槐糖脂与依托泊苷的联合给药在肿瘤治疗领域中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种槐糖脂与依托泊苷的联合给药在肿瘤治疗领域中的应用。

背景技术：

世界卫生组织的globocan癌症报告显示，2018年全球新增1810万例癌症病例(男性950万，女性860万)，死亡人数达960万(男性540万，女性420万)，全球癌症负担进一步加重。2018年全球几乎一半的新发癌症病例及超过一半的癌症死亡病例都发生在亚洲，部分是因为该地区有着全球几乎60％的人口。相比世界其他区域，亚洲和非洲的癌症死亡率(57.3％和7.3％)要高于它们的发生率(48.4％和5.8％)，主要与该地区不良预后和高死亡率癌症发生频率更高有关，且这些国家的癌症患者得到及时诊断及治疗的渠道也非常有限。

中国作为人口大国，占据了亚洲癌症发病与死亡的一大部分，中国的癌症发病几乎相当于整个美洲，而癌症相关的死亡更是超过整个欧洲。当然，这一部分是由于中国巨大的人口基数所致。而全国肿瘤登记中心发布的2018年数据显示，中国每年新增癌症病例约380.4万，约有229.6万人因此死亡。2012年世卫组织报告预测全球癌症病例将由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。但是2018年肿瘤发病率已经达到1810万，可以说肿瘤呈现迅猛增长态势。肿瘤是导致人类死亡的首要疾病之一，我们迫切需要寻找新的癌症治疗药物或者有效的癌症治疗方法，新方法将对全球癌症患者的治疗产生重大影响，且可产生巨大的商业利润。

目前，肿瘤的治疗主要包括外科疗法(手术)、化学疗法(化疗)、放射治疗(放疗)，传统的中医药治疗、现代微创治疗及生物治疗等方法。目前看来，化疗仍是肿瘤临床治疗的主要手段之一。但由于化疗会导致肿瘤细胞产生耐药性，而随耐药性的出现，化疗的治疗效果会大打折扣。因此设计新型给药方法或开发新型靶点药物成为目前肿瘤化疗的关键一步。

依托泊苷(etoposide,eto)是抗肿瘤植物成分鬼臼脂的半合成衍生物，具有广谱抗癌活性和相当高的治疗指数，是细胞周期特异性抗肿瘤药物，为国际上公认的新型抗肿瘤药物。作用于晚s期或g2期，其作用位点是拓扑异构酶ⅱ，形成一种药物-酶-dna三者之间稳定的可裂性复合物，干扰dna拓朴异构酶ⅱ(dnatopoisomeraseⅱ)，致使受损的dna不能修复。依托泊苷被广泛应用于癌症的化疗方案，包括针对非小细胞肺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、绒毛膜上皮癌、卵巢癌等癌症的治疗。

临床数据表明，依托泊苷类药物的使用会产生较多的不良反应，如神经毒性、过敏反应、脱发、低血压、静脉炎等，因此临床上常需与顺铂或其他药物联合使用。此外，耐药性问题也是依托泊苷所面临的重大难题。如何解决不良反应及耐药性的问题，并增强其作用效果是依托泊苷在临床上所面临的挑战。

槐糖脂作为一类抗肿瘤活性优良的生物表面活性剂，在医药等领域有着巨大的开发潜力和应用前景。微生物天然合成的槐糖脂，是由一系列结构类似物组成的混合物，其主要分为酸型和内酯型两大类。一般来说，内酯型槐糖脂具有较高的亲脂性，具有降低液体表面张力的能力，其抗癌、抑菌、杀病毒等活性较高，已被报道对白血病k562和hl60，宫颈癌hela，肝癌细胞h7401，食道癌kyse109和yse450以及肺癌a549具有良好的杀伤作用；作为来源于生物发酵的新型抗肿瘤药物，槐糖脂不仅具有无毒、易得、较低的不良反应等其他抗癌药物所不具有的特征，还具有良好的生物相容性及生物可降解性等特性。

综上，槐糖脂作为一类潜在的新型广谱抗癌药物，具有抗肿瘤活性优良，细胞毒性较小，口服安全性较高等特点。从作用机理来看，槐糖脂通过er应激通路中的caspase-3、caspase-12蛋白激活来诱导肿瘤细胞发生凋亡。槐糖脂与化疗药物联用可能产生更好的抗肿瘤效果，而至今未有槐糖脂与化疗药物，如依托泊苷等，联合使用的报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中的不足，以槐糖脂和依托泊苷为主要成分的组合药物在肿瘤治疗领域，抗肿瘤药物制备领域及增加肿瘤细胞的药物敏感度领域等方面提供新的药物组合用于肿瘤治疗。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的目的是提供一种槐糖脂或其衍生物在制备肿瘤治疗药物上的应用。

本发明的另外一个目的在于提供一种槐糖脂或其衍生物在制备逆转肿瘤细胞对依托泊苷耐药性药物上的应用。

本发明的另外一个目的在于提供一种槐糖脂或其衍生物和依托泊苷联用的给药方式在肿瘤治疗领域中的应用。

所述槐糖脂或其衍生物包括内酯型槐糖脂、或其衍生物及复配物。

所述内酯型槐糖脂的结构式为：

其中r1为h或ac，r2为h或ac，r3为h或ch3。

所述的肿瘤细胞包括小细胞肺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、睾丸肿瘤、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌或乳腺癌。

在槐糖脂或其衍生物和依托泊苷联用的给药方式中，槐糖脂和依托泊苷的联合给药质量比为(10：1)-(1：10)，优选为(4：1)-(1：4)。

进一步的，所述的槐糖脂的给药浓度为1-500μg/ml，优选为10-100μg/ml，依托泊苷的给药浓度为1-500μg/ml，优选为10-100μg/ml。

申请人经过大量研究发现，槐糖脂对于多种肿瘤细胞均有一定的抑制作用。前期的研究结果提示：在较低浓度下槐糖脂可以通过内质网途径诱导肿瘤细胞凋亡，高浓度时槐糖脂会导致细胞坏死。槐糖脂和依托泊苷均通过诱导肿瘤细胞凋亡对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用。在考察不同药物对肿瘤细胞的细胞增殖抑制实验中发现，槐糖脂相较于依托泊苷具有更好的细胞毒性。另外，槐糖脂和依托泊苷联合使用对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用显著大于两种药物单独使用效果的简单加和。

本发明的另外一个目的在于提供一种治疗肿瘤的药物组合物，以槐糖脂和依托泊苷为主要成分，还包括可接受的药用载体制成各种药学上可接受的制剂，包括：静脉注射液、微乳、亚微乳、脂质体、微胶囊、磁性药物制剂。

该药物组合对于肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用并且能够诱导癌细胞凋亡。另外，槐糖脂和依托泊苷联合使用对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用显著大于两种药物单独使用效果的简单加和。

本发明的优点是：

本发明提供了一种槐糖脂与依托泊苷联合使用用于肿瘤治疗的方法，这样的组合用药可以在取得较好的抗肿瘤效果的同时大幅降低槐糖脂和依托泊苷的使用剂量，降低不良反应，增加药物的安全性。而在相同的药物剂量的条件下，该药物组合具有更好的抗肿瘤效果；在相同的抗肿瘤效果的条件下，该药物组合可以显著降低药物用量。

本发明所采用的槐糖脂，为利用非致病微生物，以植物来源的植物油和葡萄糖为底物发酵后经分离纯化获得，安全经济且成本低廉。作为微生物次级代谢产物，产品本身具有无毒、不良反应小，较好的生物相容性和良好的生物可降解性等优点。

本发明生产工艺成熟，工业化生产条件成熟，具有工业化的现实意义。

附图说明

图1所示为mtt法检测不同浓度槐糖脂对卵巢癌耐药细胞株a2780的存活率的影响。

图2所示为mtt法检测不同浓度依托泊苷对卵巢癌耐药细胞株a2780的存活率的影响。

图3所示为mtt法检测槐糖脂与依托泊苷联合使用对卵巢癌耐药细胞株a2780的体外协同增效作用。

图4所示为槐糖脂和依托泊苷的联合给药对卵巢癌耐药细胞株a2780细胞核形态的影响；其中，a为对照组的细胞核形态；b为40μg/ml槐糖脂处理下的细胞核形态；c为40μg/ml依托泊苷处理下的细胞核形态；d为40μg/ml的槐糖脂和依托泊苷联合给药下的细胞核形态。

图5所示为流式细胞仪检测槐糖脂与依托泊苷联合用药对卵巢癌耐药细胞株a2780凋亡率的影响；其中，-为组合内不含有此类物质；+为组合内含有此类物质；槐糖脂和依托泊苷的给药浓度均是40μg/ml，联合给药添加的为40μg/ml的槐糖脂和依托泊苷的混合物。

具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：

实施例1

槐糖脂的制备

(1)将产槐糖脂酵母菌在30℃，220rpm条件下发酵培养5天，其中发酵培养基组成为：葡萄糖6.0％，酵母粉0.3％，磷酸二氢钠0.1％，十二水合磷酸氢二钠0.1％，七水硫酸镁0.05％，菜籽油6.0％。

(2)发酵液用体积比1：2的乙酸乙酯萃取，上层萃取液于50℃下减压蒸馏后，正己烷洗涤两遍，45℃真空干燥24h，即得内酯型槐糖脂，为内酯型槐糖脂混合物。

实施例2

不同浓度的槐糖脂的抗肿瘤活性

将a2780细胞按1*10⁵/ml的密度接种于96孔板，培养24小时后分别加入10、20、40、80μg/ml内酯型槐糖脂处理细胞。继续培养24小时后，采用mtt法测定细胞存活率。结果如图1所示，内酯型槐糖脂可以有效抑制a2780细胞的存活，杀死肿瘤细胞，并且这种抑制作用呈现药物浓度依赖性。当内酯型槐糖脂浓度达到80μg/ml时，a2780的致死率已经达到90％以上。

实施例3

不同浓度的依托泊苷的抗肿瘤活性

将a2780细胞按1*10⁵/ml的密度接种于96孔板，培养24小时后分别加入10、20、40、80μg/ml依托泊苷处理细胞。继续培养24小时后，采用mtt法检测细胞存活率。结果如图2所示，相比于槐糖脂，依托泊苷降低a2780细胞的存活率的效果差一些。当依托泊苷的浓度达到80μg/ml时，a2780的致死率仅有43％。

实施例4

槐糖脂与依托泊苷的体外协同增效作用

将a2780细胞按1*10⁵/ml的密度接种于96孔板，培养24小时后分别加入40μg/ml槐糖脂和40μg/ml依托泊苷处理细胞。继续培养24小时后，采用mtt法检测细胞存活率。结果如图3所示，槐糖脂可以有效逆转a2780细胞对依托泊苷的耐药性，并且与依托泊苷一起产生协同增效的作用。

槐糖脂和依托泊苷联合用药可以有效的抑制a2780细胞的存活，杀死肿瘤细胞，并且这种抑制作用呈现药物浓度依赖性。当槐糖脂和依托泊苷的联合给药的浓度达到40μg/ml时，其相对于40μg/ml槐糖脂，可使a2780细胞的存活率被抑制约14％，相对于40μg/ml依托泊苷可使a2780细胞的存活率被抑制约30％，而40μg/ml槐糖脂与40μg/ml依托泊苷联合使用可大幅度抑制a2780细胞的存活率，抑制率接近78％。

实施例5

槐糖脂和依托泊苷联合给药对a2780细胞核形态的影响

将a2780细胞按1*10⁵/ml的密度接种于6孔板，培养24小时后加入不同40μg/ml槐糖脂或40μg/ml依托泊苷处理细胞，继续培养24小时后，采用dapi染色法检测细胞活性，倒置荧光显微镜下观察实验结果，如图4所示。

结果显示，正常对照组中的细胞核质呈现出均一、结构完整的蓝色；而槐糖脂与依托泊苷单独用药24h后，部分细胞核呈现出核浓缩碎块状，荧光显微镜下观察表现为蓝白色致密浓染，少数细胞核可见核内染色质凝聚、核固缩，呈新月形向核膜外周聚集，或细胞核内碎裂，具有明显的凋亡特征；而联合用药组凋亡现象及凋亡细胞数量较单独用药组明显增加，细胞数量明显较少、细胞核破裂，核解体，荧光亮度趋向发亮蓝白色。因此，槐糖脂和依托泊苷的联合用药主要通过促进细胞凋亡的方式来抑制肿瘤细胞的增殖。

实施例6

槐糖脂和依托泊苷联合用药对a2780细胞凋亡的影响

将a2780细胞按1*10⁵/ml的密度接种于6孔板，培养24小时后加入不同40μg/ml槐糖脂和40μg/ml依托泊苷联合给药处理细胞。继续培养24小时后收集细胞，通过annexinv-fitc/pi染色检测细胞凋亡。结果如图5所示，40μg/ml槐糖脂单独使用可以诱导约13％的细胞发生凋亡，40μg/ml依托泊苷单独使用可以诱导约7％的细胞发生凋亡，而当40μg/ml槐糖脂与40μg/ml依托泊苷联合使用时，细胞的凋亡率上升至约20％，明显高于两个药物单独使用时凋亡率的加和。流式细胞仪的检测细胞凋亡的实验结果与mtt法测联合给药的细胞存活率的结果一致。这些结果不仅说明槐糖脂可以逆转a2780细胞对依托泊苷的耐药性，也说明槐糖脂与依托泊苷联合给药通过促进肿瘤细胞凋亡，达到协同增效的抗肿瘤作用。

以上仅是本发明的部分实施例，上述实施例不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应该以权利要求限定范围为准。对于本技术领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进，这些改进也应当视作本发明的保护范围。