子宫内膜异位症肾虚血瘀证大鼠模型的评价方法与流程

本发明涉及生命科学技术领域，特别涉及子宫内膜异位症肾虚血瘀证大鼠模型的评价方法。

背景技术：

作为近代生命科学发展必不可少的手段，动物实验已广泛渗透入中医基础医学和临床医学各个领域。中医动物模型的研制是在中医学整体观念及辨证论治思想指导下，运用藏象学说和病因病机理论，把人类病证原型的某些特征在动物身上加以模拟而成。标准化中医动物模型的复制是推动中医药现代化的重要环节，对中医药事业的发展具有重要的意义。

但目前存在的主要问题是：中医证候实验动物造模不易控制，或直接引用疾病造模方法，缺少准确而有效的鉴定证候特征的途径，给中医临床诊断、疗效评定、新药开发以及国际间交流等造成诸多困难。目前ems的发病原因及病理机制目前尚不明确，也缺乏诊断的金标准，因此极大制约了本病的诊断与治疗。由于伦理学等方面的原因，既不能对人类进行对照研究，也不能进行损伤性研究，无法在ems患者身上观察疾病的全过程。

技术实现要素：

发明的目的在于提供子宫内膜异位症肾虚血瘀证大鼠模型的评价方法，本发明的这种sd大鼠造模方法既以中医理论为指导，又可以用科学的实验方法去证实，使得中医证候实验动物造模易于控制，增加了准确而有效的鉴定证候特征的途径，给中医临床诊断、疗效评定、新药开发以及国际间交流带来极大的便捷，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

子宫内膜异位症肾虚血瘀证大鼠模型的评价方法，准备3月龄雌性sd大鼠，体重200g左右，ems肾虚血瘀证大鼠每日进行阴道细胞涂片检查，首先评价ems肾虚血瘀证sd大鼠模型，包括以下步骤：

步骤1：堕胎伤肾：正常饲养一周后，按2∶1比例与3月龄sd雄性大鼠交配，妊娠第3天开始至妊娠第12天灌服羟基脲蒸馏水溶液，妊娠第12天灌服米非司酮1次，羟基脲动物给药量为每天每百克体重20mg，研粉溶于蒸馏水中灌服，米非司酮动物给药量为每天每百克体重375mg，研粉溶于蒸馏水中灌服，造成孕鼠流产；

步骤2：产后失于调摄：流产后大鼠阴道出血干净次日开始，每日14：00开始分批置入水桶内，水温与室温均保持为(10±0.5)℃，以木棒拔打强迫其不断游泳直到疲劳，时间长短存在个体差异，平均为(10±5)min，共3天，游泳后捞出实验大鼠，不予保温措施，任其暴露于空气中自然晾干；

步骤3：房劳伤肾：正常饲养一周后，措施1、2重复一次；

步骤4：自体内膜移植：无菌条件下麻醉大鼠，剖腹切取右侧宫角处1cm长子宫，剥离子宫内膜，剪取两块各约5mm×5mm的内膜组织块，将上皮层反向对着体壁，左右各一缝固在腹壁上，关腹，4周后随机取3只大鼠再次剖腹切取移植物送检，验证其已成活；

步骤5：模型建立成功后，将大鼠随机分为模型对照组、温经汤组与调肝汤组，药物反证组大鼠模型分别于每日上午以3ml/只灌服温经汤加味和调肝汤，相同环境饲养，用药量2g(kg·d)/每只，为成人临床用量的20倍，每日1次，自由饮食，共4周，4周后，处死大鼠，取血样及腹腔液，进行相应微观指标检测，比较治疗前与治疗后宏观表征与微观指标。

进一步地，选择动情周期4～5天者为合格动物。

进一步地，水桶的直径为50cm，高为100cm，桶内水深为45cm。

进一步地，步骤5的汤加味和调肝汤均为水煎剂。

进一步地，步骤5通过温经汤加味高、中、低剂量和调肝汤对疾病模型组大鼠和ems肾虚血瘀证组大鼠进行干预，测定相应的微观指标进行比较观察。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的子宫内膜异位症肾虚血瘀证大鼠模型的评价方法，本发明从ems肾虚血瘀证入手，结合现代医学自体内膜移植方法，建立ems肾虚血瘀证sd大鼠模型，通过对其宏观表征与微观指标，综合分析动物模型的可靠性，再以方证对应理论为指导，以ems肾虚血瘀证的有效方剂温经汤加味和与肾虚血瘀证无关的调肝汤的治疗效果来评价动物模型，本发明的这种sd大鼠造模方法既以中医理论为指导，又可以用科学的实验方法去证实，使得中医证候实验动物造模易于控制，增加了准确而有效的鉴定证候特征的途径，给中医临床诊断、疗效评定、新药开发以及国际间交流带来极大的便捷。

附图说明

图1为本发明的各组大鼠e2、p水平变化比较图；

图2为本发明的各组大鼠全血黏度指标变化比较图；

图3为本发明的各组大鼠血清igg、iga、igm(g/l)变化比较图；

图4为本发明的各组大鼠血清il-10、il-2、vegf、tnf-α水平变化比较图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

子宫内膜异位症肾虚血瘀证大鼠模型的评价方法，准备3月龄雌性sd大鼠，体重200g左右，ems肾虚血瘀证大鼠每日进行阴道细胞涂片检查，选择动情周期4～5天者为合格动物，首先评价ems肾虚血瘀证sd大鼠模型，包括以下步骤：

步骤1：堕胎伤肾：正常饲养一周后，按2∶1比例与3月龄sd雄性大鼠交配，妊娠第3天开始至妊娠第12天灌服羟基脲蒸馏水溶液，妊娠第12天灌服米非司酮1次，羟基脲动物给药量为每天每百克体重20mg，研粉溶于蒸馏水中灌服，米非司酮动物给药量为每天每百克体重375mg，研粉溶于蒸馏水中灌服，造成孕鼠流产；

步骤2：产后失于调摄：流产后大鼠阴道出血干净次日开始，每日14：00开始分批置入直径约50cm，高约100cm水桶内，桶内水深约45cm，水温与室温均保持为(10±0.5)℃，以木棒拔打强迫其不断游泳直到疲劳，时间长短存在个体差异，平均为(10±5)min，共3天，游泳后捞出实验大鼠，不予保温措施，任其暴露于空气中自然晾干；

步骤3：房劳伤肾：正常饲养一周后，措施1、2重复一次；

步骤4：自体内膜移植：无菌条件下麻醉大鼠，剖腹切取右侧宫角处1cm长子宫，剥离子宫内膜，剪取两块各约5mm×5mm的内膜组织块，将上皮层反向对着体壁，左右各一缝固在腹壁上，关腹，4周后随机取3只大鼠再次剖腹切取移植物送检，验证其已成活；

步骤5：模型建立成功后，将大鼠随机分为模型对照组、温经汤组(方证相应)与调肝汤组(方证相左)，药物反证组大鼠模型分别于每日上午以3ml/只灌服温经汤加味(水煎剂)和调肝汤(水煎剂)，相同环境饲养，用药量2g(kg·d)/每只，为成人临床用量的20倍，每日1次，自由饮食，共4周，4周后，处死大鼠，取血样及腹腔液，进行相应微观指标检测，比较治疗前与治疗后宏观表征与微观指标，通过温经汤加味和调肝汤对大鼠模型的反证，评价模型的可靠性；研究中医同病异证的治疗；揭示温经汤加味治疗ems肾虚血瘀证的作用机理。通过温经汤加味高、中、低剂量和调肝汤对疾病模型组大鼠和ems肾虚血瘀证组大鼠进行干预，测定相应的微观指标进行比较观察。

对各组的大鼠治疗前后雌激素水平变化进行比对，比对结果如图1，从图中可以看出，δp＞0.01，与空白组相比；#p＞0.05，与ems肾虚血瘀证组相比。说明经温经汤加味中、高剂量治疗后，ems肾虚血瘀证大鼠的e2、p水平与空白组相比无显著差异，说明温经汤加味在适合的剂量情况下可以通过调整性激素水平异常而治疗疾病。

对各组的大鼠治疗前后血液流变学指标水平变化进行比对，比对结果如图2，从图中可以看出，δp＜0.05，与空白组相比；*p＞0.05，与空白组相比；★p＜0.05，与ems肾虚血瘀证组相比；#p＞0.05，与ems肾虚血瘀证组相比。

对各组的大鼠治疗前后igg、iga、igm水平变化进行比对，比对结果如图3，从图中可以看出，δp＜0.05，与空白组相比；*p＞0.05，与空白组相比；★p＜0.05，与ems肾虚血瘀证组相比；#p＞0.05，与ems肾虚血瘀证组相比。

对各组的大鼠治疗前后il-10、il-2、vegf、tnf-α水平变化进行比对，比对结果如图4，从图中可以看出，δp＜0.05，与空白组相比；*p＞0.05，与空白组相比；★p＜0.05，与ems肾虚血瘀证组相比；#p＞0.05，与ems肾虚血瘀证组相比。

温经汤加味作为临床上治疗ems肾虚血瘀证的有效方剂，对于ems肾虚血瘀证动物模型的多项微观指标有较好的调整作用，尤其是中、高剂量组。调肝汤组则对相应的微观指标没有调整作用甚或起到了相反的作用。因此，从方证相应的角度来说，本发明所建立的病证结合动物模型基本符合ems肾虚血瘀证的病理变化，并且作为疾病基础研究的载体较为适宜。本发明通过“方证相应”和“方证相左”对ems肾虚血瘀证大鼠模型的可靠性进行评价，初步建立了较为完整的ems肾虚血瘀证动物模型微观指标评价体系(包括性激素、血液流变学指标、emab、血清iga、igg、igm、il-10、il-2、vegf、tnf-α等)。

综上所述，本发明提出的子宫内膜异位症肾虚血瘀证大鼠模型的评价方法，本发明从ems肾虚血瘀证入手，结合现代医学自体内膜移植方法，建立ems肾虚血瘀证sd大鼠模型，通过对其宏观表征(行为、体重、舌象、组织病理学检查等)与微观指标(激素、免疫因子、基因多态性变化等)，综合分析动物模型的可靠性，再以方证对应理论为指导，以ems肾虚血瘀证的有效方剂温经汤加味(“证实”)和与肾虚血瘀证无关的调肝汤(“证伪”)的治疗效果来评价动物模型，本发明的这种sd大鼠造模方法既以中医理论为指导，又可以用科学的实验方法去证实，使得中医证候实验动物造模易于控制，增加了准确而有效的鉴定证候特征的途径，给中医临床诊断、疗效评定、新药开发以及国际间交流带来极大的便捷。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。