壳寡糖包被绵羊李斯特菌、制备方法及应用与流程

本发明属于生物领域，涉及一种壳寡糖包被绵羊李斯特菌、制备方法及应用。

背景技术：

绵羊李斯特菌(listeriaivanovii，li)属于李斯特菌属，可在巨噬细胞和许多非吞噬细胞(如上皮细胞、内皮细胞和肝细胞)内增殖，在此过程中，可同时经mhci类和mhcii类途径递呈细菌携带的抗原，因而可用作构建疫苗的活菌载体。将外源抗原加入该菌后，通过该菌在抗原递呈细胞内的短暂增殖，将外源抗原递呈给淋巴细胞，有效激活免疫应答，尤其是细胞免疫应答，发挥疫苗免疫作用。同时，该菌对人不致病，仅主要感染以绵羊为主的畜类，因而对人安全。有研究者以li为疫苗载体构建了两株携带结核分枝杆菌抗原的重组菌，免疫小鼠后抗原特异性细胞因子ifn-γ分泌上调，证实了li作为疫苗载体的可行性。但已有的研究表明，li逃逸吞噬细胞吞噬体和在胞浆内聚焦肌动蛋白的能力，以及免疫小鼠后诱导的细胞因子反应均较弱，故li疫苗载体可能需要联合使用佐剂以获得更强的特异性免疫应答。

壳寡糖(chitooligosaccharide，cos)是由壳聚糖降解产生的分子量小于5000的低聚糖，是一种带正电荷的生物活性材料，可用于药物递送和基因转导，壳寡糖具有多种生理活性，其中最重要的是它的免疫增强作用。有研究者将带正电荷的壳寡糖通过静电吸附作用包被于带负电荷的腺病毒疫苗载体表面，发现可明显提高腺病毒疫苗诱导的特异性ifn-γ的分泌。细菌与病毒在大小、结构、形态上差别很大，生物学特性也极为不同，高浓度的壳寡糖对细菌具有较强的毒性，壳寡糖浓度过低又不能保证包被效果。壳寡糖能否包被于细菌表面，以及包被后能否增强细菌的免疫原性还未有研究报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种壳寡糖包被绵羊李斯特菌、制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

壳寡糖包被绵羊李斯特菌(listeriaivanovii，li)，是壳寡糖通过静电吸附作用包被在li表面而得，壳寡糖与li的配比小于等于2mg∶1×10⁸cfu。

作为优选的技术方案之一，壳寡糖的分子量为3000da。

上述壳寡糖包被li的制备方法，步骤如下：

(1)将li配制成浓度为1×10⁸cfu/ml的菌悬液；

(2)菌悬液与浓度小于等于2mg/ml的壳寡糖溶液等体积混合，振荡混匀，静置，离心，弃上清，洗涤，重悬，即得。

优选的，步骤(1)的具体方法是：冻存的li菌株经复苏、二次复苏、接种培养，取所得的菌液制成菌悬液。

进一步优选的，接种培养至菌液在600nm的吸光度值a600为0.3～0.8之间，根据测定的lia600值与li菌液浓度的关系确定此时的li菌液浓度，a600值与li菌液浓度的关系为：li(cfu/ml)＝3a600×10⁹-2×10⁸，其中，li表示li菌液浓度，取li菌液配制菌悬液。

进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：冻存的绵羊李斯特菌融化后，取10μl接种于5mlbhi肉汤中，37℃、200rpm摇育16～18小时；次日，对菌液进行二次复苏，即取复苏后的菌液10μl于5mlbhi肉汤中，37℃、200rpm摇育16～18小时；取200μl经二次复苏后的菌液接种于5mlbhi肉汤中，培养细菌至菌液a600值为0.3～0.8之间时，根据测定的lia600值与li菌液浓度的关系确定此时的li菌液浓度，根据计算所得的li菌液浓度，取一定量的菌液(其中含1×10⁸cfu的li菌)4℃、13000rpm/min离心2分钟，弃去上清，用pbs重悬洗涤，4℃、13000rpm/min离心2min，弃去上清，用1mlpbs重悬配制成1×10⁸cfu/ml的li菌悬液。

优选的，步骤(2)中，壳寡糖溶液是将壳寡糖粉末用pbs配制而成。

进一步优选的，壳寡糖粉末的分子量为3000kda。

进一步优选的，壳寡糖溶液的配制方法如下：用pbs将壳寡糖粉末配制成浓度为100mg/ml的壳寡糖储备液，经0.22μm过滤除菌备用；然后将壳寡糖储备液用pbs稀释，得到壳寡糖溶液。

优选的，步骤(2)的具体方法是：将1ml壳寡糖溶液与1ml菌悬液等体积混合，漩涡振荡混匀30s，室温静置30分钟；然后13000rpm/min离心2分钟，弃去上清，再加pbs洗涤一次，最后用1mlpbs重悬。

上述壳寡糖包被li在制备活菌载体疫苗中的应用，优选为以李斯特菌为载体的疫苗。

一种疫苗，其有效成分为上述壳寡糖包被li。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明将佐剂壳寡糖通过静电吸附作用包被到li表面，包被方式简单，在筛选出的包被液浓度范围内壳寡糖不影响细菌生长。

(2)包被在细菌表面的壳寡糖所带的正电荷中和了细菌表面所带的负电荷，形成的复合物(包被后的细菌)更容易靠近带负电荷的吞噬细胞，细菌入胞率得到显著提高。

(3)更多细菌进入吞噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞能产生更强的抗原刺激，诱导更强的免疫应答。

(4)进入吞噬小体的细菌在表面壳寡糖的质子海绵效应的协助下，更多的细菌能逃逸吞噬体回到胞浆增殖，使细菌携带的抗原在胞浆内降解后通过mhc-ⅰ类途径诱导更多的cd8细胞免疫应答。

(5)相比没有包被壳寡糖的li，包被后的细菌能诱导更高效的细胞因子分泌，尤其是cd8细胞分泌的细胞因子。

(6)壳寡糖对人体无毒、分子量低、水溶性好，本身具有的免疫调节作用也能促进免疫细胞的增殖和细胞因子分泌。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同壳寡糖包被浓度下li-rv0129c的存活情况。结果表明，当包被浓度提高到2mg/ml时，li-rv0129c活菌浓度与对照相比有所降低，但降低程度不明显，在1个数量级以内；当包被浓度提高到4mg/ml时，li-rv0129c活菌浓度与对照相比，降低了约两个数量级，为了使包被的壳寡糖不严重影响细菌的生长，壳寡糖包被液浓度应不高于2mg/ml。

图2为li-rv0129c和在不同壳寡糖包被浓度下cos-li-rv0129c的表面zeta电位。结果表明，当包被浓度高于0.5mg/ml时，li-rv0129c表面的负电荷逐渐被中和，初步证实壳寡糖成功包被上li-rv0129c。

图3为li-rv0129c和以2mg/ml浓度壳寡糖包被后的li-rv0129c的扫描电镜图。结果表明，未包被壳寡糖的li-rv0129c表面光滑，而包被了壳寡糖的li-rv0129c表面粗糙，菌体皱缩，可以看到附着在细菌表面的壳寡糖。

图4为c57bl/6小鼠经尾静脉免疫0.1倍ld50剂量的li-rv0129c和cos-li-rv0129c后测定的特异性细胞因子分泌情况结果图。(a)-(d)分别为cd4⁺ifn-γ、cd8⁺ifn-γ、cd4⁺tnf-α、cd8⁺tnf-α分泌情况，从cos-li-rv0129c组、li-rv0129c组、pbs组、cos组各选了一张具有代表性的流式散点图；(e)-(h)为小鼠细胞因子分泌情况的统计结果，依次为cd4⁺ifn-γ、cd8⁺ifn-γ、cd4⁺tnf-α、cd8⁺tnf-α分泌情况(*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001)；(i)为小鼠cd8⁺ifn-γ和cd8⁺tnf-α分泌情况的统计结果。结果表明壳寡糖包被li-rv0129c后，其诱导分泌的ifn-γ、tnf-α均得到了明显提高，尤其是cd8细胞分泌的细胞因子。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明涉及的绵羊李斯特菌li-rv0129c是基因组中加入了结核分枝杆菌编码ag85c的基因rv0129c。构建方法见文献“任晨艳,刘思静,蒲启康,等.李斯特菌载体结核疫苗候选株基因重组构建及蛋白表达验证[j].四川大学学报(医学版),2016,47(6):819-824.”。

本发明涉及的pbs均为无菌pbs，其ph为7.2-7.4。

实施例1.壳寡糖包被液包被重组绵羊李斯特菌的基本方法

壳寡糖包被重组绵羊李斯特菌li-rv0129c的具体步骤如下：-80℃冻存的li-rv0129c融化后，取10μl接种于5mlbhi肉汤中，37℃、200rpm摇育16～18小时；次日，对菌液进行二次复苏，即取复苏后的菌液10μl于5mlbhi肉汤中，37℃、200rpm摇育16～18小时；取200μl经二次复苏后的菌液接种于5mlbhi肉汤中，培养细菌至菌液吸光度值a600值为0.3～0.8之间时，根据测定的绵羊李斯特菌a600值与菌液浓度的关系确定此时的细菌浓度，a600值与li菌液浓度的关系为：li(cfu/ml)＝3a600×10⁹-2×10⁸。根据计算所得的li菌液浓度，取一定量的菌液(其中含1×10⁸cfu的li菌)4℃、13000rpm/min离心2min，弃去上清，用pbs重悬洗涤，4℃、13000rpm/min离心2min，弃去上清，用1mlpbs重悬配制成1×10⁸cfu/ml的菌悬液；用pbs将壳寡糖粉末(3000kda)配制成100mg/ml的壳寡糖储备液，经0.22μm过滤除菌备用。将壳寡糖储备液用pbs稀释成一定浓度，取1ml稀释好的壳寡糖溶液与1mlli-rv0129c菌悬液等量混合，漩涡振荡混匀30s，室温静置30min。然后13000rpm/min离心2min，弃去上清，再加pbs洗涤一次，最后用1mlpbs重悬。

实施例2.通过细菌活菌计数确定可使用的壳寡糖包被液最大浓度

将壳寡糖储备液用pbs稀释至0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/ml，分别包被li-rv0129c，包被方法同实施例1，最后用1mlpbs重悬，同时做对照，即以等量pbs代替壳寡糖包被液同样操作。将上述各组菌液用pbs进行10倍梯度稀释至10^-6，各梯度取20μl平行双样滴种于bhi平板，37℃培养48小时后计数。计算各组活菌浓度，结果如图1所示，当包被浓度提高到2mg/ml时，li-rv0129c活菌浓度与对照相比有所降低，但降低程度不明显，在1个数量级以内；当包被浓度提高到4mg/ml时，li-rv0129c活菌浓度与对照相比，降低了约两个数量级，表明在该包被浓度下细菌的生长受到了影响，故可使用的壳寡糖包被液最大浓度应不高于2mg/ml。

实施例3.测定不同浓度的壳寡糖包被液包被细菌后的zeta电位

将壳寡糖储备液用pbs稀释至0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/ml，分别包被li-rv0129c，包被方法同实施例1，最后用1mlpbs重悬，同时做对照，即以等量pbs代替壳寡糖包被液同样操作。利用英国马尔文公司的激光粒度及电位分析仪于25℃，90度散射角条件下测定壳寡糖包被后的细菌(cos-li-rv0129c)和li-rv0129c的zeta电位。结果如图2所示，当包被浓度高于0.5mg/ml时，li-rv0129c表面的负电荷逐渐被中和，综合实施例2包被壳寡糖后活菌计数结果和zeta电位测定结果得到最佳壳寡糖包被浓度为2mg/ml。

实施例4.用扫描电子显微镜观察包被了壳寡糖后的细菌的表征

包被方法同实施例1，壳寡糖包被浓度为2mg/ml。取cos-li-rv0129c和li-rv0129c菌液4℃、13000rpm/min离心2分钟，弃去上清，分别加1ml2.5％戊二醛溶液，4℃固定2小时，然后4℃、13000rpm/min离心2分钟，弃去上清，无菌水洗涤3次，依次用体积浓度30％、50％、70％、85％、95％的乙醇溶液依次脱水各10分钟，最后用100％乙醇脱水15分钟，将各组样品滴于盖玻片上，经临界点干燥后于扫描电镜下观察。结果如图3所示，显示壳寡糖已成功包被上li-rv0129c。

实施例5：壳寡糖包被对重组绵羊李斯特菌的免疫增强效果

(1)小鼠免疫

6～8周龄的c57bl/6雌鼠适应性饲养3d后，随机分为4组(每组7只)，第一组为cos-li-rv0129c组(包被方法同实施例1，包被壳寡糖浓度为2mg/ml)，尾静脉接种cos-li-rv0129c；第二组为li-rv0129c组，尾静脉接种li-rv0129c；第三组为pbs组，尾静脉接种pbs；第四组为cos组，尾静脉接种2mg/mlcos溶液。各组接种体积均为100μl。第一组和第二组接种菌液的浓度根据li-rv0129c包被前后对小鼠的半数致死量(ld50)确定，为达到最佳的免疫效果同时又不会引起小鼠死亡，接种菌液浓度设为0.1×ld50，即cos-li-rv0129c为3.7×10⁷cfu/ml，li-rv0129c为6.7×10⁷cfu/ml。

(2)脾细胞悬液制备

小鼠颈椎脱臼处死，体积浓度75％酒精进行表面消毒，无菌操作取脾脏并剔除附着于上的结缔组织，放于装有1mlrpmi1640培养基的试管中，置冰上备用。加5mlrpmi1640培养基(含青霉素100u/ml，链霉素0.1mg/ml)于一个灭菌平板，其中放一张无菌200目尼龙膜，用无菌眼科镊取脾脏放于尼龙膜上，并用尼龙膜将脾脏包裹，用无菌研棒轻研脾脏至其泛白(脾细胞脱落后剩下的被膜及未剔除干净的结缔组织)，用枪头将所有脾细胞悬液收集至灭菌15mlep离心管。

(3)红细胞裂解

脾细胞悬液4℃、1300rpm/min离心5min，弃去上清，震荡离心管，使沉淀在离心管底部的细胞分散，加入4ml经过滤除菌的红细胞裂解液，上下颠倒离心管，静置5分钟后，立即加入4mlrpmi1640培养基(含青霉素100u/ml，链霉素0.1mg/ml)终止裂红反应，4℃、1300rpm/min离心5分钟，弃去上清，震荡离心管，向离心管中加入5mlrpmi1640培养基(含青霉素100u/ml，链霉素0.1mg/ml)，上下颠倒离心管以洗去残余的红细胞裂解液，4℃、1300rpm/min离心5分钟，弃去上清，震荡离心管，重复洗涤一次。震荡离心管后，向离心管中加入2.5ml含体积浓度10％胎牛血清的rpmi1640培养液(10％fbs-1640)重悬，将离心管置于冰上，备用。

(4)脾细胞刺激及染色

吸取50μl脾细胞悬液加入96孔板，分为肽段刺激孔和阴性对照孔，肽段刺激孔加入50μl肽段刺激混合物gp33-41(kavynfatm)，gp61-80(glkgpdiykgvyqfksvefd)，ag85c21-40(dikvqfqgggphavylld)，ag85c81-100(dwyqpsqsngqnytykwetf)，以上肽段均由上海生物工程有限公司合成(每种肽段浓度为0.2μg/ml)，且肽段混合物中含有体积浓度为0.2％的golgistop(bdpharmingen^tm)。阴性对照孔加入50μl10％fbs-1640，5％co237℃培养箱刺激4小时。刺激完毕后，4℃、1300rpm/min离心5分钟，甩弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散；于避光处加入50μl表面抗体：fitcratanti-mousecd3、percpratanti-mousecd4染色液(bdpharmingen^tm)，4℃避光孵育30分钟，孵育结束后，于避光处每孔加入150μl体积浓度2％胎牛血清的pbs终止孵育，4℃、1300rpm/min离心5分钟,甩弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散；于避光处每孔加入100μl固定/通透液cytofix/cytoperm(bdpharmingentm)，4℃避光静置20分钟，孵育结束后，于避光处每孔加入100μl洗涤液permwash(bdpharmingen^tm)，1300rpm/min离心5分钟，甩弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散；于避光处每孔加入200μlpermwash洗涤细胞，1300rpm/min离心5分钟，甩弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散；于避光处加入50μl胞内抗体：peratanti-mouseifn-γ、pe-cytm7ratanti-mousetnf-α染色液(biolegend)，4℃避光孵育45分钟；孵育结束后，于避光处每孔加入150μlpermwash，1300rpm/min离心5分钟，甩弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散；于避光处每孔加入200μlpermwash，洗涤细胞，1300rpm/min离心5分钟，甩弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散；于避光处每孔加入200μlpermwash，重悬细胞；4℃避光保存待检。

(5)上机检测及分析

用流式细胞仪检测样品，用软件flowjo对结果进行分析，用spss软件进行统计分析，p<0.05为差异有统计学意义。结果如图4所示，壳寡糖包被li-rv0129c后，其诱导分泌的ifn-γ、tnf-α均得到了明显提高，值得注意的是，未包被壳寡糖的li-rv0129c诱导分泌的cd8⁺ifn-γ和cd8⁺tnf-α与pbs对照组相比，均无统计学意义。而包被壳寡糖后，其诱导分泌的cd8⁺ifn-γ和cd8⁺tnf-α明显提高且具有统计学意义。结果表明壳寡糖起到了佐剂的作用，包被壳寡糖后li-rv0129c能诱导更高效的细胞因子分泌，尤其是cd8细胞分泌的细胞因子。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。