一种具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物医学修复重建技术领域，具体涉及一种具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料及其制备方法与应用。

背景技术：

骨骼作为人体重要器官，由于各种原因常造成骨大面积缺损，如：外伤、肿瘤、感染等，靠自我修复难度很大，常造成骨折处或骨缺损的延长愈合甚至不愈合。这是临床骨科医生面临非常棘手的问题。脊柱融合术是一种临床常见手术，用于治疗因退行性改变、外伤等原因引起的脊椎不稳、滑脱以及脊柱畸形、肿瘤等疾病，通过使局部上、下节段形成骨性融合来重建脊椎力学稳定性。仅美国，每年就有超过25万例患者行脊柱融合手术，由于植骨材料不同等因素融合失败率在5～35％。自体骨移植是植骨融合术的金标准，但它也有不足：骨来源有限，取骨手术带来的二次伤害及并发症，获取的骨形态、数量等不能满足治疗要求。相对自体骨异体骨来源更丰富，但异体骨可引起免疫排斥反应和一些疾病的传播等问题。

理想复合材料应具有成骨诱导作用，因此在支架材料表面荷载成骨诱导因子使其具备成骨活性已成为研究理想复合材料的重要方向。semenza等在1992年发现了低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor-1α，hif-1α)，hif-1α在耦联血管新生和骨生成中发挥关键作用。hif-1α能够调控多种基因共同表达，在骨缺损部位诱导生理功能完整的新血管生成，为基质干细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证。dmog(二甲基乙二酸甘氨酸)和dfo(去铁胺)是一种稳定hif-1α的“低氧模拟剂”，通过抑制脯氨酸羟化酶的活性，使hif-1α在正常氧分压条件下不被降解，而激活其下游基因如vegf等的表达。研究发现dmog通过促进成骨分化进而加快骨缺损愈合。有研究报道，生物玻璃与胶原等支架材料复合“低氧模拟剂”如dmog或去铁胺(desferrioxamine，dfo)能促进mscs的成骨分化及骨组织再生。

脱钙骨基质(dbm)是一种是由胶原蛋白、非胶原蛋白以及较低浓度的生长因子(如骨形成蛋白，骨中的骨形成蛋白被致密的矿物成份包绕，未脱钙骨无诱导成骨能力，脱钙程度不同对应的机械强度也不同)等组成的复合物天然骨移植材料，主要来源于人或动物(猪、牛、狗、兔等)的颅骨、股骨干和胫骨干，具有良好的生物学特性、骨诱导性和骨传导性，可生物降解，促进新骨形成及骨组织矿化，加速骨愈合，可以单独或与自体骨、其它生物材料、生长因子联合有效修复骨损伤，是比较理想的骨组织工程支架材料。dbm在诱导成骨过程中起实质性作用的是骨形成蛋白和其它生长因子。由于其来源于新鲜同种异体骨或异种骨，容易引起的免疫排斥反应，是移植失败的主要原因，因此需要对其进行降抗原处理。它把同种异体骨和异种骨移植推到了一个新的历史阶段。脱钙骨基质的抗原性与骨诱导性具有共同的物质基础，在消除抗原性的同时也破坏了诱导成骨物质。为解决这一问题，研究者们致力于将脱钙骨基质与成骨活性物质复合再移植。

为了能最有效传递骨生长因子，载体材料和成骨活性物质的复合方式也很重要。固定在载体材料上的方法包括非共价固定法(物理包容、表面吸附和离子络合等)和共价固定法(化学交联等)。物理包容、物理吸附是经常应用于生长因子与脱钙骨的附着。例如，利用浸渍法将生长因子固定于脱钙骨上是一种常用的方法。这种方法的特点是操作简单，不易导致污染，对设备、仪器的要求不高。但附着的促骨形成物质数量有限，附着率低且存在“突释”的缺点，发挥作用时间短。浸渍法和真空吸附法在近几年得到了广泛的研究。这种被动吸附的方法虽然操作简单，但生长因子会发生构象的变化从而导致其变性失活。共价固定法是利用生长因子或化合物表面存在的可供利用的化学基团，选择性地利用生长因子或化合物表面远离活性位点的特定稀有基团进行反应，具有结合牢固、稳定性佳的特点。

据报道，开放性骨折感染率较高，gustillo-andersonⅰ型损伤的患者有约0～2％的发生感染，ⅱ型的有2～5％，ⅲa型的有5～10％，ⅲb型的有10～50％，ⅲc型有25～50％，其中ⅲ型的胫骨骨折感染率最高，约占6～39％。1970年buchholz和engelbrecht首先报告了包容抗生素聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥的有效性。wahlig等证实抗生素珠链在局部释放抗生素浓度200倍于全身应用抗生素，这种浓度可能使常规药敏试验耐药的细菌被杀灭。目前，季铵盐类聚合物由于具有良好的抗菌效果受到研究者的广泛关注。季铵盐类聚合物带有较强的正电荷和一定长度的烷基链，与细菌接触时，能够扰乱细菌呼吸链的电子传递过程，破坏细菌细胞膜的完整性，导致细胞内容物外泄，从而导致细菌的死亡。通过在支架材料表面引入具有抗菌功能聚合物的方法，可以构建接触型抗菌的功能化表面。

鉴于此，本发明通过对载体材料、活性物质与载体材料的复合方式进行选择，研发出一种新型的具有促骨生长和抗菌双功能的植骨材料。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的问题，本发明实施例的目的在于提供一种具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明实施例的第一方面提供了一种具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料，在脱钙骨基质表面通过共价键引入聚合物，所述聚合物的侧链通过促骨生长信号分子和季铵盐进行修饰。

本发明实施例的第二方面提供了一种上述的具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料的制备方法，包括以下步骤：

1)在5-20ml的溶剂中，加入1-10ml单体，50-200μl引发剂，20-200mg催化剂，200-500μl配体，20-50℃反应0.5-3小时，透析冻干，得到分子量为5000-15000da的聚合物；

2)将步骤1)得到的聚合物溶于5-20ml溶剂中，加入季铵化反应试剂1-10ml，20-80℃反应6-36小时，透析冻干，得到第一步季铵化后的产物；

3)将步骤2)得到的季铵化后的产物50-300mg加入2-10ml溶剂中，30-120℃反应2-10小时，将聚合物侧链进行功能化，然后减压蒸馏除去溶剂，加入2-10ml溶剂溶解产物，同时加入20-300mg促骨生长信号分子，20-100μl缚酸剂，1-30μl封端剂，室温反应2-24小时，之后加入50-200μl封端剂，室温继续反应2-24小时，透析冻干，得到接上促骨生长信号分子的聚合物；

4)将步骤3)得到的产物溶于1-10ml溶剂中，加入1-10ml季铵化反应试剂，20-120℃反应6-36小时，将剩余的聚合物重复单元季铵化，透析冻干，得到侧链引入促骨生长信号分子和季铵盐的聚合物；

5)在2-20ml的溶剂中加入10-100mg步骤4)得到的聚合物，同时加入交联剂配成体积分数为1％-30％的交联剂溶液，加入100mg脱钙骨基质，室温反应1-10小时，通过形成交联键将聚合物接枝在脱钙骨基质上，之后加入10-100mg还原剂将交联键还原，透析冻干，即可得到具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料。

优选地，所述步骤1)中：所述单体选自甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的任一种；所述引发剂选自芳基磺酰氯、偶氮二异丁氰、2-溴代异丁酸乙酯、α-溴代酮中的任一种；所述催化剂选自cubr、cucl中的任一种；所述配体选自pmdeta、2,2-联吡啶中的任一种；所述溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、乙醇、水、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

优选地，所述步骤2)中：所述溶剂选自甲醇、水、丙酮、二甲基亚砜中的一种或几种；所述季铵化反应试剂为碳原子个数为2-12的卤代羧酸，例如可以为具有直链或支链的溴(氯)代乙酸、溴(氯)代丙酸、溴(氯)代丁酸、溴(氯)代戊酸、溴(氯)代己酸、溴(氯)代庚酸、溴(氯)代辛酸、溴(氯)代壬酸、溴(氯)代葵酸。在一个更优选的实施例中，所述季铵化反应试剂为溴乙酸、6-溴己酸、8-溴辛酸、10-溴葵酸。

优选地，所述步骤3)中：所述溶剂选自二甲基亚砜、水、甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述促骨生长信号分子包括dfo、dmog中的任一种；所述缚酸剂选自三乙胺、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钠中的任一种；所述封端剂选自乙二胺、丁二胺中的任一种。

优选地，所述步骤4)中：所述溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、水、四氢呋喃、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述季铵化反应试剂为碳原子个数为6-12的卤代烷烃或碳原子个数为2-12的卤代羧酸。在一个优选的实施例中，所述季铵化反应试剂选自溴己烷、溴辛烷、溴葵烷、溴十二烷、溴己酸、溴辛酸中的任一种。

优选地，所述步骤5)中，所述溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、水、四氢呋喃、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述交联剂选自戊二醛、京尼平、过氧化二异丙苯中的任一种；所述还原剂选自氰基硼氢化钠、硼氢化钠、草酸、氯化亚锡中的任一种。

本发明实施例的第三方面提供了上述的具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料在骨缺损的修复及重建中的应用。

本发明实施例的第四方面提供了上述的制作方法制得的具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料在骨缺损的修复及重建中的应用。

本发明实施例具有如下优点：

本发明首先通过原子转移自由基反应得到聚合物，然后在聚合物侧链上先后引入促骨生长信号分子和季铵盐，具有附着量多，附着率高的特点，所得到的聚合物进一步通过共价键的方式与脱钙骨基质进行复合，能够有效地将具有促骨生长功能的促骨生长信号分子和具有抗菌功能的季铵盐牢固的负载到脱钙骨基质表面，明显提高了脱钙骨基质的促骨活性，同时还具有杀菌的功能。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的浓度为0.5mg/ml的dfo、qp、qp-dfo及qp-dfo-c10的吸收光谱对比图，其中，dfo为单纯的药物吸光度阳性对照，qp为通过原子转移自由基反应得到的聚合物，qp-dfo为接上dfo的聚合物，qp-dfo-c10为同时接上dfo和季铵盐的聚合物。

图2为dbm浸提液和本发明实施例3制得的改性后的dbm浸提液的细胞毒性检测结果。

图3为dbm和本发明实施例3制得的改性后的dbm的表面mc3tc-e1细胞形态图。

图4为dbm和本发明实施例3制得的改性后的dbm的抗菌性能对比结果。

图5为dbm和本发明实施例3制得的改性后的dbm的促成骨和血管形成的基因表达结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

本发明实施例中使用的脱钙骨基质包括但不限于人脱钙骨基质、牛脱钙骨基质、猪脱钙骨基质、兔脱钙骨基质等等，本文以牛脱钙骨基质为实例，其制备过程如下：

以新鲜的牛大棒骨为原料，将牛松质骨部分成1cm³的方块，后续进行超声清洗、脱钙及辐照灭菌工艺处理流程。

1.1超声清洗

在脱钙骨基质制备过程中，超声清洗有两次，第一次是骨材脱钙前，目的是为了对供体骨进行病毒灭活(见病毒灭活工艺)。第二次是脱钙后超声清洗，目的是去除残余的酸液。

根据病毒灭活验证试验结果，确定第一步超声参数为：60-65℃，10小时。根据盐酸残留量的控制(ph值测定和氯离子测定)，最终清洗参数为：室温超声清洗，3-4小时更换纯化水，换水2次，清洗3次，总超声清洗时间不少于9小时。这样可确保盐酸去除干净。

1.2脱钙

脱钙即利用盐酸脱去骨中的矿物质，保留有机成分。我们利用盐酸进行两次脱钙即脱钙3h后换酸再次脱钙3h，能够使脱钙骨基质钙含量均低于8％。

1.3辐照灭菌

脱钙骨基质是一种有潜在诱导成骨活性的生物材料，urist等人前期的研究显示，10kgy以上脱钙骨基质的骨诱导活性就会受到影响，超过50kgy甚至会使脱钙骨基质的活性完全散失。因此，辐照灭菌存在剂量和骨诱导活性之间的矛盾。我们通过试验验证25kgy辐照可保证产品无菌水平，同时还保留了骨诱导活性。

实施例1

本实施例的具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料的制备方法包括以下步骤：

1)在10ml的乙醇中，加入2ml甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯，85μl2-溴代异丁酸乙酯，80mgcubr，350μl2,2-联吡啶，35℃反应2小时，透析冻干，得到分子量为5000-15000da的聚合物；

2)将步骤1)得到的聚合物溶于10ml水中，加入6-溴己酸2.5ml，60℃反应24小时，透析冻干，得到第一次季铵化后的产物；

3)将步骤2)得到的季铵化后的产物100mg加入2-10mln,n-二甲基甲酰胺中，90℃反应3小时，将聚合物侧链进行功能化，然后减压蒸馏除去溶剂，加入6mln,n-二甲基甲酰胺溶解产物，同时加入100mgdfo，60μl三乙胺，20μl乙二胺，室温反应12小时，之后加入120μl的乙二胺，室温继续反应24小时，透析冻干，得到接上促骨生长信号分子的聚合物；

4)将步骤3)得到的产物溶于5ml二甲基亚砜中，加入4.5ml的1-溴已烷，60℃反应12小时，将剩余的聚合物重复单元季铵化，透析冻干，得到侧链引入促进骨生长信号分子和季铵盐的聚合物；

5)在8ml的四氢呋喃中加入20mg步骤4)得到的聚合物，同时加入戊二醛配成体积分数为12％的戊二醛溶液，加入100mg的脱钙骨基质，室温反应8小时，通过形成交联键将聚合物接枝在脱钙骨基质上，之后加入25mg硼氢化钠将交联键还原，透析冻干，即可得到具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料。

实施例2

本实施例的具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料的制备方法包括以下步骤：

1)在15ml的二甲基亚砜中，加入6ml甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯，150μlα-溴代酮，120mgcucl，480μlpmdeta，50℃反应1小时，透析冻干，得到分子量为5000-15000da的聚合物；

2)将步骤1)得到的聚合物溶于10ml丙酮中，加入6-溴己酸3.5ml，50℃反应12小时，透析冻干，得到第一次季铵化后的产物；

3)将步骤2)得到的季铵化后的产物180mg加入5ml水中，100℃反应3小时，将聚合物侧链进行功能化，然后减压蒸馏除去溶剂，加入5ml水溶解产物，同时加入150mgdmog，120μl三乙胺，15μl丁二胺，室温反应18小时，之后加入90μl的丁二胺，室温继续反应12小时，透析冻干，得到接上促骨生长信号分子的聚合物；

4)将步骤3)得到的产物溶于8ml二甲基亚砜中，加入6.5ml的1-溴辛烷，100℃反应8小时，将剩余的聚合物重复单元季铵化，透析冻干，得到侧链引入促骨生长信号分子和季铵盐的聚合物；

5)在15ml的二甲基亚砜中加入50mg步骤4)得到的聚合物，同时加入戊二醛配成体积分数为18％的戊二醛溶液，加入100mg脱钙骨基质，室温反应6小时，通过形成交联键将聚合物接枝在脱钙骨基质上，之后加入40mg氰基硼氢化钠将交联键还原，透析冻干，即可得到具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料。

实施例3

本实施例的具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料的制备方法包括以下步骤：

1)在12ml的n,n-二甲基甲酰胺中，加入4ml甲基丙烯酸n,n-二甲氨基乙酯，140μl2-溴代异丁酸乙酯，110mgcubr，280μlpmdeta，30℃反应3小时，透析冻干，得到分子量为5000-15000da的聚合物；

2)将步骤1)得到的聚合物溶于12ml二甲基亚砜中，加入8-溴辛酸3.5ml，35℃反应30小时，透析冻干，得到第一次季铵化后的产物；

3)将步骤2)得到的季铵化后的产物200mg加入10ml乙醇中，60℃反应4小时，将聚合物侧链进行功能化，然后减压蒸馏除去溶剂，加入8ml乙醇溶解产物，同时加入180mgdfo，80μl三乙胺，20μl乙二胺，室温反应18小时，之后加入120μl的乙二胺，室温继续反应8小时，透析冻干，得到接上促骨生长信号分子的聚合物；

4)将步骤3)得到的产物溶于6mln,n-二甲基甲酰胺中，加入5ml的1-溴葵烷，80℃反应10小时，将剩余的聚合物重复单元季铵化，透析冻干，得到侧链引入促骨生长信号分子和季铵盐的聚合物；

5)在10ml的二甲基亚砜中加入30mg步骤4)得到的聚合物，同时加入戊二醛配成体积分数为20％的戊二醛溶液，加入100mg的脱钙骨基质，室温反应4小时，通过形成交联键将聚合物接枝在脱钙骨基质上，之后加入65mg硼氢化钠将交联键还原，透析冻干，即可得到具有促骨生长和抗菌双功能的脱钙骨基质材料。

实验例

(一)结构表征

通过dfo鳌合三价铁离子显色的机理，将dfo、实施例3中通过原子转移自由基反应得到的未修饰任何功能的聚合物qp(第一步反应产物)、接上dfo的聚合物qp-dfo(第三步反应产物)、接上dfo和十碳烷基链的聚合物qp-dfo-c10(第四步反应产物)分别配制成浓度为0.5mg/ml的三氯化铁溶液，测试各溶液在400-500nm波长下的吸光度，吸收光谱结果对比结果见图1。

从图1中可以看到，dfo在418nm波长附近有较高的吸收峰，而其他组溶液的吸收曲线相似，可以判断出dpo均成功地修饰在qp-dfo和qp-dfo-c10上。

(二)细胞毒性实验

1材料

1.1材料浸提液的制备

0.1g实施例3制得的改性后的dbm和0.1gdbm和1ml培养液在37℃恒温培养箱中共培养24h后将材料取出。

1.2细胞接种

按常规培养小鼠胚胎颅顶骨mc3t3-e1细胞。在37℃、95％相对湿度、5％co2的培养箱中用含有10％(v/v)胎牛血清(fbs)和1％(v/v)双抗的α-mem培养液中培养，每周更换2次培养液，待细胞贴壁并达到80-90％融合时开始传代(1次/周)。2周后在培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶消化3min使细胞脱壁，随后加入新鲜细胞培养液终止消化，在血球计数仪下计数，制成1000个/ml的细胞悬液备用。

将上述细胞悬液以20微升/孔接种于96孔板，然后置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养24h，待细胞贴壁后进行实验。

1.3浸提液交换

用微量加样枪吸出全部原培养液后，用pbs清洗一遍，然后加入材料浸提液20微升。置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养24h。

2观察

于每孔中分别加入10μlcck-8溶液，同时设置空白对照孔，继续培养2h。用酶标仪在450nm波长处测定改性后的dbm和dbm的光吸收值，计算各样品的细胞活性值。

3结果

图2为dbm浸提液和本发明实施例3制得的改性后的dbm浸提液的细胞毒性检测结果。可见，改性后的dbm组的细胞活力略高于dbm组，且两组的细胞活力大于0.8，说明dbm和改性后的dbm对mc3t3-e1细胞均没有明显毒性作用。

(三)细胞黏附实验

dbm和改性后的dbm做mc3t3-e1细胞的共培养：还是得用培养液提前浸泡材料一夜，滴加20微升，5000个每10微升的细胞悬液，先在37℃条件下培养4h，再加入150微升细胞培养液。每两天换一次细胞培养液。通过2.5％的戊二醛溶液将材料表面的细胞固定，经过30％-100％一系列梯度乙醇溶液脱水后获得样品，风干，扫描电镜观察细胞黏附形态。

图3为dbm和本发明实施例3制得的改性后的dbm的表面mc3tc-e1细胞形态图。从图中可以看出，4d时，dbm和改性后的dbm都能观察到细胞黏附贴壁生长，且相比于dbm，改性后的dbm细胞长满视野，生长旺盛，细胞旋涡状生长，出现细胞融合。

(四)抗菌活性检测实验

将实施例3制得的改性后的dbm和dbm(长宽高均为3mm)分别与活菌浓度为1×10⁶cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌液200微升混合培养于96孔板中，每组材料取三个平行样，在37℃，150rpm的摇床里共培养。8h后，每孔取100微升的菌液用比浊法测定菌液浓度od600值，记录数值，三个平行样所得的od600值的平均值的结果见图4。

如图4所示，纯dbm与菌液培养8小时后，od600值达到0.8以上，而实施例3制得的改性后的dbm与菌液培养8小时后，od600值接近0.05，说明本发明实施例的材料具有很好的抗菌性能。

(五)成骨活性试验

sd大鼠bmsc细胞第3代接种到6孔板，细胞密度为1×10⁵个/ml，细胞贴壁后加入dbm支架材料共培养5d，间隔48h换液。实验分为两组：dbm组和实施例3制得的改性后的dbm组。

1总rna的提取

1.1弃上清液，pbs洗2遍；

1.2每孔加入1mltrizol裂解细胞，室温静置5min后移液枪反复吹打细胞，充分裂解后转移至无酶ep管中；

1.3每个ep管中加入200μl三氯甲烷，剧烈震荡15s后室温静置3min；

1.44℃，12000g离心15min(样品分三层，上层为水相即rna主要所在相)；

1.5将水相转移至新无酶ep管中，加入500μl异丙醇，室温静置10min；

1.64℃，12000g离心10min，弃上清液，加入1ml无水乙醇；

1.74℃，7500g离心10min，弃上清液，室温晾干；

1.8无rna酶水溶解沉淀物；

1.9紫外分光光度计测定rna浓度。

2反转录

2.1rna反转录按biotoolall-in-onecdnasynthesissupermix说明书进行。

2.2定量pcr，定量pcr参照康维世纪公司ultrasybrmixture(lowrox)试剂盒说明书进行，在abiq5荧光定量pcr仪器中检测基因的表达。

所有样品重复3次检测，用于标准化的内参基因为actin。基因的相对表达水平通过abi公司自带的quantstudiodesign&analysis分析软件计算得出。

改性材料促成骨和血管形成的基因表达结果见图5。从图中可以看到，碱性磷酸酶alp、骨钙素ocn、成骨分化关键转录因子runx2在改性dbm组中显著升高，促血管生成的血管内皮细胞生长因子vegf在改性dbm组中显著升高。表明改性dbm具有促进血管形成和骨形成的生物学功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。