酚番红花红介导的声动力抗菌化学疗法在抑制金黄色葡萄球菌活性方面应用的制作方法

本发明涉及声动力抗菌化学疗法、抑菌方法，属于医药技术领域，特别涉及一种声敏剂酚番红花红(sb)在介导声动力抗菌化学疗法时对金黄色葡萄球菌的活性抑制中的应用。

背景技术：

微生物感染是术后并发症的主要因素，传染病的重要来源，部分感染病有着极高的致死率。目前临床中常用的治疗方法为抗生素治疗，但不恰当的选取与过量的使用会导致耐药菌甚至多重耐药菌的出现。因为对于人类健康的威胁性日渐增大，对于治疗细菌感染上新方法的渴求愈加迫切，各国科学家也开始寻找抗微生物感染的新方法。

声动力疗法(sdt)是声敏剂及其衍生物协同超声共同杀伤肿瘤细胞的一种新型抗肿瘤方法。声动力抗菌化学疗法(sact)是基于sdt的原理，将其应用于抗微生物感染的新方法，该法利用超声波较强的组织穿透性，采用超声照射聚集在患病组织的声敏剂，借助激活声敏剂产生活性氧及其诱发的一系列声化学反应或物理作用杀伤微生物。目前在已经在医疗器械消毒，关节置换术后感染及生物材料细菌感染等相关领域取得初步成果。它具有作用部位更深，毒性小，使用范围广，安全系数高，价格可接受及不良反应较少等优势和巨大的潜力。声敏剂在sact中扮演了重要角色，筛选出具有良好声动力活性的声敏剂是设计与开发声敏剂的一条重要途径。

酚番红花红(sb)物理化学性质稳定，所属的二苯并杂环类化合物中，有部分化合物已经被报道具有一定的声敏活性，并且具有易获得、毒性小等优点。

技术实现要素：

本发明目的在于提供sb在介导sact对金黄色葡萄球菌的活性抑制中的应用，该应用能有效提高金黄色葡萄球菌的敏感性，抑制其生长。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：

sb在介导sact时对金黄色葡萄球菌的活性抑制中的应用。

所述的应用，具体为：将sb、金黄色葡萄球菌菌悬液和生理盐水依次加入离心管中混合，将离心管放入超声体系中进行超声处理，处理后，取溶液稀释后涂于固体培养基表面，移入37℃培养箱内倒置培养，之后进行菌落计数并计算抑菌率。

所述的应用，所述的超声体系中sb浓度为20-60μmol/l。

所述的应用，所述的金黄色葡萄球菌菌悬液的浓度为1×10⁷cfu/ml。

所述的应用，所述超声体系中超声照射时间为15-45min。

所述的应用，所述超声体系中超声频率为40khz，超声功率为450w。

所述的应用，所述超声体系中实验温度为20℃和37℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明所述的sb在介导sact对金黄色葡萄球菌的活性抑制方面有着不错的效果。

本发明所涉及的sact中超声波是至关重要的激发源，其对组织的影响起源于一种称为空化效应的现象；同时，超声具有极强的穿透性，其在液体中的传播促进了气体或蒸汽腔的形成(空化泡)，空化泡所经历的萎缩和生长是由超声波的不同压力阶段生产的交替性膨胀和压缩产生的，其中交替的收缩和膨胀会增加强度直到内爆。崩溃的空化泡产生了冲击波和/或液体喷射的形成，产生的力度可以轻易的穿过细胞膜，并能够诱导生物分子和细菌发生永久或瞬间的变化。超声的化学效应可以导致细胞膜渗透性的短暂改变，在超声波的照射下观察到支持增强细胞对低分子和高分子量化合物吸收的现象。磷脂膜本质上是能够吸收由声波产生的机械能的，且能与变形(压缩或扩张)的膜内空间产生反应，这种性质在超声介导化合物靶向和控制化合物在一些治疗区域的释放中得到了充分的利用。

本发明的声敏剂为sb，其介导的sact可以提高其对金黄色葡萄球菌的活性抑制，提供了可用于sact的新声敏剂，该法具有更高的有效性、安全性和操作性。且sb和超声的协同作用对金黄色葡萄球菌的抑菌率高于单独使用sb或单独超声时的抑菌率。本发明利用sb介导的sact抑制了金黄色葡萄球菌的活性，为克服细菌耐药性提供了一种新思路。

附图说明

图1为sb浓度对其介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响。

图2为超声时间对sb介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响。

图3为加入顺序对sb介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响。

图4为超声体系温度对sb介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：实验溶液的配制

(1)液体培养基的配制

称取蛋白胨0.2g、酵母浸粉0.2g、氯化钠0.1g，置于50ml锥形瓶并加水至20ml；将瓶口用棉塞封好包以报纸，用棉绳扎紧于121℃高压蒸汽灭菌15min后待用。

(2)固体培养基的制备

分别称取6.60g营养琼脂，置于2个250ml锥形瓶，分别加水至200ml，加热使其溶解后，将瓶口用胶塞封好，并用报纸包裹再用棉线扎紧，121℃高压蒸汽灭菌15min。

(3)生理盐水的制备

称取9g氯化钠，用蒸馏水将其溶解，于1000ml容量瓶定容，即为0.9％nacl生理盐水。将配制好的生理盐水分装于100ml锥形瓶内，瓶口塞以胶塞，用报纸包裹再用棉绳扎紧，121℃高压蒸汽灭菌15min后待用。

(4)菌悬液的制备

无菌操作条件下用无菌接种环平板培养的金黄色葡萄球菌一个菌落，置于含20ml无菌液体培养基的锥形瓶内。于37℃、100r/min的条件下摇床培养24h。之后取300μl此菌悬液并将其置于已灭菌且装有10ml生理盐水的锥形瓶中，摇匀后取溶液100μl，置于装有9.9ml无菌生理盐水的锥形瓶内进行梯度稀释，摇匀，再取稀释过后的溶液100μl涂于固体培养基表面，放入37℃培养箱内倒置培养18h，菌落计数法统计后调整菌悬液浓度，实验用菌悬液浓度为1×10⁷cfu/ml，于4℃冷藏备用。

(5)化合物溶液的配制

称取sb3.2mg，取蒸馏水溶解后定容至10ml容量瓶内，配成浓度为1×10³μmol/l的化合物溶液，为实验用溶液，避光待用。

实施例2：sb浓度对其介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响

取8个5ml连盖离心管，包以报纸再用棉绳扎紧。取8个空锥形瓶，分别用棉塞封好瓶口，牛皮纸包裹后再用棉线扎紧。取生理盐水100ml，装于锥形瓶中。将以上物品121℃高压蒸汽灭菌15min后待用。超净台紫外灭菌30min后，在点燃的酒精灯周围进行实验。无菌条件下，取8个已灭菌的5ml连盖离心管，分为两组，每组四个，分别为超声组和未超声组。分别向超声组和未超声组离心管内按顺序加入生理盐水1960μl、1920μl、1880μl、1840μl，化合物溶液0μl、40μl、80μl、120μl与1×10⁷cfu/ml的菌悬液40μl。化合物最终浓度为0μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、60μmol/l。将离心管标记好后，用封口膜将每个离心管封好以防超声时进水与过程中染菌。将超声组放入超声波清洗器中进行超声照射40min，控制超声过程水温为20℃，水位均控制在70mm，超声频率为40khz，超声功率为450w；未超声组置于暗处20℃条件下

超声后，分别取超声溶液与未超声的溶液100μl，置于装有9.9ml无菌生理盐水的锥形瓶内，摇匀，再分别取稀释过后的溶液100μl于固体培养基表面，用玻璃耙子涂匀，做好标记再移入培养箱内倒置培养18h，之后进行菌落计数并计算抑菌率。

实验结果如图1所示。从图1中可以看出，sb对金黄色葡萄球菌有一定程度的抑制作用，且随着浓度增大，抑菌效果有所增强。当与超声照射结合后，抑菌效果增强增。同时可以看出，化合物与超声结合后随着其浓度的增大而抑菌效果增强，即具有浓度依赖性。

实施例3：超声时间对sb介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响

无菌条件下，取8个已灭菌的5ml连盖离心管，分为两组，每组4个，分别为化合物组和未加化合物组；然后分别向加化合物组离心管内加入1×10⁷cfu/ml的菌悬液40μl，化合物溶液80μl；再分别向未加化合物组离心管内加入1×10⁷cfu/ml的菌悬液40μl，化合物溶液0μl；每组再补加生理盐水至2ml。将离心管标记好后，用封口膜将每个离心管封好以防超声时进水与过程中染菌。将各组超声进行照射，超声过程中将水温控制在20℃，并适时调整离心管与超声探头接触位置，以确保同一超声探头处的离心管接受均匀超声照射，超声时水位控制在70mm，超声频率为40khz，超声功率为450w；两组分别于15min、30min、45min进行。

超声后，分别取样100μl，置于装有9.9ml无菌生理盐水的锥形瓶内，摇匀，再分别取稀释过后的溶液100μl于固体培养基表面，用玻璃耙子涂匀，做好标记，移入培养箱内倒置培养18h，之后进行菌落计数并计算抑菌率。

实验结果如图2所示。从图2中可以看出，随着单独超声时间的延长，超声效果增强；与sb结合超声不同时间的效果都要优于单纯超声条件下对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。且抑菌效果随着超声照射时间的延长而增强。

实施例4：加入顺序对sb介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响

无菌条件下，取8个已灭菌的5ml连盖离心管。一组同实例2中超声组步骤，另一组分别向离心管内按顺序加入生理盐水1960μl、1920μl、1880μl、1840μl与1×10⁷cfu/ml的菌悬液40μl，放入超声波清洗器中进行超声照射30min，超声照射后分别按顺序加入化合物溶液0μl、40μl、80μl、120μl，化合物最终浓度为0μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、60μmol/l。在超声照射时，用封口膜将每个离心管封好以防超声时进水与过程中染菌，控制超声过程水温为20℃，水位均控制在70mm，超声频率为40khz，超声功率为450w。

分别对先超声与后超声组进行取样100μl，置于装有9.9ml无菌生理盐水的锥形瓶内，摇匀，再分别取稀释过后的溶液100μl于固体培养基表面，用玻璃耙子涂匀，做好标记，移入培养箱内倒置培养18h，之后进行菌落计数并计算抑菌率。

实验结果如图3所示。从图3中可以看出，先加入化合物再进行超声照射的抑菌效果是要优于先进行超声照再加入化合物的，说明超声与化合物是协同作用于金黄色葡萄球菌的。

实施例5：超声体系温度对sb介导sact抑制金黄色葡萄球菌活性的影响

无菌条件下，取8个已灭菌的5ml连盖离心管，分别向离心管内加入同实施例2中相同条件的生理盐水、化合物溶液及1×10⁷cfu/ml的菌悬液40μl。将离心管标记好后，用封口膜将每个离心管封好以防超声时进水与过程中染菌。后按照实验分组，将各组进行超声照射30min。控制超声过程水温分别为20℃、37℃，水位均控制在70mm。

超声后，分别取不同温度组的溶液100μl，置于装有9.9ml无菌生理盐水的锥形瓶内，摇匀，再分别取稀释过后的溶液100μl于固体培养基表面，用玻璃耙子涂匀，做好标记，，移入培养箱内倒置培养18h，之后进行菌落计数并计算抑菌率。

实验结果如图4所示，从图4中可以看出，随着实验时温度的升高，温度对于sb在不同浓度下的抑菌效果的提升是较为显著的。