调节肽与曼宋酮E在制备治疗改进的白血病药物及其用途的制作方法

本发明涉及调节肽与曼宋酮e在制备治疗改进的白血病药物中的用途，属于生物制药领域。
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：白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。根据白血病的分化程度、自然病程的长短可分为急、慢性白血病。急性白血病细胞分化停滞在早期阶段，以原始及早幼细胞为主，疾病发展迅速，病程数月。慢性白血病细胞分化较好，以幼稚或成熟细胞为主，发展缓慢，病程数年。按病变细胞系列分类，包括髓系的粒、单、红、巨核系和淋巴系的t和b细胞系。临床上常将白血病分为淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病等。白血病在临床表现上，儿童及青少年急性白血病多起病急骤。常见的首发症状包括发热、进行性贫血、显著的出血倾向或骨关节疼痛等。起病缓慢者以老年及部分青年病人居多，病情逐渐进展。此外，少数患者可以抽搐、失明、牙痛、牙龈肿胀、心包积液、双下肢截瘫等为首发症状。发热是白血病最常见的症状之一，表现为不同程度的发热和热型。发热的主要原因是感染，其中以咽峡炎、口腔炎、肛周感染最常见，肺炎、扁桃体炎、齿龈炎、肛周脓肿等也较常见。耳部发炎、肠炎、痈、肾盂肾炎等也可见到，严重者可发生败血症、脓毒血症等。发热也可以是急性白血病本身的症状，而不伴有任何感染迹象。感染病原体以细菌多见，疾病后期，由于长期粒细胞低于正常和广谱抗生素的使用，真菌感染的可能性逐渐增加。病毒感染虽少见但凶险，须加以注意。肝脾和淋巴结肿大以轻、中度肝脾肿大为多见。all比aml肝脾肿大的发生率高，慢性比急性白血病脾脏肿大更为常见，程度也更明显。淋巴结肿大all也比aml多见，可累及浅表或深部如纵隔、肠系膜、腹膜后等淋巴结。中枢神经系统白血病(cnsl)cnsl系急性白血病严重并发症，常见于all和aml中的m4和m5，但其他类型也可见到。由于常用化疗药物难以透过血脑屏障，因此成为现代急性白血病治疗的盲点和难点。浸润部位多发生在蛛网膜、硬脑膜，其次为脑实质、脉络膜或颅神经。重症者有头痛、呕吐、项强、视乳头水肿，甚至抽搐、昏迷等颅内压增高的典型表现，可类似颅内出血，轻者仅诉轻微头痛、头晕。颅神经(第vi、vii对颅神经为主)受累可出现视力障碍和面瘫等。慢性粒细胞白血病的症状：起病缓慢，早期常无自觉症状，多因健康检查或因其他疾病就医时才发现血象异常或脾肿大而确诊。随着病情发展，可出现乏力、低热、多汗或盗汗、体重减轻等陈代谢亢进的表现。由于脾肿大而感左上腹坠胀、食后饱胀等症状。检查时最为突出的是脾肿大，往往就医时已达脐平面。病情可稳定1～4年，之后进入加速期，迅速出现贫血及更多症状，然后很快进入急变期，可以急变为aml或者all，临床表现与急性白血病完全一样，治疗效果和预后则比原发性急性白血病更差，通常迅速死亡。由于白血病分型和预后分层复杂，因此没有千篇一律的治疗方法，需要结合细致的分型和预后分层制定治疗方案。目前主要有下列几类治疗方法：化学治疗放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等。通过合理的综合性治疗，白血病预后得到极大的改善，相当多的患者可以获得治愈或者长期稳定，白血病是“不治之症”的时代过去了。急性早幼粒细胞白血病发病凶险、早期死亡率高。中国医学科学院药物所胡卓伟研究团队发现，假性激酶通过与原癌蛋白相互作用，维持了该蛋白的稳定，抑制了介导的抗癌作用，能促进这一疾病的发病、进展和对治疗的耐受，从而为该病的治疗提供了新的概念和药物靶点。重组人白介素中，有治疗白血病作用的主要是rhil-11、rhil-2两种。il-2是一种具有多种生物活性的细胞因子，现代免疫学研究表明，il-2生长因子是一种可促血小板，可推进骨髓内造血细胞的增殖，可促进已活化的t细胞增殖并分化成熟为效应的td细胞和tc细胞。它具有的免疫调节作用，能有效自然杀伤毒性细胞和刺激t细胞，从而诱导淋巴因子生成杀伤细胞，起到治疗白血病的作用。研究证明，干扰素具有免疫调节、抗肿瘤细胞增殖和抗病毒作用。自从20世纪80年代开始，ifn-α就用于治疗慢性髓系白血病(cml)，与常用的传统化疗比较，它能诱导并出现持久的细胞遗传学反应，而延长生成期和慢性期。血小板的减少是急性白血病患者接受化疗后的常见并发症，其发症原因是化疗后发生骨髓抑制，从而致使血小板减少，并可引起出血的倾向，这正是导致急性白血病患者死亡的主要原因之一。临床中传统的医治方法是给予血小板进行反复注射治疗，然而反复注射会生成同种血小板抗体，导致疗效较低。血源日益紧张的今天，血小板输注困难，唯有新的治疗方法才能解开如今的难题。cn104292306a中公开了一种多肽alkg，其氨基酸序列为lys-phe-val-cys-gly-val-ser-leu-cys-leu-leu-gly，分子量为1238.57，其用于制备白血病药物。该多肽alkg对于hl60的24h、36h、48h凋亡诱导率分别为：18.2％、29.58％、32.53％，对于u937的24h、36h、48h凋亡诱导率分别为：19.89％、19.92％、25.81％。虽然该肽alkg对白血病细胞系hl60与u937具有凋亡诱导效应。但是仍有提高的空间。发明人为了提供对白血病有较好治疗的药物，在前期的研究中，发现曼宋酮e对白血病k562细胞增殖和凋亡都有一定的影响，曼宋酮e作用k562细胞12h后可使caspase-8分子逐渐断裂，活化，同时可以观察到有caspase-3和parp的断裂和活化，表明曼宋酮e可以通过活化caspase-8信号途径诱导k562细胞凋亡。细胞凋亡过程中bcl-2家族蛋白在凋亡的调节过程中起非常重要的作用，caspase-9活化状态可影响包括bax，bcl-xl等bcl-2家族蛋白的表达发生变化，调节细胞浆内细胞色素c内流到线粒体中。本研究结果显示，曼宋酮e可通过活化caspase-8、caspase-3途径诱导k562细胞凋亡；bcl-2家族蛋白不参与凋亡的调节(参见：曼宋酮e对白血病k562细胞增殖和凋亡的影响，苗玉迪，等，中草药，第40卷第9期)，但是发明人经过多年的研究，认为该药物还有提高的空间。近年研究发现急性白血病细胞能合成、分泌vegf、bfgf等血管生成调控因子促进血管生成，而血管生成在白血病细胞的生长、浸润和转移中起重要作用。因此，抗血管新生治疗有望成为急性白血病的一种新的治疗手段。因此发明人在此基础上进行了改进，提供了一种新的治疗白血病的药物。技术实现要素：发明人前期研究的药物在治疗效果上仍存在改进的空间，通过模型筛选，获得了能够促进曼宋酮e活性的调节肽，将该调节肽与曼宋酮e一起来制备治疗白血病药物能够用来治疗白血病用。具体的，所述的调节肽序列如seqidno：1所示。本发明另外提供的一技术方案为：调节肽和曼宋酮e在制备治疗白血病的药物中的应用，其中调节肽的序列如seqidno：1所示。进一步的，其中药物的量比为：10μg/ml多肽与25μg/ml的曼宋酮e进行组合使用。本发明另外，还再添加其它抑制白血病细胞迀移、侵袭和增殖的药物。另外，在药物中还包括药物可接受的辅料复配制成药物组合物。在本发明中，所述药物可接受的辅料包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。辅料其本身并不是必要的活性成分，且使用后没有过分的毒性。运类辅料包括但不限于：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等。最优的，所述药物中含有铂类抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物为顺铂或卡铂。作为优选，所述耐药白血病是针对临床常用化疗药物阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷、氨甲喋呤、伊马替尼或环磷酰胺中的一种或两种以上耐受的耐药白血病。所述白血病是指急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病，慢性白血病以及浆细胞白血病、慢粒急变白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病，巨核细胞白血病，未分化型急性白血病或组织嗜碱细胞白血病、低增生性白血病类型的耐药白血病。本发明所具有的有益效果：将该调节肽与曼宋酮e一起来制备治疗白血病药物能够用来治疗白血病用，具有剂量小，费用适中，用药方便，副作用小等优点。对白血病的治疗带来了新的希望。附图说明图1为细胞生长图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明。实施例1k562白血病细胞的培养肿瘤细胞株：k562白血病细胞(陕西省人民医院血液病研究室保存)，从液氮中复苏后，将k562细胞置于含10％灭活新鲜小牛血清rpmi-1640培养液，在37℃，体积分数为5％co2、饱和湿度条件下培养，保持细胞活力＞97％，取指数生长期的k562细胞(1x105/ml)分为对照组与实验组备用。实施例2细胞增殖抑制实验细胞增殖抑制实验：将处于对数生长期的k562细胞以1×105/ml加入24孔板中，每孔1ml，药物分别为10μg/ml多肽组，25μg/ml的曼宋酮e药物组，10μg/ml多肽+25μg/ml的曼宋酮e药物组，pbs空白对照组，于12、24、36、48h后记数，用台盼蓝拒染实验记数活细胞，实验重复3次，取平均值，描绘生长曲线，见图1所示，其中多肽序列如seqidno：1所示。从图1可以看出，单独采用多肽对于细胞的抑制效果很弱，而将多肽与曼宋酮e药物仪器能够显著的抑制细胞的增殖以及促进细胞的凋亡，在48h时细胞存活率不到5％，表现出极好的抑制效果。实施例3蛋白的表达测定westernblotting测定蛋白的表达：取对数生长期的k562细胞，离心，用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基制备成浓度为3×105/ml的细胞悬液，于6孔板中每孔接种1ml，将平板置于37℃、5％co2培养箱。加入10μg/ml多肽组，25μg/ml的曼宋酮e药物组，10μg/ml多肽+25μg/ml的曼宋酮e药物组，pbs空白对照组，分别在给药后0、48h后，离心收集细胞，用蛋白裂解液裂解细胞后，离心去细胞碎片，95℃煮10min后，蛋白定量，40μg/孔，上样于10％sds-聚丙烯凝胶电泳。将胶上蛋白转移到pvdf膜后，5％脱脂奶中封闭过夜，按抗体稀释比例加入一抗室温孵育3h，tbst洗涤2次，每次10min。加入相应二抗，室温孵育30min，tbst洗涤3次，每次10min。用ecl发光试剂盒发光，冲片，照相。统计学处理：采用spss软件进行统计学处理。通过分析发现，与细胞生长相关蛋白的表达受到一定的影响，具体如下表1：表1细胞生长相关蛋白的表达抑制表组别bcl-xl相对表达量bax相对表达量bcl-2相对表达量β-actin多肽0.820.860.841多肽+曼宋酮e0.270.180.201曼宋酮e1111空白对照组1111从表1上的结果可以看出，多肽+曼宋酮e能够协同的促进bcl-xl、bax以及bcl-2的抑制效果。实施例4：k562细胞vegf蛋白表达的测定。将对数生长期的k562细胞细胞接种96孔板，每孔100ul，置37℃，饱和湿度，5％co2培养箱内培养。加入10μg/ml多肽组，25μg/ml的曼宋酮e药物组，10μg/ml多肽+25μg/ml的曼宋酮e药物组，pbs空白对照组分别转染细胞，72h后离心收取上清夜，vegf蛋白测定按人vegfelisa试剂盒说明书操作(晶美生物工程有限公司)，加入终止液混匀后即刻用酶标仪(bio-rid公司)测定od150值，标准品和样品孔的od值减去空白孔的od值。以标准品的od值为纵坐标，标准品的浓度(pg/ml)为横坐标，绘制标准曲线并求出标准曲线方程。通过样品的od值在标准曲线方程内求出样品vegf浓度。结果见表2。表2elisa法分析各实验组的细胞vegf蛋白的表达水平与空白对照组相比，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01从表2的结果可以看出，采用多肽+曼宋酮e组能够显著的抑制细胞vegf蛋白的表达，由于vegf与血管的生成密切相关，因此，能够预期能抑制相应血管的生成。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可w对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12