本发明属于生物医用新材料
技术领域：
，尤其涉及一种基因载体及其制备方法。
背景技术：
：癌症作为威胁人类的生命健康头号杀手，日益受到人们的重视。目前治疗癌症的手段主要有化疗，放疗，外科手术等治疗手段。这些治疗方法虽然在一定程度上能够消除癌症，但是不能从根本上消除癌症，且会导致癌细胞的扩散和转移。基因治疗作为一种全新的治疗手段，有望从根本上治疗癌症。基因治疗需要高效的基因载体。基因载体包括病毒类基因载体和非病毒类基因载体。病毒类基因载体因为在临床应用上存在极大的风险，因此应用受到限制。在非病毒类基因载体中，阳离子型基因载体日益受到人们的关注。pei25k是作为阳离子基因载体的“黄金标准”。pei25k虽然具有较高的转染效率，但是其存在较大的细胞毒性和体内毒性，限制了其在临床上的应用[参见lungwitzu,breunigm,blunkt,gopfericha.polyethylenimine-basednon-viralgenedeliverysystems.eur.j.pharm.biopharm2005；60,247-266.]。因此设计出高转染效率，低细胞毒性的阳离子基因载体逐渐成为研究的热点。[参见j.chen,h.liang,l.lin,z.p.guo,p.j.sun,m.w.chen,h.y.tian,m.x.deng,x.s.chen,goldnanorods-basedgenecarrierswiththecapabilityofphotoacousticimagingandphotothermaltherapy,acsappl.mater.interfaces8(2016)31558-31566.tian,h.y；tang,z.h.；zhuang,x.l.；chen,x.s.；jing,x.b.biodegradablesyntheticpolymers:preparation,functionalizationandbiomedicalapplication.prog.polym.sci.2012,37,237-280.]尽管这些方法能够在一定程度上降低其细胞毒性，但是其制备方法复杂，可重复性差，且转染性能不高。因此，设计出高转染效率低细胞毒性且可重复性的阳离子基因载体显得尤为重要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基因载体及其制备方法，本发明中的基因载体转染效率高、细胞毒性低。本发明提供一种基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和接枝在所述超支化聚乙烯亚胺上的zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物；所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～500)。优选的，所述基因载体具有式1所示结构：优选的，所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600～25000。优选的，所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～500)。本发明提供一种基因载体的制备方法，包括以下步骤：a)将超支化聚乙烯亚胺、zn(no3)2·6h2o和二吡啶胺苯甲醛化合物分别溶于无水甲醇，得到超支化聚乙烯亚胺溶液、zn(no3)2溶液和二吡啶胺苯甲醛溶液；所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～500)。b)将超支化聚乙烯亚胺溶液、zn(no3)2溶液和二吡啶胺苯甲醛溶液混合，进行反应，得到产物溶液；c)将所述产物溶液进行真空浓缩，得到基因载体。优选的，所述超支化聚乙烯亚胺溶液的浓度为0.5～2mg/ml；所述zn(no3)2溶液的浓度为0.5～2mg/ml。优选的，所述二吡啶胺苯甲醛溶液的浓度为0.5～2mg/ml。优选的，所述步骤b)中的反应温度为20～60℃；所述步骤b)中的反应时间为6～18小时。优选的，所述真空浓缩的温度为10～50℃。一种基因载体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述基因载体为上文所述的基因载体；所述基因载体负载的药物为dna和/或rna。本发明提供了一种基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和接枝在所述超支化聚乙烯亚胺上的zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物；所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～500)；所述zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物中，zn2+与二吡啶胺苯甲醛化合物的摩尔比为1:1。本发明是在超支化的聚乙烯亚胺上通过席夫碱键接枝zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物。能够在细胞水平以及体内显著提高载体/dna复合物的转染效率。另外该基因载体体系具有可以忽略的细胞毒性，且制备过程简单，可重复性强，在基因治疗领域有着广泛的应用前景。具体实施方式本发明提供了一种基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和接枝在所述超支化聚乙烯亚胺上的zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物；所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～500)；所述zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物中，zn2+与二吡啶胺苯甲醛化合物的摩尔比为1:1。在本发明中，所述超支化聚乙烯亚胺(pei)的分子量优选为600～25000；所述zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物(zn-dpa)中，zn2+与二吡啶胺苯甲醛化合物的摩尔比为1:1。当所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为600时，所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～20)，具体的，在本发明的实施例中，可以是1:1、1:2、1：5、1:10、1:15或1:20；当所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为2500时，所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(10～500)，具体的，在本发明的实施例中，可以是1:10、1:20、1：50、1:100、1:200、1:300、1:400或1:500。在本发明中，所述基因载体具有式1所示结构：其中，m、n和x的取值范围根据原料的投料比确定。pei-zn-dpa作为dna的阳离子型基因载体，以质粒dna为例，运用于多种细胞系，例如，mcf-7，hela，b16f10，293t，293f，293s，ct26，be(2)c，cho，cho-s，cos7，cos-7l，cv-1，hek-293，ht-1080，mdck，nih-3t3，skbr3，vero等。pei-zn-dpa作为rna的阳离子载体，以sirna为例，运用于目前各种细胞系，例如，huh-7,ct26，b16f10,mcf-7,hela，293t，293f，293s，be(2)c，cho，cho-s，cos7，cos-7l，cv-1，hek-293，ht-1080，mdck，nih-3t3，skbr3，vero等细胞。本发明还提供了一种基因载体的制备方法，包括以下步骤：a)将超支化聚乙烯亚胺、zn(no3)2·6h2o和二吡啶胺苯甲醛化合物分别溶于无水甲醇，得到超支化聚乙烯亚胺溶液、zn(no3)2溶液和二吡啶胺苯甲醛溶液；所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～500)。b)将超支化聚乙烯亚胺溶液、zn(no3)2溶液和二吡啶胺苯甲醛溶液混合，进行反应，得到产物溶液；c)将所述产物溶液进行真空浓缩，得到基因载体。在本发明中，所述基因载体的制备流程如式2所示：在本发明中，所述超支化聚乙烯亚胺、zn(no3)2·6h2o和二吡啶胺苯甲醛化合物的用量与上文中超支化聚乙烯亚胺、zn(no3)2·6h2o和二吡啶胺苯甲醛化合物的用量一致，在此不再赘述。在本发明中，所述超支化聚乙烯亚胺溶液的浓度为0.5～2mg/ml，优选为1mg/ml；所述zn(no3)2溶液的浓度为0.5～2mg/ml，优选为1mg/ml；所述二吡啶胺苯甲醛溶液的浓度0.5～2mg/ml，优选为1mg/ml。所述反应的温度优选为20～60℃，更优选为30～50℃，最优选为40℃；所述反应的时间优选为6～18小时，更优选为8～15小时，最优选为10～12小时。所述真空浓缩采用旋转蒸发仪进行，去除产物溶液中的甲醇溶剂，所述旋转蒸发仪的量程为-0.1～0mpa。所述真空浓缩的温度优选为10～50℃，更优选为20～40℃，最优选为30℃。完成所述真空浓缩后，对真空浓缩后的产品进行真空抽干，得到基因载体。本发明对所述真空抽干没有特殊的限制，采用本领域中常用的真空抽干的方法即可。本发明还提供了一种基因载体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述基因载体为上文所述的基因载体，所述基因载体负载的药物为dna和/或rna。本发明提供了一种基因载体，包括超支化聚乙烯亚胺和接枝在所述超支化聚乙烯亚胺上的zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物；所述超支化聚乙烯亚胺与zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物摩尔比为1：(1～500)；所述zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物中，zn2+与二吡啶胺苯甲醛化合物的摩尔比为1:1。本发明是在超支化的聚乙烯亚胺上通过席夫碱键接枝zn2+配位的二吡啶胺苯甲醛化合物。能够在细胞水平以及体内显著提高载体/dna复合物的转染效率。另外该基因载体体系具有可以忽略的细胞毒性，且制备过程简单，可重复性强，在基因治疗领域有着广泛的应用前景。为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种基因载体及其制备方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。实施例1pei-zn-dpa的制备将pei、zn(no3)2·6h2o、二吡啶胺苯甲醛化合物(dpa)分别溶于无水甲醇中。根据设计的摩尔比例(见表1)将三种反应物溶液混合，在40℃下反应12h，将反应后的产物在30℃下真空浓缩除去甲醇溶剂，真空抽干，得到基因载体。表1原料的摩尔比与载体材料编号的对应关系实施例2pei-zn-dpa作为pegfpn1(绿色荧光蛋白质粒)和pgl3(荧光素酶质粒)载体的用法，步骤和条件如下:(1)细胞培养将细胞培养在含10％体积分数的胎牛血清培养液中，细胞在设定温度为37℃、体积分数为5％的二氧化碳的恒温培养箱中培养。(2)细胞转染在转染前24h，取对数生长期细胞，胰酶消化后用含体积分数10％的胎牛血清培养液稀释，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、含体积分数5％的co2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80～90％。转染时，将载体/pdna复合物复合20min后，按照0.2μgpdna/孔加入到96孔细胞板中，继续培养48小时。(3)细胞转染效率的测定a)荧光素酶活性检测从培养箱中取出细胞培养板，移除细胞培养液，用pbs洗涤2次，加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min，然后每孔加入一定量的荧光素酶底物，通过光度计定量测定细胞转染效率。结果列于表2。b)绿色荧光蛋白(gfp)的表达在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白信号。能够转染的阳性细胞能够产生绿色荧光，而不能转染的细胞就不会产生绿色荧光。可以用流式细胞仪(flowcytometry)检测转染阳性细胞的百分比。结果列于表3。(4)细胞毒性的检测(mtt)采用四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝)比色法进行阳离子载体/pdna复合物的细胞毒性评价。在转染前2小时，取对数生长期细胞，胰酶消化后用含体积分数10％的胎牛血清培养液稀释，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、含体积分数5％的co2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80～90％。将不同浓度的阳离子载体材料和细胞进行共培养24小时，然后在每孔中加入20μl噻唑蓝溶液(质量分数0.5％)，在37℃下继续培养4小时，然后吸出培养液，往其中每孔加入200μldmso,通过酶标仪检测培养板每孔的吸收，检测的波长选为490nm。细胞的存活率按如下公式：细胞存活率(％)＝(asample/acontrol)×100asample是转染后的细胞样品孔的吸收，acontrol是不加材料组样品孔的吸收，每组实验重复三次。结果列于表4。表2pei-zn-dpa介导荧光素酶质粒的体外转染效率表3pei-zn-dpa介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率载体材料编号转染效率载体与dna的质量比pei600-zn-dpa-121％10:1pei600-zn-dpa-234％10:1pei600-zn-dpa-348％10:1pei600-zn-dpa-434％10:1pei600-zn-dpa-524％10:1pei600-zn-dpa-616％10:1pei25k-zn-dpa-143％5:1pei25k-zn-dpa-247％5:1pei25k-zn-dpa-356％5:1pei25k-zn-dpa-452％5:1pei25k-zn-dpa-549％5:1pei25k-zn-dpa-646％5:1pei25k-zn-dpa-743％10:1pei25k-zn-dpa-841％10:1pei6009％20:1pei1.8k13％10:1pei25k36％2.5:1表4pei-zn-dpa/pdna复合物的细胞存活率实施例3pei-zn-dpa作为rna的阳离子载体，以sirna为例，运用于目前各种细胞系(例如，huh-7,ct26，b16f10,mcf-7,hela，293t，293f，293s，be(2)c，cho，cho-s，cos7，cos-7l，cv-1，hek-293，ht-1080，mdck，nih-3t3，skbr3，vero等细胞)，步骤和相关条件如下所示：(1)通过常规方法我们合成sirna，该sirna的序列为5’-cuuacgcugaguacuucgadtdt-3’，能够沉默荧光素酶的sirna。(2)细胞的培养将细胞置于含体积分数10％的胎牛血清培养液中，在培养温度37℃下体积分数为5％的co2的恒温箱中连续培养。(3)细胞转染在转染前24h，取对数生长期细胞，胰酶消化后用含体积分数10％的胎牛血清培养液稀释，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、含体积分数5％的co2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80～90％。转染时，将载体/sirna复合物复合20min后，按照0.2μgsirna/孔加入到96孔细胞板中，继续培养48小时。(4)细胞转染效率的测定从培养箱中取出细胞培养板，移除细胞培养液，用pbs洗涤2次，加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min，然后每孔加入一定量的荧光素酶底物，通过光度计定量测定细胞转染效率。结果列于表5(5)细胞毒性的检测(mtt)采用四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝)比色法进行阳离子载体/sirna复合物的细胞毒性评价。在转染前2小时，取对数生长期细胞，胰酶消化后用含体积分数10％的胎牛血清培养液稀释，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、含体积分数5％的co2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80～90％。将不同浓度的阳离子载体材料和细胞进行共培养24小时，然后在每孔中加入20μl噻唑蓝溶液(质量分数0.5％)，在37℃下继续培养4小时，然后吸出培养液，往其中每孔加入200μldmso,通过酶标仪检测培养板每孔的吸收，检测的波长选为490nm。细胞的存活率按如下公式：细胞存活率(％)＝(asample/acontrol)×100asample是转染后的细胞样品孔的吸收，acontrol是不加材料组样品孔的吸收，每组实验重复三次。结果列于表6。表5pei-zn-dpa介导沉默荧光素酶的lucsirna的体外沉默效率表6pei-zn-dpa/sirna复合物的细胞存活率载体材料编号细胞存活率载体与pdna质量比pei600-zn-dpa-194％10:1pei600-zn-dpa-296％10:1pei600-zn-dpa-394％10:1pei600-zn-dpa-495％10:1pei600-zn-dpa-596％10:1pei600-zn-dpa-694％10:1pei25k-zn-dpa-193％5:1pei25k-zn-dpa-292％5:1pei25k-zn-dpa-394％5:1pei25k-zn-dpa-495％5:1pei25k-zn-dpa-593％5:1pei25k-zn-dpa-694％5:1pei25k-zn-dpa-792％10:1pei25k-zn-dpa-893％10:1pei60098％20:1pei1.8k94％10:1pei25k90％2.5:1实施例4pei-zn-dpa在体内pdna体内转染的应用(1)细胞培养将ct26细胞置于含有10％的胎牛血清培养液中，在含体积分数为5％(体积分数)co2、温度为37℃的恒温箱中培养。(2)肿瘤接种购买周龄5-6周的体重20g左右的balb/c小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的ct26细胞，用胰蛋白酶消化，然后用细胞培养液混合胰蛋白酶，1×103rpm离心5min，pbs洗涤三次，用pbs悬浮细胞。按每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下，大约7天后，小鼠平均瘤径长到7mm时进行体内转染。(3)体内转染将表达荧光素酶的质粒dna作为转染基因，按照每只小鼠pdna用量20μg，将载体/pdna复合物的生理盐水溶液200μl尾静脉注射小鼠体内。(4)体内转染效率效率的测定在进行48h的体内转染后，处死balb/c鼠，取出各组肿瘤，用pbs洗涤2次，组织裂解液进行裂解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。结果列于表7。表7pei-zn-dpa介导的荧光素酶质粒在体内的转染实施例5pei-zn-dpa在体内sirna转染的应用(1)mcf-7细胞的培养将mcf-7细胞置于含有10％的胎牛血清培养液中，在含体积分数为5％的co2、温度为37℃的恒温箱中培养。(2)肿瘤接种购买周龄5-6周的体重20g左右的balb/c小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的mcf-7细胞，用胰蛋白酶消化，然后用细胞培养液混合胰蛋白酶，1×103rpm离心5min，pbs洗涤三次，用pbs悬浮细胞。按每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下。7天后，瘤径平均长大至7mm时进行sirna体内的转染。(3)体内转染基因选用能够表达能够沉默肿瘤血管内皮生长因子的shvegf(通过抑制vegf蛋白的表达来抑制肿瘤生长)，按照每只小鼠的shvegf用量20ug，载体/shvegf复合物的生理盐水溶液体积200μl尾静脉注射小鼠体内，每隔一天给一次药，给药14天。(4)小鼠肿瘤生长的测定在小鼠第一次给药开始，每天测量小鼠肿瘤大小以及体重的变化。表8pei-zn-dpa介导shvegf在体内转染后的瘤径大小有益效果：本发明提供的pei-zn-dpa作为高转染效率、低细胞毒性的阳离子基因载体。pei-zn-dpa担载的pgl3质粒在细胞中的最佳转染效率比pei1.8k高出100多倍，且比商业化pei25k的最佳转染效率还高。在最佳转染效率的比例时，其细胞存活率达到90％以上；pei-zn-dpa的基因沉默效率高，对恒定表达荧光素酶的huh-7luc细胞的基因沉默效率最高可达为56％，高于pei25k的最佳沉默效率的36％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12