一种聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术：

载药纳米微球是药物溶解或分散于高分子材料中形成的纳米微球状态，这种由高分子聚合材料控制的药物释放体系是一种新型的给药途径，发展的新产品能够将载药微球引导至病灶部位。

天然右旋龙脑具有开窍醒神，清热散毒，明目退翳的功效，主治热病高热神昏，中风痰厥惊痫，暑湿蒙蔽清窍，喉痹耳聋，口疮齿肿，目赤肿痛，翳膜遮睛。此外，天然右旋龙脑在抗肿瘤治疗具有增敏肿瘤化疗药物的作用。

但是天然右旋龙脑水溶性和稳定性较差，限制了其应用。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子的制备方法。

本发明另一目的在于提供通过上述制备方法得到的聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子。

本发明再一目的在于提供上述聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)当高分子聚合物为脂溶性时，将高分子聚合物和天然右旋龙脑溶于有机溶剂中，作为有机相，将乳化剂溶于水中作为水相；当高分子聚合物为水溶性时，将高分子聚合物和乳化剂溶于水中作为水相，将天然右旋龙脑溶于有机溶剂作为有机相；

(2)然后将有机相滴加到水相中搅拌，得到反应液；

(3)将反应液纯化，干燥，得到聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子。

步骤(1)中所述的高分子聚合物为脂溶性时，所述的高分子聚合物优选为聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(plga)。

步骤(1)中所述的高分子聚合物为水溶性时，所述的高分子聚合物优选为聚乙二醇(peg)、壳聚糖(cs)、聚乙烯亚胺(pei)、聚氧乙烯和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的一种或至少两种。

步骤(1)中所述的高分子聚合物的用量优选为按高分子聚合物：天然右旋龙脑＝质量比1～10：1～10配比；更优选为按高分子聚合物：天然右旋龙脑＝质量比1：2配比。

步骤(1)中所述的有机溶剂为丙酮、二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和乙腈中的一种或至少两种；优选为丙酮。

步骤(1)中所述的有机溶剂的用量优选按有机溶剂：天然右旋龙脑＝3～6ml：30mg配比；更优选按有机溶剂：天然右旋龙脑＝5ml：30mg配比。

步骤(1)中所述的乳化剂为吐温-80、吐温-20、泊洛沙姆188、泊洛沙姆184、司盘80和司盘60中的一种或至少两种，优选为吐温-80。

步骤(1)中所述的乳化剂的用量优选按每1mg天然右旋龙脑配比0.5～4mg乳化剂计算；更优选按每1mg天然右旋龙脑配比2.5mg乳化剂计算。

步骤(1)中所述的水优选为超纯水。

步骤(1)中所述的水的用量优选按每4～6mg乳化剂配比1ml水计算；更优选按每5mg乳化剂配比1ml水计算。

步骤(2)中所述的有机相和所述的水相按体积比1：(1～5)配比；优选按体积比1：3配比。

步骤(2)中所述的滴加的速度优选为0.6～3ml/min；更优选为3ml/min。

步骤(2)中所述的搅拌的条件优选为以100～1000rpm的速度搅拌2～24小时；更优选为以400rpm搅拌8h。

步骤(3)中所述的纯化的步骤优选如下：将反应液以1000～20000rpm的转速离心5～30min，然后过滤，再将过滤后的反应液用水洗涤；更优选如下：将反应液以8000rpm的转速离心10min，然后过滤，再将过滤后的反应液用纯水洗涤。

步骤(3)中所述的干燥的方式为真空干燥或冷冻干燥中的一种或多种。

一种聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子，通过上述制备方法得到。

所述聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤优选为肺癌、乳腺癌、宫颈癌、恶性黑色素瘤、肝癌或结肠癌；优选为肺癌。

本发明所述常温为15～30℃。

本发明的机理为：

本发明利用有机溶剂溶解高分子聚合物和天然右旋龙脑，表面活性剂形成胶束水溶液，剧烈搅拌下有机相加入水相，形成水包油乳液，挥发有机溶剂形成聚合物纳米粒子。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

1.本发明合成利用高分子聚合物合成负载有天然右旋龙脑纳米粒子，提高了天然右旋龙脑的水溶性和稳定性，并提高其肿瘤细胞的吸收和抗肿瘤活性。

2.本发明利用纳米化冰片，提高了细胞对抗肿瘤药物的吸收，从而增敏药物的抗肿瘤活性。

3.本发明利用乳酸-羟基乙酸共聚物负载天然右旋龙脑合成的纳米粒子的性能最好。

附图说明

图1为实施例1制备的plga@nb的透射电镜图。

图2为实施例1～3制备的三种纳米粒子的表征结果图；其中，图a为粒径图，图b为nb和三种纳米粒子的表面电位图，图c为三种纳米粒子载药量图。

图3为实施例1制备的plga@nb联合阿霉素对细胞作用的检测结果图；其中，图a为细胞活性氧的检测结果图；图b为细胞吸收dox的检测结果图。

图4为实施例1制备的plga@nb联合dox作用黑色素瘤的检测结果图；其中，图a为以不同处理方法对肿瘤体积随时间变化的影响结果图，图b为对肿瘤重量的影响结果图，图c为对肿瘤大小影响的数码照片图，图d为对裸鼠体重的影响结果图。

图5为实施例1制备的plga@nb联合dox处理裸鼠的血液指标分析图；其中，图a为血糖的检测结果，图b为谷丙转氨酶的检测结果，图c为谷草转氨酶的检测结果，图d为血清总蛋白的检测结果，图e为血清白蛋白的检测结果，图f为血清球蛋白的检测结果，图g为乳酸脱氢酶的检测结果，图h为肌酸激酶的检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

细胞株均从美国模式培养物集存库atcc购买；裸鼠均来源于广东省实验动物中心。

实施例1plga@nb的制备

取15mgplga(50:50，mw＝13000)和30mg天然右旋龙脑溶于5ml丙酮，作为有机相。取75mg吐温-80溶于15ml超纯水中，作为水相。取5ml有机相以3ml/min速度加入到15ml水相中，400rpm，常温搅拌8小时。待反应完成后以8000rpm的速度离心10min。然后过滤去沉淀，用超纯水洗3次，真空干燥得到白色粉末，得到plga负载天然右旋龙脑纳米粒子(plga@nb)。

通过透射电子显微镜表征纳米粒子的形貌，plga@nb的形貌图如图1所示。由图1可见，plga@nb具有良好分散性，粒径约为80nm。

实施例2peg@nb的制备

取30mg天然右旋龙脑溶于5ml丙酮，作为有机相。取15mg的peg(mw＝13000)和75mg的吐温-80溶于15ml的超纯水中，作为水相。取5ml有机相以3ml/min速度加入到15ml水相中，400rpm，常温搅拌8小时。待反应完成后以8000rpm的速度离心10min。然后过滤去沉淀，用超纯水洗3次，真空干燥得到白色粉末，得到peg负载天然右旋龙脑纳米粒子(peg@nb)。

实施例3cs@nb的制备

取30mg天然右旋龙脑溶于5ml丙酮，作为有机相。取15mg壳聚糖(cs)(mw＝30000)和75mg吐温-80溶于15ml的超纯水中，作为水相。取5ml有机相3ml/min速度加入到15ml水相中，400rpm，常温搅拌8小时。待反应完成后以8000rpm的速度离心10min。然后过滤去沉淀，用超纯水洗3次，真空干燥得到白色粉末，得到cs负载天然右旋龙脑纳米粒子(cs@nb)。

实施例4聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子的表征

通过nano-zs(malverninsrumentslimited)表征实施例1～3所制备纳米粒子的水合粒径和表面电位，通过气相色谱法测定纳米粒子的载药量。

检测结果如图2所示，其中：plga@nb、peg@nb和cs@nb的粒径分别为100.3nm、262nm、555.7nm，其中plga@nb和peg@nb具有更小的粒径(图2a)；nb、plga@nb、peg@nb和cs@nb的表面电位分别为-0.32mv、-13mv、-6.24mv、18.3mv(图2b)；plga@nb、peg@nb和cs@nb的载药量分别为0.98mg/ml、1.44mg/ml、1mg/ml(图2c)。

实施例5聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子对不同肿瘤细胞的生长抑制作用

将人肺癌细胞株a549细胞、人肝癌细胞株hepg2细胞、人结肠癌细胞株sw480细胞、人乳腺癌细胞株mcf-7细胞、人恶性黑色素瘤细胞株a375细胞、正常结肠上皮细胞株ncm460细胞和正常脑胶质细胞株chem-5细胞(可从atcc购得)分别用含10％(v/v)fbs的dmem培养基在96孔板上培养，细胞的初始浓度均为2×10⁴/ml(每孔100μl)。培养24h后，在每组细胞中分别加入100μl含待测药物的培养基(用含10％fbs的dmem培养基配制，待测药物浓度分别为3.125，6.25，12.5，25，50，100，200μg/ml)，孵育72h，最后通过mtt的方法检测结果。待测药物分别为天然右旋龙脑(nb)、实施例1制备的plga@nb、实施例2制备的peg@nb、实施例3制备的cs@nb。

实验结果如表1所示：由表1可见，冰片nb的ic50均大于100μg/ml，纳米化后的抗肿瘤活性大幅度上升，特别是plga@nb在a549细胞中的ic50下降到14.7μg/ml。

表1.nb，plga@nb，peg@nb，cs@nb的体外抗肿瘤实验的结果。

ncm460是正常结肠细胞，chem-5是正常脑胶质细胞。

实施例6：聚合物负载天然右旋龙脑纳米粒子联合阿霉素(dox)对不同肿瘤细胞的生长抑制作用

将人肺癌细胞株a549细胞、人乳腺癌细胞株mda-mb-231细胞、人宫颈癌细胞株hela细胞、人乳腺癌细胞株mcf7细胞分别用含10％(v/v)fbs的dmem培养基在96孔板上培养，细胞的初始浓度均为2×10⁴/ml(每孔100μl)。培养24h后，在每组细胞中分别加入100μl含待测药物的培养基(用含10％fbs的dmem培养基配制)，孵育72h，最后通过mtt的方法检测结果。待测药物分别为dox(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2μm)、4μg/mlnb、4μg/mlnb+dox(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2μm)、4μg/ml实施例1制备plga、4μg/ml实施例1制备plga+dox(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2μm)。

表2为plga@nb增敏dox的体外抗肿瘤实验结果。如表2所示，单独dox的ic50均大于0.8μm，而加入nb后dox的抗肿瘤活性大幅度上升，特别是plga@nb联合dox在a549细胞中的ic50下降到0.08μg/ml，dox的抗肿瘤活性提高了10倍以上，说明plga@nb能有效地提高dox的抗肿瘤活性。

表2.plga@nb增敏dox的体外抗肿瘤实验的结果

实施例7plga@nb联合阿霉素(dox)对细胞活性氧和细胞吸收的影响

(1)plga@nb联合阿霉素(dox)对细胞活性氧的影响

将人肺癌细胞株a549细胞用含10％(v/v)fbs的dmem培养基在96孔板上培养，细胞的初始浓度均为2×10⁵/ml(每孔100μl)。培养24h后，弃去培养基，加入10μm/孔的dcf-da活性氧探针，预处理0.5小时，再加入待测药物，然后测定荧光强度(485nm，525nm)。待测药物分别为dox(10μm)、4μg/mlnb、4μg/mlnb+10μmdox、4μg/mlplga@nb、4μg/mlplga@nb+10μmdox，以培养基组作为对照组。其中plga@nb为实施例1制备得到。

结果如图3a所示，单独dox能有效地激活活性氧的产生，活性氧水平最高上升到128％，最终缓慢下降。而nb+dox活性氧水平最高到达131％，无明显增敏效果。而plga@nb+dox活性氧水平大幅度上升到169％，并在2小时内保持在165％以上。说明了plga@nb+dox能有效地上调细胞内活性氧产生，从而诱导细胞凋亡。

(2)plga@nb联合阿霉素(dox)对细胞吸收的影响

将a549细胞用含10％(v/v)fbs的dmem培养基在96孔板上培养，细胞的初始浓度均为1×10⁵/ml(每孔100μl)。培养24h后，弃去培养基，再加入100μl含待测药物的培养基(用含10％fbs的dmem培养基配制。)，通过荧光光谱法来测定a549细胞内阿霉素dox的浓度。待测药物分别为10μmdox、4μg/mlnb、4μg/mlplga@nb+10μmdox。其中plga@nb+dox为实施例1制备得到

结果如图3b所示，可以看出，plga@nb联合dox使得dox在a549细胞内的细胞吸收在6小时达到152.7μg/10⁶细胞，高于nb联合阿霉素dox组的120μg/10⁶细胞，是单独阿霉素dox组的1.5倍，说明plga@nb能提高dox在a549细胞内的药物吸收，从而提高dox的抗肿瘤活性。

实施例8plga@nb协同dox显著性抑制小鼠a549皮下瘤生长

模型的建立：收集体外培养的人肺癌细胞a549，计数，调整细胞悬液浓度为1×10⁷个/ml，接种0.1ml细胞悬液于裸鼠(balb/c-nu裸鼠，2～4周龄，体重约18～22mg，裸鼠均来源于广东省实验动物中心。)右侧腋窝皮下。

分组与给药：用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至75-100mm³后将动物随机分组，每组10只。同时通过口服灌胃(p.o.)进行给药。给药组分为2mg的dox组，50mg的nb组，50mg的nb+2mg的dox组，50mg的plga@nb组，50mg的plga@nb+2mg的dox组，以生理盐水组作为对照组，其中plga@nb为实施例1制备得到。通过测量瘤径，动态观察被试物抗肿瘤的效果，给药24天后将小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

观测指标：肿瘤体积(tumorvolume，tv)的计算公式为：tv＝1/2×a×b²；其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，rtv)，计算公式为：rtv＝vt/v0，其中v0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率t/c(％)，计算公式如下：t/c(％)＝(trtv/crtv)×100，其中，trtv为治疗组rtv，crtv为模型对照组rtv。抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：肿瘤生长抑制率＝[(给药组平均瘤重-模型对照组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重]×100％。

结果如图4和5所示：图4a显示，与单独plga@nb组、nb组、dox组、nb+dox组相比，plga@nb+dox组的肿瘤体积增长最缓慢，说明plga@nb相比于单独nb能更有效地增强dox对a549肿瘤的生长抑制；图4b显示，plga@nb+dox组的肿瘤体积最小；图4c显示，plga@nb+dox组的的肿瘤最小，说明plga@nb+dox组的肿瘤抑制效果最好；图4d显示，plga@nb+dox组裸鼠体重下降不明显，而nb+dox组的裸鼠体重明显下降，说明nb+dox组对裸鼠具有一定损伤，而plga@nb+dox对裸鼠无明显损伤；如图5所示，glu(血糖)、alt(谷丙转氨酶)、ast(谷草转氨酶)的结果显示单独nb+dox组会引起肝损伤；tp(血清总蛋白)、alb(血清白蛋白)、glb(血清球蛋白)的结果显示所有组均无肝功能损伤；ldh(乳酸脱氢酶)显示dox，nb和nb+dox组均对心脏具有损伤；ck(肌酸激酶)结果显示nb+dox组会引起肾损伤，而plga@nb+dox均不会引起肝损伤、心肌损伤和肾损伤。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。