai类分子基因型错配原则选择同种异体供者(优选患者的亲属)。使用tianampblooddnakitdna试剂盒(天津秀鹏生物技术有限公司，天津，中国)和kir/hla-cw基因分型低分辨率试剂盒(pcr-ssp；superbio.developingco.，天津，中国)检测供者和患者。按先前公布的标准，kir/hla-cw错配的定义是作为抑制性kir配体的hla缺失一个或多个等位基因。实施例2：hank细胞制备用临床分级试剂在gmp标准条件(药品生产质量管理规范)下制备hank细胞，人类nk细胞体外培养协同试剂盒(汉科生物工程有限公司，深圳，中国)用于刺激血液单核细胞(pbmc)中nk细胞的扩增与活化。首先，把收集到的血液(50-80ml)转移至50毫升锥形管，600×g离心15分钟。将上清液中的血浆收集到50毫升锥形管中。将锥形管置于56℃水浴，30分钟后取出冷却至管温37℃；400×g离心10分钟，然后将上清液转入新的50ml锥形管内，在4℃下储存，以便下一步使用。4℃保存下超过12小时的血浆使用时需再次离心并且只使用上清液。(2)向底部的血细胞中加入相同体积的生理盐水，重新悬浮细胞。将20ml的人淋巴细胞分离液(中国天津灏洋生物制造有限公司)转移到两个50ml的锥形管内。将等体积的血细胞悬液缓慢加入至淋巴细胞分离液上方。以600×g离心15分钟。将中间层的淋巴细胞转移到50毫升锥形管中，用生理盐水冲洗两次；计算细胞总数。nk细胞培养基由1lx-vivo15无血清培养基(lonza，walkersville，md，美国)、1管nk1和自身血浆(初始200ml培养基为5％，然后降至1％-2％)组成。nk2为膜嵌合活性细胞因子。根据pbmc细胞总数计算nk2使用量。将nk2从液氮或-80℃冷柜中取出，立即放入37℃水浴中复苏，融解后350×g离心5分钟，弃上清，沉淀用盐水洗涤两次。用3mlnk细胞培养基悬浮备用。hank细胞培养方法如下：第1天，将4×107pbmc，1管nk2和50mlnk细胞培养液混合加入至t175培养瓶(corningincorporated,ny,usa)，置于37℃5％co2培养箱中培养；第3天，加入约30mlnk细胞培养液至t175培养瓶中；第5天，加入约60mlnk细胞培养液至t175培养瓶中，将细胞浓度调至106个/ml；第6天，加入约60mlnk细胞培养液至t175培养瓶中；第7天，加入约50mlnk细胞培养液(血浆浓度1-2％)至t175培养瓶中，计算细胞总数；如果细胞总数大于6×107，补加一支复苏的nk2；如果细胞总数为3-6×107，等至第8天再补加一支复苏的nk2；进行第一次无菌检测。第8天，将t175培养瓶中所有的培养液都转移至2l细胞培养袋(灏洋生物制品科技有限责任公司，天津)并补加约200mlnk细胞培养液。第9，10和11天，每天补加约150mlnk细胞培养液至细胞培养袋中。第12天，补加约350mlnk细胞培养液至细胞培养袋中；进行质量控制检测(包括细胞存活率≥90％，纯度≥70％，内毒素≤1eu/ml，细胞活性≥80％)。第13天，收获hank细胞，计算细胞总数(此时应为约1×1010)。将细胞培养袋中的培养液转至450ml锥形离心管中，离心沉淀细胞，用生理盐水洗涤一次，最后用细胞回输液(含400ml生理盐水，1％人血清白蛋白和6mllc3)将细胞浓度调整至2×107个/ml。nk细胞培养第13，14和15天收集培养袋中的hank细胞并给患者输注，每天输注3-5×109个细胞，连续3天为一个疗程。每个入组患者至少接收一个疗程的hank细胞治疗。实施例3：患者治疗方案48岁男性晚期hcc患者，肝移植后肝癌复发。2016年6月进行碘125粒子植入。根据计算机断层扫描(ct)结果，按肿瘤大小确定所需碘125粒子的数量，制备链用于移植。病人仰卧位局部麻醉和心电图监测后，10粒粒子，每粒活性为0.7mci，半衰期为60.1天，以0.5cm的间隔植入肿瘤边缘。给患者制备hank细胞的外周血是其亲属提供的，按实施例1提供的方法进行kir配型测试，结果见表1，患者的kir与供着的hla基因是错配的。表1供者kir和患者hla基因配型结果供者(患者亲属)受者(患者)基因型kir2dl1,kir2dl3,kir2ds2hia-cw3,hla-cw12按实施例2提供的方法制备hank细胞，nk细胞扩增活化前后纯度比较见图1和图2。在nk细胞扩增前，cd56+cd3-群体的中位数百分比为7.2％。扩增后，存活细胞比例超过92％，没有任何细菌、真菌或支原体污染(内毒素水平，1eu)。在制备的hank细胞中，cd56+cd3-细胞的中位比例为91.3％。从2016年7月到2016年10月静脉输注培养的hank细胞，每月进行两个疗程的治疗。每疗程连续3天，每天输注一次。在治疗过程中，患者接受了六个疗程(18次输注)的hank细胞治疗。在hank细胞输注期间，患者没有报告经历寒战、发烧或任何其他不适。治疗后，alt、ast和ggt水平较治疗前降低，而alp水平无影响(图3-6)。患者的淋巴细胞亚群在同种异体hank免疫治疗后得到改善(图7)。ca19-9水平在hack细胞输注后增加(图8)，但一年后恢复正常值，ctc也恢复正常，一年后甚至稳定(表2)。表2不同日期循环肿瘤细胞(ctc)检测结果日期ctc2016.7.2132016.8.17192016.8.2602016.8.2502017.10.2722017.12.10治疗后，ctc从19个/7.5ml血降至正常值(0-1个个/7.5ml血)mri影像改变：在碘125粒子植入时，肿瘤大小是2.2×1.9厘米(图9a)。碘125粒子包埋后2个月和同种异体hank细胞治疗后5个月肿瘤大小分别是2.0×0.9厘米和1.7×1.2厘米(图9b和c)。治疗后3年肿瘤块大小是1.9x0.8厘米(图9d)。整体疗效为部分有效(pr)，存活时间大于18个月。患者kir受体与供者hla0cw3基因错配。上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。当前第1页12