一种去细胞神经移植物及其制备方法与流程

本发明设计医用生物材料，特别涉及一种联合化学和物理方法制备的去细胞神经移植物及其制备方法。

背景技术：

周围神经损伤以及损伤所致的神经缺损是在临床工作中常见的疾病，其不但对患者的生活造成了严重的影响，同时带来了巨大的社会经济负担。对于存在缺损的周围神经损伤，在无法进行减张缝合的情况下，自体神经移植仍是治疗的金标准。然而自体神经来源有限，且对患者造成二次损伤，故对于较长距离的神经损伤，组织工程神经和去细胞神经移植物的应用是一种趋势。

目前应用于修复神经损伤的组织工程神经移植物仍以管腔中空的导管为主，无法精确模仿正常神经的三维空间结构及各组分比例。去细胞神经支架在保留天然神经三维结构的同时，去除了细胞、髓鞘和轴突等成分，显示出良好的临床应用前景，然而同种异体去细胞神经的来源仍相对有限。因此，研究者将目光转向了异种去细胞神经支架，为了获得符合临床应用标准的异种去细胞神经支架，需对粗大神经的去细胞方法进行探索。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种去细胞神经移植物，其为去除了细胞、髓鞘、轴突及脂肪等成分的异种神经移植物。

本发明的另一个目的是提供联合化学和物理方法的一种去细胞神经移植物的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种去细胞神经移植物，为一种去细胞异种神经支架，含有可引导神经再生的保存完好的神经纤维神经基底膜管的三维取向性结构，该结构去除了引起免疫反应的细胞、髓鞘、轴突及脂肪的成分。

一种去细胞神经移植物的制备方法，步骤包括：

在无菌条件下获得哺乳动物周围神经，并在无菌条件下剥离并剔除神经周围的脂肪和结缔组织；

将经上述处理后的神经反复冻融处理，再采用化学萃取和超声联合的方法进行去细胞，经生理盐水清洗后加入脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶溶液，获得初始去细胞神经移植物；

对上述初始去细胞神经移植物进行冷冻燥，再进行超临界二氧化碳萃取脂肪处理，经灭菌处理后得到去细胞神经移植物。

进一步地，所述哺乳动物周围神经包括坐骨神经、胫神经、尺神经、面神经；优选地，选用成年约克猪的坐骨神经。

进一步地，所述冻融处理的方法为将处理后的神经反复冻融1-5次，每次于-20℃至-80℃下冷冻0.5-24h，恢复室温下处理1-24h；优选地，反复冻融3次，每次于-80℃下冷冻3h，恢复室温下处理1h。

进一步地，所述化学萃取的方法为将经过处理的神经在0-8℃下用0.1％-5％十二烷基磺酸钠(sds)萃取液于定轨摇床中震荡处理12-96h；优选地，在4℃条件下用0.5％的十二烷基磺酸钠(sds)萃取液于定轨摇床中震荡处理48h。

进一步地，所述超声的方法为将经过处理的神经在0-8℃下于超声仪中间歇处理1-20次，每次1-10min，频率为1000-80000hz；优选地，在4℃条件下于超声仪中间歇处理3次，每次3min，频率为50000hz。

进一步地，所述生理盐水清洗的方法为将去细胞后的神经在0-8℃下用无菌生理盐水于定轨摇床中震荡清洗24-120h，每隔4-20h更换一次生理盐水；优选地，在4℃下用无菌生理盐水于定轨摇床中震荡清洗60h，每隔6h更换一次生理盐水。

进一步地，将生理盐水清洗后的神经用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶溶液于37℃下处理2h以上，再重复用生理盐水进行清洗；优选地，用60u/ml的脱氧核糖核酸酶和2u/ml的核糖核酸酶溶液于37℃条件下处理5h。

进一步地，所述冷冻燥的方法为将初始去细胞神经移植物于-20℃预冷2-24h，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥12-96h；优选地，于-20℃预冷5h，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h。

进一步地，所述超临界二氧化碳萃取脂肪处理是指在超临界二氧化碳萃取仪中于-5-65℃和1-6mpa下进行脂肪萃取处理1-8h；优选地，在超临界二氧化碳萃取仪中于30℃和5.5mpa下进行脂肪萃取处理5h。

进一步地，所述灭菌处理的方法为进行剂量为15-20kgy的钴60产生的γ射线辐照灭菌处理后真空无菌包装；优选地，剂量选用20kgy。

本发明中所用到的试剂十二烷基磺酸钠(sds)、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，装置超声仪均能通过商业途径购买得到，物理萃取设备超临界萃取小试实验装置为大连卓尔超临界实验室提供。

本发明方法制备的去细胞异种神经移植物可以直接进行钴60(15-20kgy)产生的γ射线辐照灭菌处理后真空无菌包装；也可以将其储存于等渗液体中，封装后采用钴60(15-20kgy)产生的γ射线辐照灭菌处理，4℃条件下保存备用。

本发明采用联合化学和物理方法(即上述的化学萃取和超声联合的方法)去除细胞，并利用超临界二氧化碳萃取仪萃取脂肪处理，组织学染色切片显示，所制备的去细胞异种神经移植物去除了细胞、髓鞘和轴突等成分，气相色谱质谱联用仪测试结果显示粗大神经的脂肪成分得到了去除，同时含有可以引导神经再生的保存完好的神经纤维神经基底膜管的三维取向性结构，为周围神经轴突的再生通过缺损区提供了完整的再生支架。

由于本发明制备的去细胞异种神经移植物含有可以引导神经再生的保存完好的神经纤维神经基底膜管的三维取向性结构，同时引起免疫反应的细胞成分、髓鞘、轴突和脂肪等成分得到完全去除，与常规的同种异体去细胞神经移植物相比，适用于修复不同部位的周围神经缺损，可对周围神经缺损的各种尺寸进行精确匹配，且来源广泛，容易获得，是一种非常有前景的医用神经移植物。本发明方法适用于制备狗、羊、猪、猴和人等大型哺乳动物周围神经(坐骨神经、胫神经、尺神经和面神经等)去细胞异种神经移植物，以满足科研和临床治疗的需求。本发明制备的去细胞异种神经移植物可以作为支架材料，与各种类的神经营养因子以及细胞联合使用，可以取得较为满意的神经移植手术效果。

附图说明

图1为实施例1中在无菌条件下获取的成年约克猪坐骨神经的气相色谱图。

图2为实施例1中在无菌条件下获取的成年约克猪的坐骨神经。

图3为实施例1中在无菌条件下获取的成年约克猪的坐骨神经的横切面he染色切片。

图4为实施例1中通过本发明联合化学和物理方法去除细胞并利用超临界二氧化碳萃取仪萃取脂肪处理获得的去细胞神经移植物的横切面he染色切片。

图5为实施例1中通过本发明联合化学和物理方法去除细胞并利用超临界二氧化碳萃取仪萃取脂肪处理获得的去细胞神经移植物的横切面扫描电镜照片。

图6为实施例1中通过本发明联合化学和物理方法去除细胞并利用超临界二氧化碳萃取仪萃取脂肪处理获得的去细胞神经移植物的横切面扫描电镜照片的局部放大图。

图7为实施例1中通过本发明联合化学和物理方法去除细胞并利用超临界二氧化碳萃取仪萃取脂肪处理获得的去细胞神经移植物的气相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合所附图作详细说明如下。

本实施例提供一种具体的去细胞神经移植物的制备方法，具体如下：

1.材料来源：猪坐骨神经。

2.去细胞神经移植物制备流程：

1)无菌条件下获得哺乳动物成年约克猪的坐骨神经，在显微镜下剥离并剔除神经周围的脂肪和结缔组织。

2)将无菌条件下剥离并剔除周围的脂肪和结缔组织的神经，在无菌单上进行拍照记录，如图2所示；将获取的神经剪碎后用乙醇溶解，于气相色谱质谱联用仪中获取其气相色谱图，如图1所示为在无菌条件下获取的成年约克猪坐骨神经37种脂肪酸的气相色谱图，可以看到各种脂肪酸的相对丰度及波峰位置；做横行冰冻切片，片厚7μm，常规固定后行he染色切片，在显微镜下观察，如图3所示在无菌条件下获取的成年约克猪的坐骨神经的横切面he染色切片图，可以看到约克猪坐骨神经的多束状神经结构。

3)将无菌条件下剥离并剔除神经周围的脂肪和结缔组织于-80℃条件下冷冻3h，恢复室温1h，反复冻融3次。

4)将神经在4℃条件下用0.5％的十二烷基磺酸钠(sds)萃取液于定轨摇床中震荡处理48h。

5)将神经在4℃条件下于超声仪中间歇处理3次，每次3min，频率为50000hz。

6)将获取的神经在4℃条件下用无菌生理盐水于定轨摇床中震荡清洗60h，每隔6h更换一次生理盐水。

7)将获取的神经用60u/ml的脱氧核糖核酸酶和2u/ml的核糖核酸酶溶液于37℃条件下处理5h。

8)将获取的神经重复步骤6)；

9)将获取的神经于-20℃预冷5h，然后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h。

10)将获取的神经在超临界二氧化碳萃取仪中于30℃和5.5mpa下进行脂肪萃取处理5h。

11)将得到多孔状连续的去细胞神经支架进行剂量为20kgy钴60产生的γ射线辐照灭菌处理后真空无菌包装，得到最终的去细胞神经移植物。

12)将得到的去细胞神经移植物于生理盐水中处理5h，然后将神经进行常规固定，脱水，包埋，石蜡切片，厚片7μm，常规脱蜡后行he染色切片，在显微镜下观察，如图4所示，与图3相比，可以看到细胞核结构得到了完整的去除，神经空间结构保存良好。

13)将得到的去细胞神经移植物于生理盐水中处理5h，再于-20℃预冷5h，然后将其置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h，用一次性手术刀片在神经中部进行横行离断，常规喷金处理后在扫描电子显微镜下行拍照记录，如图5和图6所示，可以看到引导神经再生的保存完好的神经纤维神经基底膜管的三维取向性结构；将获取的神经剪碎后用乙醇溶解，于气相色谱质谱联用仪中获取其气相色谱图，如图7所示，与图1相比，可以看到部分对应脂肪酸的相对丰度有所降低。

综上所述，依据切片和扫描电镜的结果，本实施例所制备的去细胞神经移植物彻底去除了细胞、髓鞘和轴突等成分，同时具有保存完好的神经纤维神经基底膜管的三维取向性结构；同时具有免疫原性的脂肪成分去除率达到40％。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，本领域的普通技术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，本发明的保护范围应以权利要求书所述为准。