本发明涉及一种神经损伤部位填充材料，特别涉及一种神经损伤部位填充材料的组成、制备及其用途。
背景技术：
因各种原因导致的神经损伤是一种神经系统的常见疾病，包括脊髓损伤、周围神经损伤等，会导致该神经支配的区域出现感运动障碍、营养障碍等，严重影响患者生活质量。针对严重的脊髓损伤或周围神经损伤，目前临床缺乏有效的治疗方案。
有研究表明，一些细胞生长因子可以促进在损伤神经的修复，恢复神经损伤部位及周围神经间的信号传递。但是这些细胞生长因子的体内半衰期短和生物膜穿透能力差，无论全身还是局部给药，都存在损伤部位的药物浓度低、滞留时间短等缺陷。
神经损伤部位直接注射细胞生长因子类药物是组织工程中最常见的治疗方式。但缺乏适宜的载体，细胞生长因子容易流失，很难维持其生物活性和疗效，由于缺乏合适的制剂载体，细胞生长因子类药物在神经损伤治疗中的应用受到限制。
从临床应用角度出发，理想的神经损伤部位填充材料首先应满足免疫源性低、生物相容性好的要求。其次，从生物治疗学的角度来讲，理想的神经损伤部位填充材料应同时提供神经传导基质、神经诱导因子及神经生成细胞等三大因素，即：神经移植应能实现神经传导、神经诱导和神经生成三项功能。此外，从材料持久性角度考虑，神经移植材料还应保证4周左右的降解速度，以保证髓鞘结构的修复和神经轴突定向生长对接的时间需要，太短和太长的降解时间都不利于神经的修复。
目前尚缺乏一种能够同时满足以上要求的理想神经损伤部位填充材料。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术免疫源性高的缺点和不足，提供一种免疫源性低且具备神经传导、神经诱导、神经生成和力学支持多项功能的新型神经损伤部位填充材料，为神经再生提供最佳的理化和生物学微环境，有效引导神经轴突定向生长，具有良好的降解速度，实现损伤神经的高效修复。
申请人发现，现有的神经损伤部位填充材料均具有较强免疫源性，容易引起神经损伤部位的炎症和纤维化，即使炎症消退了，神经损伤部位也会出现严重的纤维包绕问题，从而阻塞微血管的生成和神经轴突定向生长，导致神经损伤部位愈合慢。为了解决这个问题，申请人经过大量研究，白芨中具有多种成分，但只有白芨多糖具有最佳神经修复作用。申请人通过氨基化修饰，制备氨基化白芨多糖，可以与甘油醛交联形成力学性质良好的凝胶，不仅没有已报道的醛基交联剂的毒性，还具有很好的生物相容性，不会引起机体的免疫反应，充分发挥白芨多糖的促进微血管再生、神经轴突定向生长、改善局部微环境等作用。此外，申请人发现肝素修饰的泊洛沙姆凝胶具有多重特点，包括：肝素的抗血栓、抗疤痕和抗纤维化的作用；保证肝素高亲和性细胞因子的缓慢释放和长效作用；保持泊洛沙姆的温敏型水凝胶性质，在体温时形成弹性好的固体凝胶，从而保证肝素高亲和性细胞因子不流失等。此外，神经去细胞基质免疫源性低，包含很多营养因子，可以为神经损伤修复提供良好的营养和空间微环境。本发明的神经损伤部位填充材料维持4周时间，满足髓鞘结构的修复和神经轴突定向生长对接的时间需要。
因此，本申请保护的一种神经损伤部位填充材料，该填充材料是由氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、神经去细胞基质组成，通过改变组分配比，控制神经损伤部位填充材料的力学强度和降解速度。
上述的神经损伤部位填充材料，其特征在于：所述的填充材料中氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶的质量百分含量为10％-20％、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素-泊洛沙姆凝胶的质量百分含量为40％-60％、神经去细胞基质的质量百分含量为20％-40％。
上述的神经损伤部位填充材料，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子选自：转化生长因子、胰岛素样生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子中的一种或几种组合。
上述的神经损伤部位填充材料，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞因子在肝素-泊洛沙姆凝胶中的质量百分含量为0.001％～0.1％。
上述的神经损伤部位填充材料，其特征是：所述的神经去细胞基质优选同种动物的脊髓去细胞基质。
上述的神经损伤部位填充材料，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子优选神经生长因子。
一种上述神经损伤部位填充材料的制备方法：将神经去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶，混匀形成均匀的半固体凝胶。
另一种上述神经损伤部位填充材料的制备方法：将神经去细胞基质粉碎，与氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀形成均匀的半固体凝胶。
上述的神经损伤部位填充材料的制备过程中进一步加入用于药学常用的ph缓冲液、抗氧剂、表面活性剂。
上述的神经损伤部位填充材料，其特征是：所述的神经损伤部位填充材料用于神经组织缺损部位的修复。
与现有技术相比，本发明的神经损伤部位填充材料发挥“氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、神经去细胞基质”各组分的优势，实现优势互补，在保证免疫源性低的前提下为神经再生提供最佳的力学和生物学微环境，具体包括：①氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶，提供良好的免疫微环境，降低神经损伤部位填充材料的免疫源性，同时保证填充材料的力学性能，提供神经损伤部位所需的力学强度。②包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，具有引导和促进损伤神经快速修复的多重优点，包括：防止神经损伤部位的纤维形成、体温时形成弹性好的固体凝胶保证肝素高亲和性细胞因子不流失、保证肝素高亲和性细胞因子的缓慢释放和长效作用。③神经去细胞基质，提供成神经细胞生长所需的各种养分。④本发明的神经损伤部位填充材料维持4周时间，满足神经修复的时间。⑤本申请保护的技术方案中各组分是协同互补和必要的关系，共同发挥作用。
具体实施方式
下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1神经损伤部位填充材料的制备
制备方法1：按照表1的神经损伤部位填充材料各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法将神经去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶，混匀，形成均匀的半固体凝胶。
制备方法2：按照表1的神经损伤部位填充材料各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法将神经去细胞基质粉碎，与氨基化白芨多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀，形成均匀的半固体凝胶。
各对照组的制备参照实验组的制备方法进行。
表1神经损伤部位填充材料各实验组的组成
注：“神经去细胞基质”项下括号内的动物是指神经去细胞基质的来源动物；ngf：神经生长因子；vegf：血管内皮生长因子；igf：胰岛素样生长因子；kgf：角质细胞生长因子；tgf：转化生长因子；bfgf：碱性成纤维细胞因子；egf：表皮生长因子。
表2神经损伤部位填充材料各对照组的组成
注：vegf代表血管内皮生长因子；各列括号内的材料是指该类材料的来源；英文缩写的生长因子全称见表1的注解。
实施例2在体评价各组神经损伤部位填充材料应用效果
(1)大鼠中枢神经损伤模型
220-250gsd雌性大鼠经检查无瘫痪以及行动不便后，戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，待麻醉起效后，肌肉内注射头孢銼林钠(按5-10mg/100g)，背部剃毛、俯卧位固定，皮肤用碘伏消毒；大鼠取俯卧位，固定于大鼠脊突固定架，胸背部剃毛备皮，进行常规消毒。以t9为中心，作背部正中切口，长约3cm。切开皮肤和肌肉，暴露位于第8到第9胸椎(t8-t9)和第9到第10胸椎(t9-t10)，咬除t9及部分t9-t10棘突和椎板，完全暴露脊髓背侧面。采用虹膜刀片精确切除t9段右半段脊髓长度为3mm，用肾上腺素庆大霉素盐水清洗创面，仔细止血后，去除组织和血块后缝合肌层与皮肤，术后动物均给与皮下注射1ml生理盐水，加热垫维持动物体温在36-37℃，直至动物完全苏醒。
(2)各组填充材料的体内应用效果
应用以上建立好的大鼠中枢神经损伤模型，将各组填充材料注射在神经损伤部位，然后缝合，包扎，第3、7、14、21、28、35天对各实验组大鼠进行运动功能学评分通过micro-ct影像观察对比各组神经损伤部位的神经重建和微血管形成情况，并进行以下评价。
①对神经损伤部位组织的断面切片
分离取出神经损伤部位的组织，固定于4％多聚甲醛24小时，继而进行脱钙、脱水和石蜡包埋，包埋的神经组织以5μm厚度连续切片。
②神经组织的免疫原性指标检测
填充材料应用后的第1天、第3天、第7天、第14天，检测神经损伤部位周围组织中炎症因子il-6、tnf-α等的表达，观察不同组填充材料的免疫原性。
③对神经损伤部位修复的治疗效果
将神经组织的病理切片通过he染色、tunel细胞凋亡、免疫组化方法，测定神经组织修复效果；应用透射电镜(tem)观察切取各实验组神经髓鞘微观形态，比较不同组填充材料应用效果。
基于以上结果，采用双盲法评价各组填充材料的应用效果，给出综合评分(满分10分)，分数越高代表综合效果越好。
实验结果：神经损伤部位填充材料的实验结果见表3。从表3数据可见，各个实验组在体内免疫原性良好，神经损伤部位的免疫原性、髓鞘结构、材料持久性、神经元修复效果等指标良好，验证了实验组对于神经损伤部位具有良好修复效果。各对照组中，免疫原性、髓鞘结构、材料持久性、神经损伤部位的修复效果等指标很差，综合评分明显低于实验组结果，大部分对照组应用后髓鞘出现变性、神经元中线粒体结构出现肿胀、髓鞘排列方向性差、板层结构不清晰、板层排列松散、轴索内微丝和微管少。由上可知，各实验组对于损伤神经具有良好的修复效果，可以作为神经损伤部位的填充材料。
表3各组神经损伤部位填充材料的应用效果
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。