NOD1/2在作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及nod1/2在作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用。

背景技术：

肝细胞癌(hepatocellμlarcarcinoma，hcc，以下简称肝癌)是一种严重威胁我国人民生命与健康的恶性肿瘤性疾病。在世界范围内，肝癌已经成为第三大癌症相关死亡原因。近年以来，与肝癌相关的影像学诊断技术和外科手术技术不断提高。以sorafenib为代表的肝癌靶向治疗药物也获得了美国食品与药品管理局的批准。这些成果为肝癌的诊断与治疗提供了更多更有效的选择。但遗憾的是，综观当前肝癌临床治疗的现状，肝癌病人的术后五年生存率并没有显著提高。

目前，外科手术仍然是肝癌的首选疗法。但由于肝癌发病病程长，起病隐匿，一部分病人在确诊时就已经错过了用手术的方法根治肝癌的最佳时机。中晚期肝癌患者大多不适合进行手术切除、消融等治疗，全身治疗仍是其重要的治疗手段。而不幸的是，肝癌细胞容易对化疗药物产生耐药性，抗肿瘤药物化疗药物本身对机体也可能造成较大的毒副作用，故化学治疗肝癌的效果至今仍难以令人满意。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，本发明提供nod1/2在作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用。

本发明第一个方面，提供nod1/2在作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用，nod1/2高表达或过表达，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

本发明第二个方面，提供一种提高肝癌细胞对化疗药物敏感性的药物组合物，所述药物组合物至少包括含nod1/2基因的重组质粒或重组病毒。

进一步的，所述药物组合物还包括水溶性填充剂、ph调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。

进一步的，水溶性填充剂包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种。

进一步的，所述ph调节剂为生理可接受的酸、碱和/或盐；所述酸选自枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸和/或盐酸中的一种或多种；所述碱选自氢氧化钾、氢氧化钠和/或氢氧化铵中的一种或多种；所述盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵盐中的一种或多种。

进一步的，所述稳定剂为edta-2na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000和十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。

进一步的，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针剂、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明取得的有益效果

本发明首次发现nod1和nod2均可以提高肝癌细胞的化疗敏感性。nod1通过抑制p-src-mapk信号轴提高肝癌细胞的化疗敏感性，并且nod1对肝癌细胞的抑制效应与5-fμ存在一定的协同效应。nod2通过激活ampk信号通路提高肝癌细胞的化疗敏感性，并且nod2对肝癌细胞的抑制效应与5-fμ存在一定的协同效应。nod1/2基因在提高肝癌细胞化疗敏感性的应用，显著提高了化疗结果，并且可降低化疗产生的副作用。

本发明所用生物原料易得，使用安全可靠，其制成的药物组合物成分合理，疗效明显，应用范围广，使用环境友好。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1nod1显著提高肝癌细胞系的化疗敏感性；图1a将肝癌细胞系hepg2种于96孔板中，贴壁过夜后，外源性转入myc-nod1，转染换液时加入不同浓度梯度的5-fμ，加药72h后，cck-8法检测细胞活力；图1b将肝癌细胞系hepg2种于96孔板中，贴壁过夜后，外源性转入myc-nod1，转染换液时加入5-fμ(10μg/ml)，加药48h后，cck-8法检测细胞活力；图1c将肝癌细胞系hepg2种于6孔板中，贴壁过夜后，外源性转入myc-nod1，转染换液时加入5-fμ(10μg/ml)，加入等体积dmso作为对照，加药48h后，收集上清及贴壁细胞并裂解蛋白，westernblot检测p-src、p-erk、p21的蛋白表达水平变化。应用4周左右雄性裸鼠20只，将肝癌细胞系hepg2(1*10^7)皮下注射入裸鼠左右腋内侧；肉眼可见肿瘤出现后，开始给与左侧瘤内注射myc-nod1质粒(20μg)，同时，右侧给与等量myc-vector(20μg)，隔天注射一次；分别将myc-nod1与myc-vector分为两组，其中一组给与5-fμ(10mg/kg)进行注射，另一组给与同体积pbs注射，隔天给药一次。首次注射质粒26天后，处死裸鼠并剥离肿瘤组织，称重并测量肿瘤长短径；图1d裸鼠肿瘤的生长曲线；图1e剥离出的裸鼠肿瘤照片；图1f-g剥离出各组裸鼠肿瘤的体积(图1f)和重量(图1h)。图1i，抽提各组裸鼠肿瘤的蛋白，westernblot检测myc、p-src、p-erk、p21等相关蛋白的表达变化。

图2nod2显著提高肝癌细胞系的化疗敏感性；本发明将肝癌细胞系bel7402和hepg2以1*10^4/孔的密度分别接种于96孔板中，外源性过表达nod2，在转染换液时加入不同浓度梯度的5-fμ，72小时后检测细胞活力，分析发现nod2可以有效提高肝癌细胞对5-fμ的敏感性(图2a-b)。进一步的研究发现，nod2对肝癌细胞的抑制效应与5-fμ存在一定的协同效应(图2c-d)。为研究在肝癌细胞系加入5-fμ后，nod2是否可以增加细胞凋亡。在成功构建的nod2过表达细胞模型bel7402中加入5-fμ(10μg/ml)，对照组加入dmso。加药处理48h后收集上清及贴壁细胞，annexinv/pi双染，流式上机检测发现，nod2加5-fμ处理后，细胞的凋亡数量明显增多(图2e)。进一步的研究发现，nod2通过激活ampk信号轴提高肝癌细胞的化疗敏感性(图2f)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明所用myc-nod1表达质粒受赠于dr.sμngoμkkim(μniversityofwesternontario)；myc-nod2表达质粒受赠于dr.ralphr.isberg(tμftsμniversityschoolofmedicine)。

myc-nod1表达质粒的构建方法如文献所述：liμm,haensslere,μeharat,etal.thelegionellapneμmophilaenhcproteininterfereswithimmμnostimμlatorymμramylpeptideprodμctiontoevadeinnateimmμnity[j].cellhost&microbe,2012,12(2):166-176.

myc-nod2表达质粒的构建方法如文献所述：parks,hasd,colemanm,etal.p62/sqstm1enhancesnod2-mediatedsignalingandcytokineprodμctionthroμghstabilizingnod2oligomerization[j].plosone,2013,8(2):e57138.

nod1基因核苷酸序列如seqidno.1所示；nod2基因核苷酸序列如seqidno.2所示。

实施例1nod1/2提高肝癌细胞的化疗敏感性

nod1显著提高肝癌细胞系的化疗敏感性：将肝癌细胞系hepg2种于96孔板中，贴壁过夜后，外源性转入myc-nod1，转染换液时加入不同浓度梯度的5-fμ，加药72h后，cck-8法检测细胞活力；将肝癌细胞系hepg2种于96孔板中，贴壁过夜后，外源性转入myc-nod1，转染换液时加入5-fμ(10μg/ml)，加药48h后，cck-8法检测细胞活力；分析发现nod1可以有效提高肝癌细胞对5-fμ的敏感性(图1a-b)，说明nod1能显著提高肝癌细胞对5-fμ的化疗敏感性。将肝癌细胞系hepg2种于6孔板中，贴壁过夜后，外源性转入myc-nod1,转染换液时加入5-fμ(10μg/ml)，加入等体积dmso作为对照，加药48h后，收集上清及贴壁细胞并裂解蛋白，westernblot检测p-src、p-erk、p21的蛋白表达水平变化，实验结果如图1c所示。

nod2显著提高肝癌细胞系的化疗敏感性：本发明将肝癌细胞系bel7402和hepg2以1*10^4/孔的密度分别接种于96孔板中，外源性过表达nod2，在转染换液时加入不同浓度梯度的5-fμ，72小时后检测细胞活力，分析发现nod2可以有效提高肝癌细胞对5-fμ的敏感性(图2a-b)。说明nod2能显著提高肝癌细胞对5-fμ的化疗敏感性。

进一步的研究发现，nod2对肝癌细胞的抑制效应与5-fμ存在一定的协同效应(图2c-d)。为研究在肝癌细胞系加入5-fμ后，nod2是否可以增加细胞凋亡。在成功构建的nod2过表达细胞模型bel7402中加入5-fμ(10μg/ml)，对照组加入dmso。加药处理48h后收集上清及贴壁细胞，annexinv/pi双染，流式上机检测发现，nod2加5-fμ处理后，细胞的凋亡数量明显增多(图2e)。进一步的研究发现，nod2通过激活ampk信号轴提高肝癌细胞的化疗敏感性(图2f)。

实施例2nod1提高裸鼠模型肝癌细胞的化疗敏感性

nod1显著提高肝癌细胞系的化疗敏感性：应用4周左右雄性裸鼠20只，将肝癌细胞系hepg2(1*10^7)皮下注射入裸鼠左右腋内侧。肉眼可见肿瘤出现后，开始给与左侧瘤内注射myc-nod1质粒(20μg)，同时，右侧给与等量myc-vector(20μg)，隔天注射一次；分别将myc-nod1与myc-vector分为两组，其中一组给与5-fμ(10mg/kg)进行注射，另一组给与同体积pbs注射，隔天给药一次。首次注射质粒26天后，处死裸鼠并剥离肿瘤组织，称重并测量肿瘤长短径。裸鼠肿瘤生长曲线表明nod1组裸鼠肿瘤应用5-fμ处理后可以显著抑制其生长速率(图1e)，同时注射nod1和5-fμ组其肿瘤的体积和重量较仅nod1注射组和同时注射空载体和5-fμ组均显著下降(图1f-g)。通过提取肿瘤组织蛋白并应用westernblot检测相关蛋白的表达进一步验证了nod1通过抑制p-src-mapk信号轴提高肝癌细胞对5-fμ的化疗敏感性(图1h)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东大学

<120>nod1/2在作为制备提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性药物的应用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2859

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggaagagcagggccacagtgagatggaaataatcccatcagagtctcacccccacatt60

caattactgaaaagcaatcgggaacttctggtcactcacatccgcaatactcagtgtctg120

gtggacaacttgctgaagaatgactacttctcggccgaagatgcggagattgtgtgtgcc180

tgccccacccagcctgacaaggtccgcaaaattctggacctggtacagagcaagggcgag240

gaggtgtccgagttcttcctctacttgctccagcaactcgcagatgcctacgtggacctc300

aggccttggctgctggagatcggcttctccccttccctgctcactcagagcaaagtcgtg360

gtcaacactgacccagtgagcaggtatacccagcagctgcgacaccatctgggccgtgac420

tccaagttcgtgctgtgctatgcccagaaggaggagctgctgctggaggagatctacatg480

gacaccatcatggagctggttggcttcagcaatgagagcctgggcagcctgaacagcctg540

gcctgcctcctggaccacaccaccggcatcctcaatgagcagggtgagaccatcttcatc600

ctgggtgatgctggggtgggcaagtccatgctgctacagcggctgcagagcctctgggcc660

acgggccggctagacgcaggggtcaaattcttcttccactttcgctgccgcatgttcagc720

tgcttcaaggaaagtgacaggctgtgtctgcaggacctgctcttcaagcactactgctac780

ccagagcgggaccccaaggaggtgtttgccttcctgctgcgcttcccccacgtggccctc840

ttcaccttcgatggcctggacgagctgcactcggacttggacctgagccgtgtgcctgac900

agctcctgcccctgggagcctgcccaccccctggtcttgctggccaacctgctcagtggg960

aagctgctcaagggggctagcaagctgctcacagcccgcacaggcatcgaggtcccgcgc1020

cagttcctgcggaagaaggtgcttctccggggcttctcccccagccacctgcgcgcctat1080

gccaggaggatgttccccgagcgggccctgcaggaccgcctgctgagccagctggaggcc1140

aaccccaacctctgcagcctgtgctctgtgcccctcttctgctggatcatcttccggtgc1200

ttccagcacttccgtgctgcctttgaaggctcaccacagctgcccgactgcacgatgacc1260

ctgacagatgtcttcctcctggtcactgaggtccatctgaacaggatgcagcccagcagc1320

ctggtgcagcggaacacacacagcccagtggagaccctccacgccggccgggacactctg1380

tgctcgctggggcaggtggcccaccggggcatggagaagagcctctttgtcttcacccag1440

gaggaggtgcaggcctccgggctgcaggagagagacatgcagctgggcttcctgcgggct1500

ttgccggagctgggccccgggggtgaccagcagtcctatgagtttttccacctcaccctc1560

caggccttctttacagccttcttcctcgtgctggacgacagggtgggcactcaggagctg1620

ctcaggttcttccaggagtggatgccccctgcgggggcagcgaccacgtcctgctatcct1680

cccttcctcccgttccagtgcctgcagggcagtggtccggcgcgggaagacctcttcaag1740

aacaaggatcacttccagttcaccaacctcttcctgtgcgggctgttgtccaaagccaaa1800

cagaaactcctgcggcatctggtgcccgcggcagccctgaggagaaagcgcaaggccctg1860

tgggcacacctgttttccagcctgcggggctacctgaagagcctgccccgcgttcaggtc1920

gaaagcttcaaccaggtgcaggccatgcccacgttcatctggatgctgcgctgcatctac1980

gagacacagagccagaaggtggggcagctggcggccaggggcatctgcgccaactacctc2040

aagctgacctactgcaacgcctgctcggccgactgcagcgccctctccttcgtcctgcat2100

cacttccccaagcggctggccctagacctagacaacaacaatctcaacgactacggcgtg2160

cgggagctgcagccctgcttcagccgcctcactgttctcagactcagcgtaaaccagatc2220

actgacggtggggtaaaggtgctaagcgaagagctgaccaaatacaaaattgtgacctat2280

ttgggtttatacaacaaccagatcaccgatgtcggagccaggtacgtcaccaaaatcctg2340

gatgaatgcaaaggcctcacgcatcttaaactgggaaaaaacaaaataacaagtgaagga2400

gggaagtatctcgccctggctgtgaagaacagcaaatcaatctctgaggttgggatgtgg2460

ggcaatcaagttggggatgaaggagcaaaagccttcgcagaggctctgcggaaccacccc2520

agcttgaccaccctgagtcttgcgtccaacggcatctccacagaaggaggaaagagcctt2580

gcgagggccctgcagcagaacacgtctctagaaatactgtggctgacccaaaatgaactc2640

aacgatgaagtggcagagagtttggcagaaatgttgaaagtcaaccagacgttaaagcat2700

ttatggcttatccagaatcagatcacagctaaggggactgcccagctggcagatgcgtta2760

cagagcaacactggcataacagagatttgcctaaatggaaacctgataaaaccagaggag2820

gccaaagtctatgaagatgagaagcggattatctgtttc2859

<210>2

<211>3123

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgggggaagagggtggttcagcctctcacgatgaggaggaaagagcaagtgtcctcctc60

ggacattctccgggttgtgaaatgtgctcgcaggaggcttttcaggcacagaggagccag120

ctggtcgagctgctggtctcagggtccctggaaggcttcgagagtgtcctggactggctg180

ctgtcctgggaggtcctctcctgggaggactacgagggcttccacctcctgggccagcct240

ctctcccacttggccaggcgccttctggacaccgtctggaataagggtacttgggcctgt300

cagaagctcatcgcggctgcccaagaagcccaggccgacagccagtcccccaagctgcat360

ggctgctgggacccccactcgctccacccagcccgagacctgcagagtcaccggccagcc420

attgtcaggaggctccacagccatgtggagaacatgctggacctggcatgggagcggggt480

ttcgtcagccagtatgaatgtgatgaaatcaggttgccgatcttcacaccgtcccagagg540

gcaagaaggctgcttgatcttgccacggtgaaagcgaatggattggctgccttccttcta600

caacatgttcaggaattaccagtcccattggccctgcctttggaagctgccacatgcaag660

aagtatatggccaagctgaggaccacggtgtctgctcagtctcgcttcctcagtacctat720

gatggagcagagacgctctgcctggaggacatatacacagagaatgtcctggaggtctgg780

gcagatgtgggcatggctggacccccgcagaagagcccagccaccctgggcctggaggag840

ctcttcagcacccctggccacctcaatgacgatgcggacactgtgctggtggtgggtgag900

gcgggcagtggcaagagcacgctcctgcagcggctgcacttgctgtgggctgcagggcaa960

gacttccaggaatttctctttgtcttcccattcagctgccggcagctgcagtgcatggcc1020

aaaccactctctgtgcggactctactctttgagcactgctgttggcctgatgttggtcaa1080

gaagacatcttccagttactccttgaccaccctgaccgtgtcctgttaacctttgatggc1140

tttgacgagttcaagttcaggttcacggatcgtgaacgccactgctccccgaccgacccc1200

acctctgtccagaccctgctcttcaaccttctgcagggcaacctgctgaagaatgcccgc1260

aaggtggtgaccagccgtccggccgctgtgtcggcgttcctcaggaagtacatccgcacc1320

gagttcaacctcaagggcttctctgaacagggcatcgagctgtacctgaggaagcgccat1380

catgagcccggggtggcggaccgcctcatccgcctgctccaagagacctcagccctgcac1440

ggtttgtgccacctgcctgtcttctcatggatggtgtccaaatgccaccaggaactgttg1500

ctgcaggagggggggtccccaaagaccactacagatatgtacctgctgattctgcagcat1560

tttctgctgcatgccacccccccagactcagcttcccaaggtctgggacccagtcttctt1620

cggggccgcctccccaccctcctgcacctgggcagactggctctgtggggcctgggcatg1680

tgctgctacgtgttctcagcccagcagctccaggcagcacaggtcagccctgatgacatt1740

tctcttggcttcctggtgcgtgccaaaggtgtcgtgccagggagtacggcgcccctggaa1800

ttccttcacatcactttccagtgcttctttgccgcgttctacctggcactcagtgctgat1860

gtgccaccagctttgctcagacacctcttcaattgtggcaggccaggcaactcaccaatg1920

gccaggctcctgcccacgatgtgcatccaggcctcggagggaaaggacagcagcgtggca1980

gctttgctgcagaaggccgagccgcacaaccttcagatcacagcagccttcctggcaggg2040

ctgttgtcccgggagcactggggcctgctggctgagtgccagacatctgagaaggccctg2100

ctccggcgccaggcctgtgcccgctggtgtctggcccgcagcctccgcaagcacttccac2160

tccatcccgccagctgcaccgggtgaggccaagagcgtgcatgccatgcccgggttcatc2220

tggctcatccggagcctgtacgagatgcaggaggagcggctggctcggaaggctgcacgt2280

ggcctgaatgttgggcacctcaagttgacattttgcagtgtgggccccactgagtgtgct2340

gccctggcctttgtgctgcagcacctccggcggcccgtggccctgcagctggactacaac2400

tctgtgggtgacattggcgtggagcagctgctgccttgccttggtgtctgcaaggctctg2460

tatttgcgcgataacaatatctcagaccgaggcatctgcaagctcattgaatgtgctctt2520

cactgcgagcaattgcagaagttagctctattcaacaacaaattgactgacggctgtgca2580

cactccatggctaagctccttgcatgcaggcagaacttcttggcattgaggctggggaat2640

aactacatcactgccgcgggagcccaagtgctggccgaggggctccgaggcaacacctcc2700

ttgcagttcctgggattctggggcaacagagtgggtgacgagggggcccaggccctggct2760

gaagccttgggtgatcaccagagcttgaggtggctcagcctggtggggaacaacattggc2820

agtgtgggtgcccaagccttggcactgatgctggcaaagaacgtcatgctagaagaactc2880

tgcctggaggagaaccatctccaggatgaaggtgtatgttctctcgcagaaggactgaag2940

aaaaattcaagtttgaaaatcctgaagttgtccaataactgcatcacctacctaggggca3000

gaagccctcctgcaggcccttgaaaggaatgacaccatcctggaagtctggctccgaggg3060

aacactttctctctagaggaggttgacaagctcggctgcagggacaccagactcttgctt3120

tga3123