水溶性富勒烯结构在制备治疗帕金森病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，特别涉及一种水溶性富勒烯结构在制备治疗帕金森病的药物中的应用。

背景技术：

帕金森病(parkinson’sdisease,pd)是一种常见的中枢神经系统变性疾病，多发于老年人当中，据调查，帕金森病在65岁以上的发病率达1-2％。pd主要是由中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡导致的纹状体多巴胺含量显著减少而致病。其临床表现主要有静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍等。随着人口老龄化的发展，帕金森病的研究也渐渐得到人们的关注，但pd的发病原因目前尚不清楚，年龄老化、遗传因素、环境因素和氧化应激等都有可能与pd有关。现阶段对于pd还没有很好的治疗方法。

富勒烯是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。这类物质指的是由碳原子组成的笼状结构，其含量最多的分子是c60，然后是c70、c84，其次是含量相对较少的c76、c78、c82等。另外由于富勒烯的碳笼内部为空腔结构，因此其内部空腔可内嵌不同原子、离子或原子簇，称之为内嵌富勒烯，如la@c60，表示la内嵌在c60的笼状结构中，@表示at，形象的表达了内嵌的含义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水溶性富勒烯结构在制备治疗帕金森病的药物中的应用。本发明的另一目的在于提供一种使用上述水溶性富勒烯结构治疗帕金森病的药物组合物及方法。本发明的目的之三在于提供一种水溶性富勒烯结构在制备治疗帕金森病的保健品中的应用。本发明中涉及的水溶性富勒烯结构治疗帕金森病效果显著。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水溶性富勒烯结构在制备治疗帕金森病的药物中的应用，所述水溶性富勒烯结构包括选自下组的至少一种：水溶性改性空心富勒烯、水溶性改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性改性空心富勒烯和所述水溶性改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐；其中：所述水溶性改性空心富勒烯为水溶性改性c70，所述水溶性改性内嵌金属富勒烯为水溶性改性gd@c82。

本发明还提供了一种治疗帕金森病的方法，包括向患有帕金森病的受试者施用有效量的水溶性富勒烯结构，所述水溶性富勒烯结构包括选自下组的至少一种：水溶性改性空心富勒烯、水溶性改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性改性空心富勒烯和所述水溶性改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐；其中：所述水溶性改性空心富勒烯为水溶性改性c70，所述水溶性改性内嵌金属富勒烯为水溶性改性gd@c82。

本发明还提供了一种治疗帕金森病的药物组合物，包括至少一种选自下组的水溶性富勒烯结构：水溶性改性空心富勒烯、水溶性改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性改性空心富勒烯和所述水溶性改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐；其中：所述水溶性改性空心富勒烯为水溶性改性c70，所述水溶性改性内嵌金属富勒烯为水溶性改性gd@c82。

本发明还提供了一种水溶性富勒烯结构在制备改善帕金森病的保健品中的应用，所述水溶性富勒烯结构包括选自下组的至少一种：水溶性改性空心富勒烯、水溶性改性内嵌金属富勒烯、所述水溶性改性空心富勒烯和所述水溶性改性内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐；其中：所述水溶性改性空心富勒烯为水溶性改性c70，所述水溶性改性内嵌金属富勒烯为水溶性改性gd@c82。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述治疗帕金森病包括：改善由帕金森病引起的自主活动能力下降、肢体障碍和/或运动障碍。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，改善由帕金森病引起的自主活动能力下降、肢体障碍和/或运动障碍包括：自主活动时间延长、自主活动距离增大、改善肢体震颤、改善肢体僵直、改善运动迟缓、改善运动不协调中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性富勒烯结构作为线粒体保护剂、线粒体相关凋亡蛋白bax的抑制剂、ask1-jnk信号通路抑制剂和akt-gsk-3β信号通路中akt激活剂中的至少一种来治疗帕金森病。即水溶性富勒烯结构可以用于线粒体保护剂、线粒体相关凋亡蛋白bax的抑制剂、ask1-jnk信号通路抑制剂和akt-gsk-3β信号通路中akt激活剂的制备。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性改性c70包括：在c70本体上修饰有亲水基团的水溶性改性c70；所述水溶性改性gd@c82包括：在gd@c82本体上修饰有亲水基团的水溶性改性gd@c82。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基和氨基酸残基中的一种或多种。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性改性c70的通式为c70(oh)b；0<b≤50，可选的0<b≤30，10≤b≤30，20≤b≤30，进一步可选的b＝13、20、22、24。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性改性gd@c82的通式为gd@c82(oh)c；0<c≤50，可选的0<c≤30，10≤c≤30，20≤c≤30，进一步可选的c＝13、20、22、24。

上述结构通式c70(oh)b、gd@c82(oh)c表示羟基连接于空心富勒烯本体或内嵌金属富勒烯本体上。通式中b，c都是通过检测计算得出的统计平均值。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性改性c70是通过对c70本体进行水溶性改性获得的，所述水溶性改性gd@c82是通过对gd@c82本体进行水溶性改性获得的。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性改性的方法为以下方法中的任一种：

(1)表面修饰羟基的方法为：将c70和/或gd@c82、双氧水和碱溶液混合并进行加热反应，将所得反应液洗涤，之后收集沉淀然后透析，得到与本体相应的水溶性羟基衍生物，其中：所述碱溶液包括氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液；所述的碱溶液中碱的含量为8-80wt％。

可选的，表面修饰羟基的方法为：(a)将质量百分含量为为1-30％的双氧水和质量百分含量为8-80％的碱溶液按照体积比为1-10:1混合得到混合液，在每10-200ml混合液中加入20-500mgc70和/或gd@c82，在50-80℃的条件下反应至固体全部溶解，过滤，保留滤液；(b)将所述滤液加入过量的浓度为85％-100％的乙醇进行洗涤，并收集沉淀，将所述沉淀溶于水，得到溶液；(c)将(b)步骤得到的溶液进行透析处理，透析至所述溶液在室温的电导率小于1μs/cm。进一步可选的透析处理后还包括冷冻干燥的步骤，以便获得相应的固体。

(2)表面修饰氨基的方法为：将修饰羟基的方法中所使用的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液替换成氨水。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物为药学可接受的剂型。该药物或药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的形式。本发明中将水溶性富勒烯结构制备成药物或药物组合物，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分。在制备过程中，水溶性富勒烯结构可以与载体混合，或者用载体稀释，或者包封在载体中，并且可以是胶囊、小药囊、纸或其它容器的形式。当载体作为稀释剂时，其可以是充当活性成分的载体、赋性剂或介质的固体、半固体或液体材料。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(watersyrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。制剂可另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，当所述药物或所述药物组合物以液体形式存在时，水溶性富勒烯结构在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-1000mg/ml，可选的为0.01-10mg/ml，0.01-20mg/ml，0.01-30mg/ml，0.01-40mg/ml，0.01-50mg/ml，0.1-100mg/ml，5-10mg/ml，5-20mg/ml；当所述药物或所述药物组合物以固体形式存在时，水溶性富勒烯结构在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.1-1000mg/g，可选的为0.1-100mg/g，0.01-50mg/g，0.01-10mg/g，0.01-20mg/g，0.01-30mg/g，0.01-40mg/g，20-30mg/g，30-40mg/g。

上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、猴子和人等。

上述方法在另一种实施方式中，所述水溶性富勒烯结构的施用剂量为0.1mg/kg/d-100mg/kg/d，可选的1-5mg/kg/d，1-10mg/kg/d，1-20mg/kg/d，5-50mg/kg/d，10-50mg/kg/d，具体的受试者的总给药量按照其体重进行换算。施用疗程可以为5天-30天，根据病情可短期服用或长期服用；有效成分的施用方式可以为口服、静脉注射或腹腔给药。

本发明所用的术语“治疗”包括其通常被接受的含义，该含义包括阻止、预防、抑制以及减缓、停止或逆转所产生症状或预期病变的发展。照此，本发明涵盖治疗性和预防性的施用。

本发明所用的术语“有效量”指水溶性富勒烯结构经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本发明所用的术语“空心富勒烯本体”是指没有经过水溶性改性的空心富勒烯，即空心富勒烯原料。

本发明所用的术语“内嵌金属富勒烯本体”是指没有经过水溶性改性的内嵌金属富勒烯，即内嵌金属富勒烯原料。

本发明中所有范围的公开应当视为对范围内所有子范围和所有点值的公开。例如：1-1000的公开应当视为也公开了1-200,200-300等范围，同时也公开了200、300、400、500、600、700、800、900和100等点值。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)生物相容性好，安全无毒副作用

研究已经证明，水溶性富勒烯结构进入体内后可以快速代谢，不会对脏器产生损害。

(2)治疗效果显著

本发明水溶性富勒烯结构治疗帕金森病效果显著，可以产期服用产生持续作用。本申请涉及的有效成分能在相对较短的时间内改善帕金森病导致的震颤、行动迟缓、自主活动能力差等行为学障碍；能够增加中脑以及纹状体中的多巴胺的含量；能够改善中脑多巴胺神经元的线粒体功能等；能够改善酪氨酸羟化酶的功能。

附图说明

图1为本发明c70-oh的热重分析及微商热重分析曲线。

图2为本发明c70-oh在纯水中的水合粒径分布曲线。

图3为实施例1所得c70-oh材料的电子自旋核磁共振(esr)图，其中，点状线表示空白对照，非点状线表示加入c70-oh。

图4为小鼠旷场法测试中小鼠的直立时间对比。

图5为小鼠旷场法测试中小鼠的水平运动距离对比。

图6为c70-oh对小鼠中脑多巴胺含量的影响。

图7为c70-oh对小鼠中脑hva/da的影响。

图8为各组酪氨酸羟化酶(th)的免疫组化。

图9为爬竿法测试中的潜伏期变化。

图10为爬竿法测试中小鼠的爬下时间变化。

图11为组织透射电镜观察的线粒体结构图。

图12为小鼠中脑bax的表达量。

图13为小鼠中脑bax/bcl-2的比值变化。

图14为小鼠体内sod的含量。

图15为小鼠体内no和lpo的含量。

图16为小鼠中脑ask1的基因表达含量。

图17为小鼠中脑jnk的基因表达含量。

图18为小鼠中脑akt的基因表达含量。

图19为小鼠中脑gsk-3β的基因表达含量。

图20为小鼠中脑gsk-3β的蛋白表达含量。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。并且除非另有其它明确表示，任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。在一些实施例中，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的实验方法等，如无特殊说明，均为常规实验方法。

以下实施例所用原料c70固体粉末购买于厦门福纳新材料科技有限公司，分子量840，纯度99％。

实施例1、水溶性改性空心富勒烯c70-oh的制备

(a)将7ml质量百分含量为30％的过氧化氢水溶液和3ml质量百分含量为40％的氢氧化钠溶液加入100ml圆底烧瓶，加入200mg富勒烯c70固体，再加入磁力搅拌子，使用磁力搅拌器在温度50℃、转速1000r/min的条件下搅拌24h，使用溶剂过滤器(容积：1l，滤膜孔径：200nm，津腾公司)过滤得到棕黄色溶液。

(b)将(a)步骤得到的溶液加入50ml的离心管中，再加入过量的浓度为95％的乙醇。在转速10000r/min的条件离心下4min后去除上层无色溶液，将收集的沉淀溶于超纯水中，得到黄色澄清溶液。

(c)将(b)步骤得到的溶液装入截止分子量为3500的透析袋放入超纯水中透析，室温透析至超纯水和/或溶液的电导率小于1μs/cm，得到黄色溶液。

(d)将(c)步骤透析后的溶液装入50ml塑料离心管中，使用液氮冷冻后放入冷冻干燥机中在温度-29℃、真空度55pa的条件下冷冻干燥48h，将得到的黄色固体装入棕色样品瓶中备用。

测定实施例1中所得水溶性改性空心富勒烯结构修饰的羟基数目，根据元素分析(flashea1112)的结果：c含量为37.85％，h含量为1.51％，n含量<0.3％，结合热重分析、微商热重分析曲线(如图1所示)计算c70(oh)x中修饰的羟基数目。从热重分析可知，所得固体粉末中含3.7％的水，约为5个水分子，结合元素分析中h含量与c含量的比值，可推算碳笼表面修饰了24个羟基，所以该产物的平均分子式为c70(oh)24，本申请中简称为c70-oh。

取少量c70-oh粉末溶于水配成稀溶液，由于分子间相互作用，在水中团聚成纳米颗粒，形成水合粒径在1～200nm的颗粒。采用动态光散射(dls，zetasizernanozsp)测定了在ph＝7.0的纯水中纳米颗粒的水合粒径，c70-oh的平均粒径为135.9nm，参见图2。

实施例2、富勒烯c70-oh清除自由基能力检测

本发明通过电子自旋共振波谱(esr)来检测水溶性改性空心富勒烯c70-oh清除自由基的能力。

检测方法：采用紫外诱导产生羟基自由基的方法，将50μl质量浓度为39％的双氧水、50μlpbs缓冲溶液(ph＝7.4)和微量(0.133mm)的二甲基吡啶n-氧化物(dmpo，自由基捕获剂)溶液混合，对照组直接照射紫外，而实验组立即加入20μl的c70-oh，用280nm的紫外光照射4min，检测自由基信号。如图3所示，点状线为没有加入实施例1所得c70-oh的空白对照，非点状线为加入c70-oh的样品，与空白对照相比，加入c70-oh样品的信号明显降低，说明c70-oh有强的清除自由基能力。

实施例3、动物实验

(1)帕金森病模型的建立及治疗

本发明采用成熟的mptp(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinehydrochloride)致小鼠帕金森病模型。研究发现c57bl/6小鼠对mptp敏感性最强，因此本发明采用c57bl/6小鼠来进行实验。

本发明取30只c57bl/6小鼠，10周龄，体重18-22g，随机地分为对照组a组、模型组b组和治疗组c组，每组10只。

b、c两组的20只小鼠皮下注射mptp造模，mptp的注射量为25mg/kg，每天注射一次，连续5天，b、c两组的小鼠表现出静止性震颤，运动减少，竖尾，竖毛等，证明模型构建成功。在第6天开始给予治疗，持续至第14天。b组小鼠腹腔注射与c组施药量等体积的生理盐水，c组小鼠腹腔注射以实施例1获得的c70-oh配制的c70-oh水溶液，施药量为5mg/kg/d(以c70-oh的量进行计算)。

a组对照组造模时皮下注射生理盐水之后给予与c组施药量等体积的生理盐水治疗。

(2)小鼠行为学实验

本发明通过常用的旷场法来检测小鼠的治疗效果。

旷场法使用的敞箱实验装置为tsemulticonditioningsystems，内箱长宽高分别为45cm×45cm×33cm，摄像头记录动物活动。本实验中，分别于实验第14天进行自主活动行为学检测，实验在安静的房间内进行，将小鼠置于敞箱中心，测试时间为5分钟，观察小鼠5分钟内活动时间、活动距离、垂直活动时间(小鼠直立时间，也叫小鼠竖直时间)。彻底清洁敞箱后进行下一只小鼠的观察。如图4和5所示，小鼠的竖直时间和水平运动距离在mptp诱导后都有明显的下降，但是c70-oh治疗后有明显的改善，说明c70-oh能够改善帕金森小鼠的自主活动能力。

(3)中脑多巴胺及代谢物检测

上述实验14天后，将各组小鼠解剖，取小鼠中脑进行测试。用预冷的pbs缓冲液冲洗组织，去除残留血液，称重20mg后将组织剪碎成小组织颗粒。将剪碎的组织与1.8ml的pbs缓冲混合，再加入18ul蛋白酶抑制剂，混合液加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨至无肉眼可见的明显组织大颗粒，最后将匀浆液于5000g离心10min，取上清进行多巴胺(da)和高香草酸(hva)含量检测。

图6所示，治疗组c组小鼠的多巴胺含量在c70-oh治疗后有明显的提高，如图7所示，hva/da的值在治疗后明显降低，接近对照组，图6和图7说明多巴胺的代谢减少，能够发挥作用的多巴胺显著增加。

(4)小鼠大脑酪氨酸(th)羟化酶免疫组化测试。

上述小鼠解剖后，取小鼠的大脑固定，切片，进行酪氨酸羟化酶(th)的免疫组化测试，酪氨酸羟化酶是负责催化l-酪氨酸转变为多巴的酶，多巴是多巴胺的一个前体。如图8所示，mptp诱导后的小鼠的th含量明显降低，棕色深染少，经c70-oh治疗之后的小鼠大脑的th含量明显增加。说明c70-oh能够增加th的含量。

本发明通过材料测试以及动物水平的实验证明了水溶性富勒烯结构具有强的清除自由基的能力，能够改善体内多巴胺及酪氨酸羟化酶的含量，改善帕金森病引起的动物肢体的震颤，不协调等，改善帕金森病引起的动物自主活动能力下降，使活动时间和活动距离增加，能有效地治疗帕金森病。

实施例4、小鼠行为学实验

(1)帕金森病模型的建立及治疗

本发明采用成熟的mptp致小鼠帕金森病模型。c57bl/6小鼠40只，10周龄，体重18-22g，平均分为四组，其中：a为对照组，b为模型组，c为c60油剂治疗组，d为c70-oh水剂治疗组。a组对照组造模时皮下注射生理盐水，b、c、d三组的小鼠皮下注射mptp造模，mptp的注射量为25mg/kg，每天注射一次，连续5天。造模的同时就开始给予药物治疗，即造模注射mptp的同时也给予药物治疗，共给予药物治疗12天。

对照组a组小鼠和模型组b组小鼠腹腔注射与水剂治疗组d组施药量等体积的生理盐水；c组小鼠腹腔注射c60油剂，施药量为5mg/kg/d(以c60油剂中的c60本体计算)；d组小鼠腹腔注射以实施例1获得的c70-oh配制的c70-oh水溶液，施药量为5mg/kg/d(以c70-oh计算)。

c组小鼠使用c60油剂是通过以下方法制备得到的：量取20ml橄榄油，称取20mgc60(粒径均为0.7～1nm)，混合搅拌均匀，得到混合液；然后将混合液置于球磨机中球磨10h，球磨结束后将混合液取出，阴凉干燥避光保存，静置1h后离心去除沉淀，然后使用220nm滤膜将所得上层液过滤，即得c60油剂，该油剂中c60的含量为0.8mg/ml。

(2)爬杆法实验

实验第12天时进行爬杆法(poletest)来检测帕金森病中典型行为学症状—运动徐缓。将小鼠头向上轻柔的放在粗糙的杆顶(直径8mm，高55cm)。小鼠从杆顶调整至头完全向下的时间记录为潜伏期(t-turn)，小鼠从向下运动至四肢全部到达杆底的时间记录为爬下时间(t-la)，超过30s按照30s记录。每只小鼠重复检测5次取平均值。

如图9和10所示，小鼠的潜伏期和爬下时间在mptp诱导的小鼠中都有明显的延长，即模型组b组小鼠的潜伏期和爬下时间都有明显延长，但是富勒烯结构治疗后c组和d组小鼠均有明显的改善，其中施用c70-oh水溶液的d组小鼠在潜伏期和爬下时间中都表现更好，说明富勒烯结构，尤其是水溶性富勒烯结构能够改善帕金森小鼠的自主活动能力，尤其是改善帕金森小鼠的运动徐缓情况。

实施例5、水溶性富勒烯结构抗线粒体凋亡

帕金森病中多巴胺能神经元死亡的确切机制现在仍不清楚。线粒体是细胞的“动力工厂”、“能量转换站”，并且其还调控基因表达和细胞凋亡等过程。发明人认为线粒体的功能障碍是多巴胺能神经元损伤的重要原因之一。由于遗传或者环境因素，脑中多巴胺能神经元中的线粒体功能异常，复合物ⅰ抑制，同时活性氧水平异常升高，诱发多种细胞反应，从而使多巴胺能神经元合成释放多巴胺的功能减弱，造成帕金森病。

(1)线粒体结构观察

按照实施例4第(1)部分中的方法建立帕金森病模型和进行治疗。

12天实验结束后，先用生理盐水从心脏灌注，然后用2.5％的戊二醛进行灌注。取中脑黑质固定于戊二醛中，进行组织透射电镜的观察。观察线粒体的结构。如图11中，线粒体的嵴结构可以清晰地看到，模型组mptp损伤的小鼠的线粒体结构损伤严重，嵴结构遭到破坏，经富勒烯结构治疗后c组和d组小鼠的线粒体结构更加完整。说明富勒烯结构能够改善mptp导致的线粒体损伤。

(2)线粒体凋亡基因检测

12天实验结束后，取中脑组织，进行q-pcr测试。取50-100mg组织，首先加triol进行研磨，离心，加氯仿/triol振荡，离心，取水相加入异丙醇/trizol振摇，离心，洗涤得到提取的mrna。对mrna进行反转录成cdna，最后进行bax和bcl2的pcr测试。bax和bcl-2是两种线粒体相关凋亡蛋白。ros的增加会刺激bax转位到线粒体膜上，形成同源二聚体或多聚体，并在线粒体膜上形成通透性转运孔道，破坏膜内离子及蛋白的浓度差，释放出细胞色素c；细胞色素c释放到胞质中，诱发凋亡。同时bcl-2可以与bax形成二聚体，阻止bax的自身二聚体化，阻止cytc的释放，从而阻止凋亡级联反应。

如图12和13所示，bax的含量在mptp诱导的帕金森小鼠中的含量明显增加(即模型组)，且bax/bcl-2的比值增加，说明诱导凋亡增加。经过富勒烯治疗后bax减少，bax/bcl-2的比值减少，说明富勒烯结构能够抑制mptp导致的bax增加，从而抑制bax增加引起的凋亡，从而增加多巴胺能神经元的活性。

本发明以mptp诱导的帕金森小鼠为模型，以c60油剂和c70-oh水溶液为例，研究了富勒烯结构在改善线粒体结构和功能、抑制mptp导致的bax增加并抑制bax增加引起的凋亡、从而增加多巴胺能神经元的活性、治疗帕金森病中的作用。

实施例6、水溶性富勒烯结构调节应激

c-jun氨基末端激酶(jnk)的过表达与黑质多巴胺能神经元的凋亡有关，是多巴胺能神经元凋亡的重要原因之一。凋亡信号调节激酶(ask1)是细胞丝裂原活化蛋白激酶家族的成员之一，在信号转导通路中位于jnk的上游，是调节jnk的重要因素之一。活化的ask1可以激活jnk，诱导细胞凋亡。在帕金森疾病中，多种应激会导致多巴胺能神经元中的ask1-jnk信号通路激活，诱导细胞凋亡。

(1)动物实验

按照实施例4第(1)部分中的方法建立帕金森病模型和进行治疗。

(2)氧化还原水平测试

实验12天后的帕金森小鼠通过眼球取血，室温静置1h后，3500rpm，15min，吸取上层血清，利用分光光度法，测定450nm处的吸光度计算得到小鼠体内氮氧自由基(no)和脂质过氧化物(lpo)含量，通过显色法进行超氧化物歧化酶(sod)的测试。

如图14为sod的含量变化，模型组小鼠体内的sod含量减少，氧化还原水平失衡，经过富勒烯结构调节后，体内sod含量增加。图15为no和lpo(脂质过氧化物)的含量变化，帕金森小鼠由于体内氧化应激，脂质氧化增加，氮氧自由基也增加，经富勒烯治疗后，氧化应激的状态改善。

(3)富勒烯结构抑制ask1-jnk信号

动物实验12天后解剖小鼠取材中脑组织，首先加triol进行研磨，离心，加氯仿/triol振荡，离心，取水相加入异丙醇/trizol振摇，离心，洗涤得到提取的mrna。对mrna进行反转录成cdna，最后进行pcr扩增，检测ask1/jnk的基因表达水平。

如图16为小鼠中脑ask1的基因表达水平。由图可以得到，mptp诱导的模型组小鼠的ask1的mrna含量明显增加，经过富勒烯结构治疗后，ask1的mrna含量明显减少，说明富勒烯结构能够抑制ask1的表达，从而抑制其激活jnk和抑制jnk诱导细胞凋亡的功能。

如图17为小鼠jnk的基因表达水平，同样模型组小鼠的中脑jnk水平增加，说明帕金森小鼠存在jnk诱导的凋亡通路，经过富勒烯治疗后，jnk表达降低，说明富勒烯能够通过抑制ask1的表达，抑制jnk的表达，从而抑制其诱发的细胞凋亡。

本发明以mptp诱导的帕金森小鼠为模型，以c60油剂和c70-oh水溶液为例，研究了富勒烯结构在抑制ask1-jnk信号并减少其引起的多巴胺能神经元凋亡，从而治疗帕金森疾病的作用。

实施例7、水溶性富勒烯结构激活akt-gsk-3β

akt-gsk-3β信号通路在神经元的发育、生存和功能方面非常重要，与神经退行性疾病息息相关。akt信号因子可以通过多种途径抑制神经元的凋亡，如：可以磷酸化抑制前凋亡蛋白bad的活性，上调抗凋亡蛋白bcl-2的表达；通过磷酸化凋亡相关因子caspase-3等，使其失活，抑制后续的凋亡级联反应；可以抑制jnk-p38路径；可以磷酸化gsk-3β，使其失活，阻止其诱导的凋亡等。

(1)动物实验

按照实施例4第(1)部分中的方法建立帕金森病模型和进行治疗。

(2)调节akt-gsk-3β的表达

12天后解剖小鼠取材中脑组织，首先加triol进行研磨，离心，加氯仿/triol振荡，离心，取水相加入异丙醇/trizol振摇，离心，洗涤得到提取的mrna。对mrna进行反转录成cdna，最后进行pcr扩增，检测akt/gsk-3β的基因表达水平。另取50-100mg的组织加1ml裂解液，匀浆，离心，去上层清液，定量，电泳，取胶，转膜，封闭，结合一抗和二抗，洗涤，显影成像。得到akt/gsk-3β的wb条带。

如图18为小鼠中脑akt的基因表达水平。由图可以得到，mptp诱导的帕金森小鼠的aktmrna含量明显减少，说明帕金森小鼠的akt表达异常，经过富勒烯结构治疗后，akt的表达明显增加，说明富勒烯能够刺激akt的表达，从而激活下游的功能。

如图19和20为小鼠gsk-3β的基因和蛋白表达，说明富勒烯结构能够通过磷酸化抑制gsk-3β的表达，从而抑制其诱发的细胞凋亡。

本发明以mptp诱导的帕金森小鼠为模型，以c60油剂和c70-oh水剂为例，研究了富勒烯结构在激活akt的表达，从而磷酸化抑制gsk-3β的表达，并减少其引起的多巴胺能神经元凋亡，从而治疗帕金森疾病的作用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。