本发明涉及疾病治疗领域。具体而言，本发明涉及经修饰的胸腺素β4用于在受试者（例如，人）中治疗糖尿病周围神经病变（diabeticperipheralneuropathy，dpn）的用途，以及在制备用于在受试者（例如，人）中治疗糖尿病周围神经病变的药物方面的用途。本发明还涉及一种治疗糖尿病周围神经病变的方法，其包括向有此需要的受试者施用所述经修饰的胸腺素β4的步骤。
背景技术：
糖尿病周围神经病变(dpn)是指在排除其他原因的情况下，糖尿病患者出现与周围神经功能障碍相关的症状和(或)体征。糖尿病周围神经病变是糖尿病的常见并发症，临床表现包括多种类型，其中以远端对称性多发性周围神经病（distalsymmetricpolyneuropathy，dspn）和自主神经病最为常见。根据2013年中国卫生部官方统计数据，中国的糖尿病患者人数为1.14亿。dpn为糖尿病患者的主要并发症之一，其患病人数尚无准确统计。2002年中华医学会糖尿病学分会慢性并发症调查组对全国30个省市内分泌科24496例住院患者的临床及实验室检查资料显示，中国糖尿病患者中60.3%合并有神经病变（1991-2000年全国住院糖尿病患者慢性并发症及相关大血管病变回顾性分析.中国医学科学院学报,2002,24:447-451）。2009年，中国医师学会内分泌代谢科分会基于神经功能检查发现60%-90%的糖尿病患者合并有神经病变，但其中有30%-40%患者没有临床症状（糖尿病周围神经病变诊疗规范.中国糖尿病杂志,2009,17:638-640）。据以上数据推算中国目前的dpn患者人数约6800万。
dpn的发病原因和发病机制尚未完全阐明，目前认为主要是血糖等代谢紊乱所导致的氧化应激、血管性缺血缺氧、神经生长因子缺乏等。另外，自身免疫因素、维生素缺乏、遗传和环境因素等也有可能与dpn的发生有关。dpn的主要病理变化是无髓鞘神经纤维轴突变性，甚至消失；有髓鞘神经纤维髓鞘阶段性或弥散性皱缩或脱髓鞘，以及髓鞘再生引起的朗飞结节间长度改变。目前糖尿病周围神经病变的治疗包括优化血糖控制、止痛药和心理支持治疗，都无法根治糖尿病周围神经病变。临床指南推荐将三环类抗抑郁药（阿米替林、丙咪嗪和去甲替林）、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂（度洛西汀，文法拉辛）、以及抗惊厥药（加巴喷丁，普瑞巴林）作为一线治疗药物。阿片类药物已被证明可有效缓解患者疼痛症状，目前仅有度洛西汀和普瑞巴林、他喷他多被美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局批准用于治疗糖尿病周围神经病变疼痛症状。因此，本领域迫切需要开发新的可用于根本上治疗糖尿病周围神经病变的有效药物，而不仅仅是止疼药。
胸腺素β4多种生物学功能，其主要生物学活性归纳如下：第一，能保护受损组织，起修复受损组织的作用；第二，增强神经系统功能；第三，增加受损组织动脉血管生成，提高血流量；第四，调控炎症，促进受损修复和愈合。美国亨利福特医院的王磊等（thymosinβ4promotestherecoveryofperipheralneuropathyintypeiidiabeticmice.neurobioldis,2012,;48:546–555）的研究表明天然结构的胸腺素β4对糖尿病周围神经病变有很好的治疗作用，尤其是在神经修复方面。其在美国的发明专利申请（us2015/0224175a1），涉及对天然结构的胸腺素β4治疗糖尿病周围神经病变用途的保护。
技术实现要素：
本发明涉及经修饰的胸腺素β4治疗或改善糖尿病周围神经病变的应用。本发明还涉及经修饰的胸腺素β4单独或与其它疗法联合治疗糖尿病周围神经病变。
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现，在糖尿病周围神经病变的动物模型中，施用经修饰的胸腺素β4同样能显著增加糖尿病大鼠的运动神经传导速度（mncv）及感觉神经传导速度（sncv），显著改善糖尿病大鼠腓肠神经纤维横截面总面积和神经纤维平均面积。且经与天然结构的胸腺素β4对比研究后，出人意料的发现，本发明采用的经修饰的胸腺素β4有效剂量与天然结构胸腺素β4有效剂量的比例为1:1200，本发明选用的结构能显著降低用药剂量。基于这一发现，本发明人开发了新的治疗糖尿病周围神经病变的方法，这一发现对于糖尿病周围神经病变的治疗具有重大意义。
本发明所提到的经修饰的胸腺素β4是，在天然人胸腺素β4的n末端添加上甘氨酸且n末端未进行乙酰化的人胸腺素β4衍生物。该序列来自发明人的另外一篇授权专利zl200680025339.0，如seqidno:1所示的氨基酸序列。
因此，在一个方面，本发明提供了经修饰的胸腺素β4用于制备在受试者糖尿病周围神经病变预防与治疗药物的用途；其中所述经修饰的胸腺素β4具有如seqidno:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述药物包含有效量的所述经修饰的胸腺素β4。在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4可以以单位剂量形式存在于所述药物中，以便于施用。
在某些实施方案中，所述药物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂（例如注射液、冻干粉剂）等形式。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
在某些示例性实施方案中，所述药物为注射剂（例如注射液或冻干粉剂）。例如，可通过下述方法来制备无菌注射液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的如本文所述的经修饰的胸腺素β4，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。
在某些实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些示例性实施方案中，所述药物包含无菌可注射液体（如水性或非水性悬浮液或溶液）。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗糖尿病周围神经病变的方法，其包括向有此需要的受试者施用经修饰的胸腺素β4；其中所述经修饰的胸腺素β4具有如seqidno:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4用于在所述患者诊断后立即施用，连续使用10到30天。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部（如，粉剂、药膏或滴剂），或鼻腔途径。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。
在某些示例性实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4通过胃肠外途径施用（例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射或肌内注射）。
在另一个方面，本发明提供了一种经修饰的胸腺素β4，其用于在受试者中治疗糖尿病周围神经病变，其中所述经修饰的胸腺素β4具有如seqidno:1所示的氨基酸序列。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“糖尿病周围神经病变”是指，在排除其他原因的情况下，糖尿病患者出现与周围神经功能障碍相关的症状和(或)体征。糖尿病周围神经病变是糖尿病的常见并发症，临床表现包括多种类型，其中以远端对称性多发性周围神经病（distalsymmetricpolyneuropathy，dspn）和自主神经病最为常见。
如本文中所使用的，术语“治疗”是指，一种疾病或病症或与正在治疗的疾病或病症相关的症状的严重程度的缓解或减轻。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995），并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂等。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝），弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂）等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂是无菌可注射液体（如水性或非水性悬浮液或溶液）。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“有效剂量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的用药剂量。例如，“治疗疾病有效剂量”是指，能够有效治疗，阻止，或延迟疾病（例如糖尿病周围神经病变）的发生而使用的药物剂量。测定这样的有效剂量完全在本领域技术人员的能力范围之内。
如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物（例如，小鼠或大鼠）、非人灵长类动物（例如，猕猴或食蟹猴）或人。
糖尿病周围神经病变(dpn)是指在排除其他原因的情况下，糖尿病患者出现与周围神经功能障碍相关的症状和(或)体征，糖尿病周围神经病变是糖尿病的常见并发症。dpn的主要病理变化是无髓鞘神经纤维轴突变性，甚至消失；有髓鞘神经纤维髓鞘阶段性或弥散性皱缩或脱髓鞘，以及髓鞘再生引起的朗飞结节间长度改变。目前仅有度洛西汀、普瑞巴林和加巴喷丁被美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局批准用于治疗糖尿病周围神经病变疼痛症状。已有研究表明天然结构的胸腺素β4对糖尿病周围神经病变有很好的治疗作用，尤其是在神经修复方面。本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现，在糖尿病周围神经病变的动物模型中，施用经修饰的胸腺素β4同样能够显著改善模型动物坐骨神经的血管功能障碍以及神经系统功能，50到80天与模型对照组对比有显著性差异，且经与天然结构的胸腺素β4对比研究后，出人意料的发现，本发明采用的经修饰的胸腺素β4有效剂量与天然结构胸腺素β4有效剂量的比例为1：1200，本发明选用的结构能显著降低用药剂量，从而提高胸腺素β4的临床安全性，增加胸腺素β4的成药性以及降低临床使用价格。因而，本发明的经修饰的胸腺素β4可超低剂量地用于治疗糖尿病周围神经病变，这一发现不仅大幅度降低本项目成药风险，而且还能显著降低糖尿病周围神经病变患者的治疗费用，让更多的患者能够治愈方面具有重大意义。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的，以及在各种参考文献中描述的常规方法，进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例
本实施例通过小鼠糖尿病周围神经病变模型来评价修饰后的重组人胸腺素β4对治疗糖尿病周围神经病变的效果。
1.材料与方法
1.1药物：
经修饰的重组人胸腺素β4（以下简称为rhtβ4），北京诺思兰德生物技术股份有限公司提供，批号为c-20180101（其序列如seqidno:1所示）；规格：100μg/支。临用时用生理盐水配制成所需浓度。
天然结构人胸腺素β4，由上海肽仕生物科技有限公司化学合成获得（以下简称为ctβ4），临用时用生理盐水配制成所需浓度。
1.2仪器：
one-touch稳择易型血糖仪,美国强生公司产品；
neuromatic-2000型肌电图仪，丹迪公司产品；
eg1160型石蜡包埋机，德国leica公司产品；
rm2255型切片机，德国leica公司产品；
dm6000b光学显微镜，德国leica公司产品。
1.3实验动物造模：
wistar大鼠（spf级，雄性，体重180~200g，2.5到3月龄）由北京维通利华公司提供。大鼠购回后，适应性喂养5天，确认动物状态良好后开始造模。随机挑选10只作为正常对照组,其余70只造模：大鼠禁食不禁水12h后称重,测血糖,编号。将链脲佐菌素（stz）在冰浴环境下放入事先配好的0.1mol/l柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(ph4.4)中，配制成2%的stz溶液。stz按照65mg/kg剂量一次性进行左侧腹腔注射，正常对照组以等剂量相同缓冲液进行左侧腹腔注射。72小时后测大鼠血糖，选血糖>16.7mmol/l、尿糖+++一++++者作为成模鼠,共成模58只。喂养10周后，即成为糖尿病周围神经病变大鼠模型。
1.4动物分组：
58只造模成功的模型大鼠随机分为模型对照组（10只）、ctβ46000ug/kg剂量组（12只）、ctβ45ug/kg剂量组（12只）、rhtβ41ug/kg剂量组（12只）、rhtβ45ug/kg剂量组（12只），10只正常大鼠作为正常对照组，总共6组68只大鼠进入实验。
1.5给药方法：
治疗组于造模成功10周后开始给药，给药方式为腹腔注射，给药剂量分别为rhtβ4给药剂量为1μg/kg、5μg/kg，ctβ4给药剂量为5μg/kg、6000μg/kg，每日给药1次，对照组和模型组给予等体积的生理盐水，持续给药15天，共计注射15次。
1.6各组动物整体征象观察：
每日观察大鼠进食、饮水情况、尿量、以及皮毛光泽度，精神状况，活动度等变化，并于首次给药后10周进行体重测定。
1.7运动神经传导速度（mncv）及感觉神经传导速度（sncv）的测定
首次给药后于10周进行测定。大鼠麻醉后,手术分离左侧坐骨神经，应用neuromatic-2000型肌电图仪测定大鼠mncv和sncv。mncv测定方法:将记录电极垂直刺入胫前肌肌腹中部，用刺激电极以20ma的刺激电流刺激坐骨神经近端，肌电图将所得动作电位显示于示波器上,将两电极间距离输入计算机，得出mncv；sncv测定方法:将记录电极置于坐骨神经近端，刺激电极以30ma的刺激强度刺激腓端肠神经近端，记录刺激所得波形，输入两电极间距离，得出sncv。
1.8腓肠神经有髓神经纤维数量分析
首次给药后于10周进行测定。将右侧腓肠神经远端固定于3%戊二醛0.1mol/l磷酸盐缓冲液中，4℃过夜;应用pbs缓冲液冲洗，1%锇酸后固定，经冲洗、脱水，用环氧树脂包埋;制备1μm半薄横断面切片，用1%甲苯胺蓝溶液染色30分钟，经85%酒精清洗、脱色分化至背景为淡蓝色，然后树胶封片。以200倍放大率采集腓肠神经横切片图像，采用多功能真彩色病理图像分析系统进行有髓神经纤维计数，测定腓肠神经纤维总截面积、神经纤维密度及神经纤维平均截面积，以观察腓肠神经的病理改变。
1.9腓肠神经有髓神经纤维超微结构观察
制备有髓神经纤维的超薄切片,乙酸双氧铀和枸椽酸铅染色,透射电镜观察神经纤维的病理改变。
2.0统计学处理
文中数据以均数与标准差（
2.实验结果
2.1各组实验动物整体观察
stz注射72小时后大鼠的血糖均升高至大于16.7mmol/l，并逐渐出现多饮、多食、多尿，体重增长缓慢等糖尿病症状，到首次给药10周后，与正常对照组比较，各组体重都有显著性差异，结果见表1。
表1.各组实验动物体重变化情况
（注：与正常对照组相比，“#”示p＜0.05，“##”示p＜0.01）
2.2各组实验动物mncv及sncv的变化
首次给药后10周观察时，与正常对照组相比，模型对照组的mncv及sncv均明显减慢,模型对照组最低（p<0.01）；ctβ45ug/kg治疗组和rhtβ41ug/kg治疗组次之(p<0.05)；rhtβ45ug/kg治疗组、ctβ46000ug/kg治疗组与正常对照组比较也降低但差异无统计学意义(p>0.05)，结果见表2。
表2.首次给药后第10周各组mncv及sncv的变化（x±s）
（注：与正常对照组相比，“#”示p＜0.05，“##”示p＜0.01）
2.3腓肠神经有髓神经纤维数量分析
正常对照组可见神经髓鞘结构完整，神经轴突电子密度均匀；模型对照组可见有髓神经纤维髓鞘发生分离,轴突内有较多的无颗粒囊泡状结构；各治疗组均有改善，其中ctβ46000ug/kg治疗组和rhtβ45ug/kg治疗组未见明显的髓鞘分离现象,轴突内无颗粒囊泡状结构明显减少。
首次给药后10周观察时，与正常对照组相比，模型对照组大鼠腓肠神经纤维横截面差异(p<0.05)，结果见表3。
表3.首次给药后第10周各组腓肠神经有髓神经纤维数量的比较（x±s）
（注：与正常对照组相比，“#”示p＜0.05，“##”示p＜0.01）
综上，ctβ4和rhtβ4都对糖尿病周围神经病变有很好的治疗作用，能显著增加糖尿病大鼠的mncv及sncv，显著改善糖尿病大鼠腓肠神经纤维横截面总面积和神经纤维平均面积。而ctβ45ug/kg治疗结果与模型组比较没有显著差异，表明ctβ4组只有在1200倍剂量时才表现出与rhtβ45ug/kg治疗组同等治疗效果。由此，rhtβ4在对大鼠糖尿病周围神经病变的治疗效果方面，出乎意料地优于天然结构的胸腺素β4。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员可以理解为：根据已经公布的所有材料，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部内容均由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110>北京诺思兰德生物技术股份有限公司
<120>经修饰的胸腺素β4在治疗糖尿病周围神经病变方面的用途
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>44
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
glyserasplysproaspmetalagluileglulyspheasplysser
151015
lysleulyslysthrgluthrglnglulysasnproleuproserlys
202530
gluthrilegluglnglulysglnalaglygluser
3540
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