一种增强藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的免疫制剂及提取方法与流程

本发明涉及一种生物性免疫增强制剂，尤其是涉及一种增强藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的免疫制剂及提取方法。

背景技术：

口蹄疫俗称“口疮、蹄癀”，早在1544年，hieronymus和fractastorius在意大利发现本病；1893年，我国在云南西双版纳地区曾流行过类似口蹄疫的疫病；1902年在甘肃酒泉发生过口蹄疫的大流行，以后相继在青海、新疆、江苏、河北等地流行，损失严重。口蹄疫疫苗的病原为口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus)，属于小rna病毒科(picornnviridac)口蹄疫病毒属(aphthovirus)的代表种。口蹄疫病毒具有多型性和变异性，有a、o、c、南非1、南非2、南非3和亚洲1七个血清型7个血清型与65个亚型，各型之间抗原性不同，无交叉免疫性。口蹄疫病毒可以引起牛、羊、猪等偶蹄动物发病，人也可以感染。此病传染性强，一旦发病，传播速度很快，流行区域广，不易控制和消灭。目前该病多采用疫苗接种的方法来提高畜群整体抗体水平，从而达到预防口蹄疫的目的。

目前常用的口蹄疫疫苗主要有两类，灭活苗和弱毒苗。灭活苗存在有效抗原成分含量低、免疫期较短，免疫效果较差、不能刺激机体产生有效的细胞免疫应答等缺点。弱毒苗可能引起免疫动物长期带毒、排毒，甚至出现毒血症；由于新的亚型不断出现，毒株的致弱结果和致弱时间出现不确定性，甚至会发生病毒通过基因漂移的方式产生出新的亚型等问题。基因工程疫苗、dna疫苗和活载体疫苗等新型疫苗备受大家关注，但免疫效果与预期效果尚有一定差距。口蹄疫病毒感染羊后，由于症状轻微，易被忽略，因此在羊群中成为长期的传染源，应该在流行病学上引起重视。流行病学的观点认为，绵羊是本病的“保持者”，猪是“扩大器”，牛是“指示灯”。因此，口蹄疫严重影响着畜牧业发展和集约化养殖，在我国被列为一类动物疫病。

青海位于世界屋脊青藏高原的东北部，是全国五大牧区之一，畜牧业是青海的支柱产业，牧民群众赖以生存的产业。藏系绵羊和牦牛是优势品种，存栏数达2400万头(只)，牦牛存栏数居全国第一位，占世界总存栏数的三分之一，共存栏藏羊达1400万只、约占中国藏羊存栏的46％。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种增强藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的免疫制剂及提取方法，其协同疫苗产生作用，提高机体的免疫水平，促进抗体的产生，缩短机体免疫应答期，并延长抗体高峰期，从而使疫苗产生更好的作用。

为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：一种增强藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的免疫制剂的提取方法，其特征在于：所述的提取方法的步骤为：

选取健康牦牛正常分娩后的新鲜胎盘，冷冻保存，然后常温解冻，清洗、剪碎，组织匀浆，反复冻融后冷冻离心，微滤、超滤后制成成品。

一种增强藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的免疫制剂的提取方法的具体步骤为：

选取健康牦牛正常分娩后的新鲜胎盘，冷冻保存，然后常温解冻，洗净血液后用生理盐水冲洗胎盘，去除血管和筋膜，将其剪碎，沥干称重，加2倍的无菌三蒸水，12000r/min匀浆10次，3min/次；制备好的匀浆液-20℃冰冻，反复冻融3次，最后一次融化后以8000r/min冷冻离心沉淀20min，上清液微滤后，用milloporym-10型滤器7000r/min，20min超滤，收集液体即为牦牛胎盘免疫调节因子，无菌分装后冰冻保存，分子量为4242da。

上述牦牛为青藏高原母牦牛。

上述免疫制剂的提取方法提取的生物性免疫制剂。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1.本发明制剂是从青藏高原特有动物牦牛胎盘中提取出的生物性免疫制剂。该制剂进入机体后，能迅速发挥其效应，并持续较长时间，有效提高了口蹄疫疫苗的抗体水平，能完全被机体吸收，且无任何残留，机体注射本产品后增重明显，羊精神活泼。

2、本发明制剂使用途径为肌肉注射，可选择部位随意，且与疫苗同时进入机体效果最佳。最佳注射量为2ml/只。

3、本发明选用的牦牛胎盘免疫调节因子作为一种新型免疫促进剂，能激发t、b淋巴细胞增值和细胞因子的生成，从而增强机体免疫力，减少免疫抑制、免疫失败、免疫应激反应的发生比例，且具有使用安全、无毒副作用、无抗原性，除作为免疫佐剂外，还可用于动物疾病的辅助治疗，疗效显著。

附图说明

图1为染色后的电泳图谱；

图2为牦牛胎盘免疫调节因子紫外扫描图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明一种增强藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的免疫制剂，来源为青藏高原特有物种牦牛。

本发明一种增强藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的免疫制剂的提取方法的提取步骤为：

选取健康牦牛正常分娩后的新鲜胎盘，冷冻保存，然后常温解冻，洗净血液后用生理盐水冲洗胎盘，去除血管和筋膜，将其剪碎，沥干称重，加2倍的无菌三蒸水，12000r/min匀浆10次，3min/次；制备好的匀浆液-20℃冰冻，反复冻融3次，最后一次融化后以8000r/min冷冻离心沉淀20min，上清液微滤后，用milloporym-10型滤器7000r/min，20min超滤，收集液体既为牦牛胎盘免疫调节因子，无菌分装后冰冻保存，分子量约为4242da。

本发明牦牛胎盘免疫调节因子：无菌，无毒性，无热原，无致敏性，无抗原性。

本发明的工作原理：

本发明所含活性成分均来自牦牛胎盘小分子活性物质-牦牛胎盘免疫调节因子，其作用的靶细胞均为藏羊免疫细胞，能够增强t淋巴细胞e受体的表达，还能够增强t、b淋巴细胞增殖，提高动物机体细胞免疫和体液免疫水平，协同疫苗，显著提高免疫接种羊的体液免疫应答能力。本品使用后见效快，机体免疫应答期大大缩短，2-3周后抗体的产生就可达到高峰期，且维持时间很长。

本产品为生物活性成分，经注射途径进入机体效果最佳，因此直接肌肉注射是保证本产品发挥最佳效果的前提。本产品经肌肉注射在增强藏羊口蹄疫疫苗免疫抗体时，效果明显。

本发明牦牛胎盘免疫调节因子(牦牛pif)的理化性质及部分生物学特性的测定和对藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的影响

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物

实验用40只昆明系小鼠，雌、雄性各半，体重18-20g，购自兰州大学实验动物中心。在实验室常规饲养3d，观察无异常备用。

1.1.2主要仪器设备

lrh系列生化培养箱(上海一恒科技有限公司)、xw-80a微型漩涡混合仪(上海沪西仪器分析厂)；；1810-b型石英自动双重纯水蒸馏器(江苏金坛市亿通电子有限公司)；bsa系列电子天平；hh-60型数显恒温搅拌循环水箱(常州市华普达教学仪器有限公司)；uv-1600型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；ss-jxh-dy-2型稳压稳流电泳仪(北京奥德盛世科技有限公司)等。

1.1.3主要试剂

阳极缓冲液、阴极缓冲液、胶缓冲液、丙烯酰胺贮存液等。

1.1.4菌株

金黄色葡萄球菌(p25)、大肠埃希菌(w18)、沙门菌(81050)，由青海大学农牧学院动物医学系预防实验室提供。

1.1.5培养基

营养肉汤、营养琼脂、mh(a)培养基、厌气肉肝汤、血液琼脂平板，均按常规方法制作。

1.1.6滤纸片的制备

用打孔器将滤纸制成6mm的圆形纸片，装于洁净的培养皿内，高压灭菌后在温箱中烘干。将无菌圆形滤纸片浸泡于制备的牦牛胎盘免疫调节因子中2h，制成提取液滤纸片备用。

1.2方法

1.2.1澄明度

肉眼直接观察pif提取物的澄明度，辨识其气味。

1.2.2ph测定酸度计

测量时，先用蒸馏水冲洗两电极，用滤纸轻轻吸干电极上残余的溶液，然后，将电极浸入盛有待测溶液的烧杯中，轻轻摇动烧杯，使溶液均匀，等到数值不变(数字式ph计在约10s内数值变化少于0.01)时，表明已达到稳定读数，记录ph。测量完毕，关闭电源，冲洗电极，玻璃电极要浸泡在蒸馏水中。

1.2.3tricine-甘油sds-page电泳法测定分子量

通过灌胶、上样与电泳、染色、脱色对比和计算测定pif大概分子量。

1.2.4紫外扫描测定最大吸收峰

在紫外分光光度计上设定扫描波长范围为185nm～400nm,无菌生理盐水作为对照液，调零后扫描并读图。

1.2.5蛋白质反应

取少量pif用25％磺基水杨酸检测，观察有无白色浑浊物出现。

1.2.6pif生物学活性检测

按《中国生物制品规程》进行无菌、热源、安全性及过敏反应检测。

无菌检验：将提取液接种于普通肉汤、血液琼脂斜面、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤,37℃培养7d，观察有无细菌等微生物生长。

热原检验：兔子10只，随机分为2组，测其正常体温，15min后兔耳静脉按2ml/kg注入温热至约38℃的pif样品，每隔1h测1次体温，共测3次，观察并判断结果。

1.2.7安全性试验

取小鼠40只，雌、雄各半，随机分为4组。第1组每只腹腔注射pif液0.5ml；第2组每只腹腔注射pif液1.0ml；第3组每只腹腔注射pif液2.0ml；第4组每只腹腔注射无菌生理盐水2.0ml作对照。观察7d，全部剖杀，检查各组织脏器情况。

1.2.8过敏试验

取豚鼠6只，隔日腹腔注射牦牛胎盘免疫调节因子0.5ml/只，连续3次；然后再分成2小组，每组2只，分别于第1次注射后14d及21d静脉注射牦牛胎盘免疫调节因子0.5ml/只，注射后15min内观察并判断结果，另2只做对照组。

2结果

2.1澄明度

pif为无色透明液体。

2.2ph测定

ph测定结果为6.75。

2.3tricine-甘油sds-page电泳结果

tricine-甘油sds-page电泳结果表明结果如图1所示；电泳后对标准蛋白条供试品相对分子质量的对数(lgmw)和在分离胶中的相对迁移率(rf)进行了回归分析，r＝－0.9955，计算得mw为4242da。

2.4紫外扫描最大吸收峰

所制备的牦牛胎盘肽紫外吸收集中在185nm～300nm之间，其最大吸收峰为201.8nm，结果见图2所示。

2.5蛋白质反应

蛋白质反应未出现混浊或沉淀，说明牦牛pif中不含大分子蛋白质。

2.4无菌检验

将pif滤纸片接种于普通肉汤、血液琼脂斜面、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤，经过37℃培养7天后，观察发现均无菌生长。

2.5热原检验

给家兔注射牦牛pif提取液，兔子体温无异常变化，热源检查结果为阴性。

2.6安全性试验

给小鼠注射pif提取液，实验小鼠与对照组小鼠相比，精神、食欲、毛色及活动状况无异常，无死亡。处死小鼠后剖检，内部脏器无异常变化，表明安全性试验结果为阴性。

2.7过敏试验

6只豚鼠在第14天及21天静脉注射注射牦牛pif提取液后15min内未见连续干咳、呼吸困难、虚脱等明显的症状及死亡发生，说明过敏试验结果为阴性。

3讨论

本实验表明，从牦牛胎盘中超滤法提取出的牦牛胎盘免疫调节因子是一种无色透明的液体，具有水溶性。本次试验测得牦牛胎盘肽ph为6.75，与周国华所测牛羊猪胎盘ph为6.7～7.0，与文献记载人胎盘肽ph为6～8基本一致。电泳和最大吸收峰实验结果表明，牦牛pif分子量约为4242da，与人胎盘肽的分子量范围(500～5000da)相符合，与浩洪龙、周国华、葛瑞宏等人测得牛、羊胎盘免疫调节因子相近。安全性实验结果说明牦牛pif提取液无菌，无毒性，无热原，无致敏性，无抗原性，符合兽医生物制品临床用药标准。

(二)牦牛胎盘免疫调节因子(pif)对藏羊口蹄疫疫苗免疫效果的影响

1材料和方法

1.1材料

1.1.1试验动物

由青海省民和县某养殖场提供试验动物,随机选取同品种藏羊46只，分为对照组，试验ⅰ组(先连续注射3d牦牛pif后注射疫苗)、试验ⅱ组(先注射疫苗后连续注射3d牦牛pif)、试验ⅲ组(疫苗和牦牛pif同时注射)。全部羊采取统一的日粮配方和饲养管理。

1.1.2口蹄疫疫苗

口蹄疫疫苗，青海生物药品厂生产，规格:100头份/瓶。

口蹄疫疫苗稀释液，青海生物药品厂生产，规格:100头份/瓶。

1.1.3牦牛胎盘免疫调节因子

实验室保存的牦牛胎盘免疫调节因子pif冻干粉,称取1g冻干粉溶于1l灭菌生理盐水中，浓度为1mg/ml，制成牦牛pif注射液。

1.1.4口蹄疫抗体检测试剂

用口蹄疫o型液相阻断elisa抗体检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，生产批号：20160406101，抗原批号：16033001，使用浓度：1:20。

1.2方法

1.2.1试验设计

口蹄疫疫苗常规1只份/只，牦牛pif注射液具体用量、用法如下：

对照组:注射口蹄疫疫苗，每组10只羊。

试验ⅰ组:按1ml、2ml、4ml的剂量连续肌肉注射牦牛pif3d，再注射口蹄疫疫苗，每剂量组4只羊。

试验ⅱ组:先注射口蹄疫疫苗，然后按1ml、2ml、4ml连续肌肉注射牦牛pif3d，每剂量组4只羊。

试验ⅲ组:牦牛pif与口蹄疫疫苗同时肌肉注射，连续3d，pif注射剂量分别为1ml、2ml、4ml，每剂量组4只羊。

1.2.2血样处理

各试验组和对照组分别于首免前1d，首免后第7d、14d、21d、28d、35d，颈静脉采血。

a.用促凝管采取羊的颈动脉血，静置。

b.高速离心：3000r/min离心5分钟.

c.取血清封存在dorf管中，冷冻保存。

1.2.3elisa检测测定方法和结果判定按照试剂盒说明书进行操作

2结果

2.1各组口蹄疫抗体水平结果

如表1-表4所示。

表1对照组抗体水平

通过表1可以看出，对照组藏羊注射口蹄疫疫苗后在28d左右时抗体水平达到最高。

表2试验ⅰ组抗体水平

从试验ⅰ组可以看出，先连续注射3d牦牛pif后注射口蹄疫疫苗可以缩短抗体产生的时间，到35d时，抗体水平稳定并且超过了抗体的最高水平。

表3试验ⅱ组抗体水平

从试验ⅱ组可以看出，先注射口蹄疫疫苗后连续注射3d牦牛pif的方法反而抑制口蹄疫疫苗产生抗体。

表4试验ⅲ组抗体水平

从试验ⅲ组可以看出，同时注射口蹄疫疫苗和牦牛pif的方法，大部分藏羊在14天左右抗体水平增加,但随后减少。

3.讨论

胎盘免疫调节因子能增加小鼠外周血白细胞及脾脏有核细胞计数，提高血清溶血素抗体和脾脏细胞抗体生成水平，本次实验结果表明，2ml剂量组先连续注射3d牦牛pif后注射口蹄疫疫苗可以缩短抗体产生的时间，到21d时，抗体水平基本稳定，显著高于对照组和其他试验组。说明现先注射牦牛pif的方式且2ml剂量对口蹄疫疫苗免疫增强的效果最好。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等同替换，均为本发明的权利要求所涵盖。