PD1分子抑制剂在T淋巴细胞白血病治疗中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及pd1分子抑制剂在t淋巴细胞白血病治疗中的应用。

背景技术：

急性t淋巴细胞白血病(t-cellacutelymphoblasticleukemia，t-all)是一种高度侵袭性的血液肿瘤，是由t细胞祖细胞无序增殖而形成的。约占15％的儿童病例和25％的成人病例。t-all目前的化疗治疗方案并不理想，在儿童病例中的缓解率能达到85％，而在成人病例中的缓解率不超过50％。

免疫检验点immunecheckpoint主要指t细胞上的共抑制性分子和共刺激性分子，在生理上起到维持自我耐受的作用，在肿瘤微环境中能帮助肿瘤逃逸。其中，程序性细胞死亡受体-1(pd-1)是一种重要的免疫检验点。pd-1信号通路会抑制细胞周期，促进细胞凋亡，以及损伤t细胞抗肿瘤功能。当遭受慢性感染等抗原持续低剂量刺激，t细胞会处于一种功能性耗竭的状态，并且高表达多种抑制性受体，如pd-1。

在临床上，多种pd-1/pdl1抑制性抗体被fda批准上市，已经用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌等固体瘤，以及b细胞淋巴瘤、急性髓系白血病等血液肿瘤，有持续性的治疗效果和一定的安全性。但是现在有报导显示，在pd-1/pdl1治疗期间，在某些病人身上会出现耐药甚至疾病加重，比如肺腺癌、头颈鳞状细胞癌、成人t细胞白血病-淋巴瘤。

因此，本领域迫切需要开发一种更有效果的、毒性更少的治疗方法。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种pd1分子抑制剂在t淋巴细胞白血病治疗中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种pd-1的抑制剂的用途，用于制备(i)抑制t-all细胞分化与增殖、和/或(ii)治疗急性t淋巴细胞白血病的药物组合物。

在另一优选例中，所述t-all细胞为表达pd-1的阳性t-all细胞。

在另一优选例中，所述pd-1来源于哺乳动物；优选地，来源于人、小鼠、大鼠、或兔；更优选地，来源于人。

在另一优选例中，所述pd-1包括pd-1的蛋白、编码核酸、活性片段或其衍生物。

在另一优选例中，所述活性片段和/或衍生物与pd-1的同源性至少为90％，优选为95％，更优选为98％、99％。

在另一优选例中，所述活性片段和/或衍生物至少具有80％、85％、90％、95％、100％的pd-1活性。

在另一优选例中，所述pd-1蛋白如seqidno.:2所示。

mqipqapwpvvwavlqlgwrpgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvvgvvggllgslvllvwvlavicsraargtigarrtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswpl

在另一优选例中，所述pd-1蛋白的编码核酸如seqidno.:1所示。

在另一优选例中，所述pd-1的抑制剂包括pd-1抗体、或pd-1的活性抑制剂。

在另一优选例中，所述pd-1的抑制剂抑制pd-1的活性和/或表达量。

在另一优选例中，所述pd-1的抑制剂选自下组：pd1抗体。

在本发明的第二方面，提供了一种体外非治疗性的抑制t-all细胞增殖的方法，其特征在于，包括步骤：

在pd-1抑制剂的存在下，培养t-all细胞，从而抑制t-all细胞增殖。

在本发明的第三方面，提供了一种体外促进细胞内igfbp3和sult1a3表达的方法，其特征在于，包括步骤：

在pd-1抑制剂的存在下，培养t-all细胞，从而促进细胞内igfbp3和sult1a3表达。

在另一优选例中，所述方法还包括检测细胞内igfbp3和sult1a3的表达量。

在本发明的第四方面，提供了一种筛选pd-1调节剂的候选组合物的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中添加候选组合物，并观察所述测试组t-all细胞的表达量和/或活性；在对照组中，在相同培养体系中不添加所述的候选组合物，并观察所述对照组中t-all细胞的表达量和/或活性；

其中，如果测试组培养体系中t-all细胞的表达量和/或活性p1显著高于对照组p0，则说明所述候选组合物为pd-1的抑制剂；

如果测试组培养体系中t-all细胞的表达量和/或活性p1显著低于对照组p0，则说明所述候选组合物为pd-1激动剂。

在本发明的第五方面，提供了一种抑制t-all细胞分化及增殖和/或治疗急性t淋巴细胞白血病的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的pd-1抑制剂或含有pd-1抑制剂的药物组合物。

在另一优选例中，所述需要的对象包括患有肿瘤的哺乳动物，优选地为人、小鼠或大鼠。

在另一优选例中，所述的施用包括将pd-1抑制剂直接输入到有需要的对象体内，例如静脉、肌肉或胃肠途径。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了原代t-all异种移植模型的构建和特征。(a)t-all异种移植模型的构建。将病人来源的t-all细胞尾静脉注射到b-ndg小鼠体内(n＝6小鼠)，5×10⁶个细胞/鼠，在24-30天收获小鼠的脾脏细胞。(b)用流式细胞术检测人t-all纯度。在获取小鼠脾脏细胞后，用抗人的cd5、cd7、cd45、cd33、cd19、cd56抗体进行表面染色，用cd3抗体和igg2a,κ同型对照抗体进行胞内染色，由此确认从小鼠身上获得的脾脏细胞主要是t-all细胞。

图2显示了流式检测在原代t-all细胞和健康人外周血cd3+t细胞上的各个免疫检验点(pd-1，cd28，ctla-4，icos，4-1bb，btla，lag-3，ox40，cd40l，gitr，tigit，tim-3，vista，cd200)的表达(a)和平均荧光强度(mfi)(b)。健康人n＝4。在四次独立实验中以mean±sd形式展现数据。两组样品的统计学差异已经显示(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。“t”代表健康人外周血cd3+t细胞。

图3显示了在原代t-all细胞和健康人t细胞上的免疫检验点的mrna表达水平。(a)用q-pcr检测在原代t-all细胞和健康人外周血cd3+t细胞上的icos、pd-1、btla、cd200的mrna表达差异。健康人n＝4。在四次独立实验中以mean±sd形式展现数据。两组样品的统计学差异已经显示(*p<0.05,***p<0.001)。(b)用rt-pcr检测pd-1的mrna表达。分别以在t-all细胞中的mrna逆转成cdna时的无rna逆转录酶和无模板rna为2个阴性对照，以构建了pd-1稳定表达的293t细胞株作为阳性对照，检测到了t-all细胞和健康人pbmc上的pd-1的转录本。“t”代表健康人外周血cd3+t细胞。“pbmc”代表健康人外周血单核细胞。

图4显示了t-all细胞上pd-1基因的snp单核苷酸多态性测序。结果显示在pd-1基因胞内区第5个外显子上的单等位基因的胞嘧啶c突变成胸腺嘧啶t，突变位点在pd-1功能基序itim、itsm之外。

图5显示了用q-pcr检测在原代t-all细胞和健康人外周血cd3+t细胞上的调节pd-1表达的转录因子(t-bet、blimp-1、irf9、stat3、stat4、cfos、foxo1、notch1、nfatc1)的mrna表达水平。健康人n＝4。在四次独立实验中以mean±sd形式展现数据。两组样品的统计学差异已经显示(***p<0.001)。“t”代表健康人外周血cd3+t细胞。

图6显示了用q-pcr检测在体外抗pd-1抗体对t-all细胞上一些分子的mrna表达水平的影响。将t-all细胞种植在12孔板里(2.5×10⁶/孔)，同时加入终浓度为50ug/ml的抗pd-1抗体(bioxcel,be0188)或者同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0083)，共孵育48小时。在大于或等于3次的独立实验中以mean±sd形式展现数据。两组样品的统计学差异已经显示(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

图7显示了抗pd-1抗体阻断在t-all异种移植模型中的效果。(a)用抗pd-1抗体(本实验室制备)或者同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0086)进行治疗的概述。b-ndg小鼠(n＝6小鼠/组)在尾静脉注射原代t-all细胞(5×10⁶个细胞/小鼠)的前一天开始，每两天腹腔注射抗pd-1抗体或者ctrlab(每次注射200ug)。(b)在处死时用流式对脾脏内cd45+白血病细胞进行定量。(c)在抗pd-1抗体治疗的小鼠的脾脏中的t-all细胞进行cd45和ki67染色后，用流式评估白血病细胞的增殖。(d)在抗pd-1抗体治疗的小鼠的脾脏中的t-all细胞进行cd45、annexinv和7-aad染色后，用流式检测白血病细胞的凋亡水平。数据以mean±sem形式展现。两组样品的统计学差异已经显示(**p<0.01)。

图8显示了人t-all细胞表达pd-1。(a)数百名t-all病人的转录组测序数据。在饼图的黑色部分中显示表达pd-1转录本的t-all病人的相对百分比。(b)在饼图的黑色部分中显示表达pd-1转录本的人t-all细胞系的相对百分比。

图9显示了用流式检测在体外抗pd-1抗体对t-all细胞的增殖和凋亡的影响。(a)将细胞用cfse染色后，铺板，并加入50ug/ml的抗pd-1抗体(bioxcel,be0188)或者同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0083)，分别在0h、12h、24h、48h、72h用流式检测cfse荧光强度。(b)将t-all细胞种植在孔板里，并加入50ug/ml的抗pd-1抗体(bioxcel,be0188)或者同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0083)，共孵育48小时后，进行annexinv和7-aad染色并用流式检测其凋亡水平。两组之间无明显的统计学差异。

图10显示了在体外在t-all细胞上抗pd-1抗体(bioxcel,be0188)阻断后的转录组测序结果如图所示。(a-c)分别用venn图(a)、火山图(b)、热图(c)表现抗pd-1抗体阻断(实验组)和同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0083)处理(对照组)两组之间的差异表达基因。(d)热图代表了两组之间差异倍数排在前30个且已经有功能报导的差异表达基因。生物重复次数是每组3次。

图11显示了用q-pcr检测在体外抗pd-1抗体对t-all细胞上一些分子的mrna表达水平的影响。将t-all细胞种植在12孔板里(2.5×10⁶/孔)，同时加入终浓度为50ug/ml的抗pd-1抗体(bioxcel,be0188)或者同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0083)，共孵育48小时。在大于或等于次的独立实验中以mean±sd形式展现数据。两组样品的统计学差异已经显示(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

图12显示了抗pd-1抗体阻断在t-all异种移植模型中的效果。(a)在处死时用流式对骨髓内cd45+白血病细胞进行定量。(b)在抗pd-1抗体治疗的小鼠的骨髓中的t-all细胞进行cd45和ki67染色后，用流式评估白血病细胞的增殖。(c)在抗pd-1抗体治疗的小鼠的骨髓中的t-all细胞进行cd45、annexinv和7-aad染色后，用流式检测白血病细胞的凋亡水平。n＝6小鼠/组。数据以mean±sem形式展现。两组样品之间并无明显的统计学差异。抗pd-1抗体(本实验室制备)，同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0086)。

图13显示了抗pd-1抗体阻断在t-all异种移植模型中的效果。用流式对骨髓(a)和脾脏(b)内的cd5+白血病细胞(左)和cd7+白血病细胞(右)进行定量。n＝6小鼠/组。数据以mean±sem形式展现。两组样品的统计学差异已经显示(*p<0.05,**p<0.01)。抗pd-1抗体(本实验室制备)或者同型对照抗体(ctrlab)(bioxcel,be0086)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种pd1分子抑制剂在t淋巴细胞白血病治疗中的应用。实验结果表明抗pd-1抗体影响t-all细胞内的igfbp3和sult1a3的表达水平，体内实验的结果进一步表明抗pd-1抗体治疗抑制了t-all细胞在脾脏内的增殖。pd-1在t-all细胞上有表达，并起到一定的促瘤作用，这为使用抗pd-1抗体在临床上治疗t-all提供了一定的实验依据。在此基础上完成了本发明。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次报道了pd1分子在病人来源的急性t淋巴细胞白血病细胞t-all的表达情况。

2.本发明首次报道了pd1分子在t淋巴细胞白血病细胞上的调控功能.

3.本发明首次报道了t-all细胞上的转录因子t-bet、blimp-1和notch1的表达变化可能和pd-1的异常表达相关。

4.本发明首次报道了用pd-1抗体治疗抑制了t-all细胞在脾脏内的增殖。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

方法

病人数据和t-all异种移植模型

此类病人被确诊为急性t淋巴细胞白血病，在单倍体异基因造血干细胞移植后半年复发，多次化疗不能缓解，供者淋巴细胞输注失败，目前为疾病终末期，病情难以控制，预后极差。t-all病人样品细胞是由江苏省中医院血液科提供，这获得江苏省中医院伦理委员会的批准。在实验前病人已签署书面知情同意书。

t-all初发患者免疫表型：cd4、cd5、cd7、cd3、cd2、ccd3阳性，cd13、cd117、cd22、cd19、cd56、cd33、cd34、hla-dr、cd8、cd10、cd20、cd79a、mpo阴性。

5周龄的雌性nod-prkdc^scidil2rg/bcgen小鼠(成熟t淋巴细胞，b淋巴细胞和nk细胞缺陷)(b-ndg小鼠，biocytogen，北京，中国)被尾静脉注射入100ulpbs重悬的5×10⁶病人来源的t-all细胞(小鼠n＝6)。在第24-30天左右，将小鼠的脾脏细胞进行研磨，红细胞裂解，并用流式检测其纯度，用抗人的cd5、cd7、cd45抗体染色结果显示t-all细胞将近100％。

细胞和细胞培养

从每个健康人身上取得40ml外周血，用ficoll-paqueplus(ge，上海，中国)梯度分离出pbmc，直接进行流式分析，或者将pbmc用人cd3阳性选择试剂盒(stemcell)分选出cd3+t细胞后提取rna(健康人n大于等于3)。

将原代t-all细胞用含有10％fbs(gibco)，2.5％supergrow的mem-α细胞培养基培养，含有100ng/ml的il-2,的人scf,10ng/ml的人il-7,20nm的胰岛素，20ng/ml的人flt3配体(novoprotein)，37℃，5％co2的培养箱中培养

本发明生产的人pd-1稳定表达的293t细胞株(atcc)，用加了10％fbs的dulbecco的改良eagle的培养基(dmem)(hyclone)培养。

流式细胞术

获得的单细胞悬液用pd1-apc(miltenyi,130-100-440)，cd28-apc，ctla-4-pe，icos-pe，4-1bb-pe，btla-apc，lag-3-pe，ox40-pecy7，cd40l-pe，gitr-apc，tigit-apc，tim-3-pecy7，vista-apc，cd200-pecy7，cd3-fitc，cd45-fitc，cd45-apc，cd5-fitc，cd7-pe，cd7-pecy5，cd33-apc，cd19-fitc，cd56-apc(bd,r&d,biolegend)孵育。测定胞浆内ccd3抗原表达用cytofix/cytoperm固定/permeablization试剂盒(bd)，用cd45-apc进行表面染色并用纯化的抗cd3抗体(bd)阻断表面cd3抗原后，固定、破膜，分别用cd3-fitc和igg2a,κ-fitc(bd)进行胞内染色。所有数据用facscalibur(bd)收集，用flowjo软件(treestar,inc.)分析。

在体内和在体外抗pd-1抗体阻断

在体外，提前一天将t-all细胞复苏，一天后，将t-all细胞种植在12孔板里(2.5×10⁶/孔)，并加入50ug/ml的抗pd-1抗体(bioxcel,be0188)或者igg1对照抗体(bioxcel,be0083)，共孵育48小时，然后收集细胞提取蛋白或者rna，用于做wb、qpcr或者rnasequencing。

在体内，用抗pd-1抗体(本实验室制备)或者igg2b对照抗体(bioxcel,be0086)给b-ndg小鼠进行腹腔注射(每次每只鼠注射用200ulpbs稀释的200ug抗体)，每2天注射一次，注射抗体是从t-all细胞接种(每只鼠尾静脉注射5×10⁶细胞，100ulpbs重悬)的前一天开始。当对照组小鼠表现出临床白血病特征时，所有小鼠被处死(6小鼠/组)。

动物研究由苏州大学动物护理和使用委员会批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南(nih，第8版，2011)进行。经苏州大学伦理委员会批准。

rt-pcr和qpcr

关于rt-pcr，用microelute总rna试剂盒(omega)将总rna提取出来，再用revertaidfirststrandcdna合成试剂盒(thermoscientific)逆转成cdna。荧光定量pcr用powersybrgreenpcrmastermix(abi)在quantstudio^tm6flexreal-timepcrsystem(abi)上进行(引物序列列于si表2)。热循环在94℃下进行2分钟，然后在94℃下进行40个循环15秒，在60℃下进行20秒，在68℃下进行1分钟。所有样品每次是3个复孔，生物重复次数3次。基因表达相对β-actin，用2(-δδct)方法计算。

检测细胞增殖和凋亡

用转录因子缓冲液组(bd)检测增殖时，用cd45-fitc表面染色，固定、破核膜，用ki67-647或者igg1,κ-647(bd)核内染色。

用celltrace^tmcfse细胞增殖试剂盒(invitrogen)检测细胞增殖，按照手册将细胞用cfse染色后，计数铺板，并加入抗pd-1抗体(bioxcel)或者igg1抗体(bioxcel)(50ug/ml)，分别在0h、12h、24h、48h、72h用流式检测cfse荧光强度。

用fitcannexinv凋亡检测试剂盒(bd)和7-aad抗体(bd)检测细胞凋亡，分别在细胞和抗pd-1抗体(bioxcel)或者igg1抗体(bioxcel)孵育24h，48h，72h后检测，用100ul1×buffer将细胞重悬后，加入5ul7-aad和5ulannexinv，室温避光孵育15-20分钟，再补加300-400ul1×buffer，直接上流式。

rnaseq

将和抗pd-1抗体或igg抗体(bioxcel)共孵育48小时的t-all细胞收集，提取出rna。建立了文库，并由北京基因组学(bgi)用bgiseq-500进行测序。用过滤软件soapnuke进行数据过滤，读取未知碱基超过5％，低质量读数。获得的清晰数据(清晰数据(cleanreads))存储为fastq格式。用hisat将清晰数据(cleanreads)比对到参考基因组序列，使用bowtie2将清晰数据(cleanreads)比对到参考序列，这些序列是从ncbi的grch38.p11(hg38)中获得。用软件rsem计算基因和转录本的表达水平。degseq方法用于筛选两组间差异表达的基因。

数据分析

用graphpadprism6分析数据。组间比较用学生t-检验。p值＜0.05被认为是统计学上显著的。

实施例1.

来自白血病病人的t-all异种移植模型的构建和特征

因为在体外培养无法使原代t-all细胞生长，为了扩增t-all细胞以供后续实验，在b-b-ndg小鼠上构建了白血病异种移植模型。将病人来源的t-all细胞尾静脉注射后(每只鼠5×10⁶细胞，6只鼠)，收获小鼠的脾脏细胞(图1a)。为了验证从小鼠身上获得的脾脏细胞是t-all细胞，结合前述中病人初发t-all的免疫表型，用流式细胞术的方法进行细胞表面标志染色和胞内染色。如图1b所示，细胞是人cd33、cd19、cd56阴性，排除了这个肿瘤细胞是髓系细胞、b细胞、nk细胞来源的可能，细胞是表面标志人cd5、cd7表达高达90％以上，胞内分子人ccd3同样高表达，因此确定了这例疾病是t-all，从小鼠身上获得的脾脏细胞主要是t-all细胞。

实施例2.

在t-all细胞和健康人t细胞上的免疫检验点的表达差异

对t-all细胞和多例健康人来源的外周血t细胞进行流式细胞术分析，检测各个免疫检验点的表达差异。由图2a可知，相比健康人cd3+t细胞，t-all细胞上pd-1、cd28、cd200的表达是明显上调的，而btla表达是明显下调的，icos的表达是略微升高，tigit的表达是略微减少。当用mfi对这些免疫检验点的表达进行分析时，结果也是一致的(图2b)。

实施例3.

在t-all细胞和健康人t细胞上的icos、pd-1、btla、cd200的mrna表达差异

以上结果表明在此例t-all细胞上icos、pd-1、btla、cd200是表达异常的，接下来用qpcr和rt-pcr的方法在mrna的水平上进一步验证它们的表达情况。如图3a所示，相比健康人，在t-all细胞上icos、pd-1的mrna表达水平更高，且差异有统计学意义，cd200在mrna水平上表达是大幅度升高的，而btla在mrna水平上表达几乎是缺失的。同时构建pd-1稳定表达的293t细胞株作为阳性对照，应用rt-pcr的方法检测到了t-all和正常人pbmc上的pd-1的转录本(图3b)。因此，icos、pd-1、cd200在病人来源的t-all细胞上是有表达的。

实施例4.

在人t-all中pd-1表达

对数百名t-all病人进行基因组测序，测序结果显示80.7％t-all病人肿瘤细胞内部检测(＞0.5fpkm)到pd-1转录本(213/264)，表达量高至146fpkm(图8a)。本发明人在embl-ebi表达图谱上查阅人t-all细胞系，获取了4个rna测序数据集，发现35.1％人t-all细胞系有pd-1转录本表达(13/37)(图8b)。

实施例5.

t-all细胞snp单核苷酸多态性测序

对t-all细胞进行snp单核苷酸多态性测序，发现pd-1基因的第5个外显子的一个碱基发生单等位基因突变，由胞嘧啶c突变成胸腺嘧啶t(图4)。

实施例6.

调控pd-1表达的转录因子的表达情况

在图3有表达差异的免疫检验点中，进一步研究在t-all细胞上pd-1表达的调控因素，因此用qpcr的方法检测了相关转录因子的mrna表达水平。如图5所示，相比健康人t细胞，在t-all细胞上调控pd-1表达的诱导蛋白中，irf9、stat3、stat4、cfos、foxo1的mrna表达是明显下调的，notch1的mrna表达是明显上调的，而nfatc1的mrna表达没有明显差异；在调控pd-1表达的抑制蛋白中，t-bet和blimp-1的mrna表达是显著下调的。因此，对于pd-1在t-all细胞上的表达异常升高，本发明人认为这和调控pd-1表达的抑制蛋白t-bet和blimp-1的mrna表达下调以及诱导蛋白notch1的mrna表达上调相关。

实施例7.

抗pd-1抗体阻断对t-all细胞内分子表达水平的影响

为了探索pd-1在t-all细胞中的功能，用抗pd-1抗体阻断t-all细胞的pd-1后分别用cfse和annexinv/7-aad染色检测，结果显示pd-1阻断组和igg对照组的细胞增殖和凋亡都没有差异(图9)。于是把抗pd-1抗体和igg抗体分别和t-all细胞共孵育后，提取rna，进行转录组测序。测序结果显示生物学重复样品之间相关性达98％以上，两组间的差异基因数有236个(图10)。然后从中选取了组间差异结果比较显著、已经有功能报导的基因进行下一步研究分析，并用qpcr验证。qpcr结果显示，抗pd-1抗体阻断诱导了cd151、igfbp3、clu的mrna表达，降低了tiaf1、mtpn、sult1a3的mrna表达，而对cd302、hhipl2、mmp2、sult1a4、igfbp7的mrna表达没有影响(图6，图11，表1)。

表1

实施例8.

抗pd-1抗体阻断在t-all异种移植模型中的作用

为了研究pd-1封闭抗体在小鼠体内肿瘤生长中的作用，将t-all细胞尾静脉注射入b-ndg小鼠,(每只鼠5×10⁶细胞，4只鼠)，每两天腹腔注射一次200ug的抗pd-1抗体(实验组)或igg2b对照抗体(对照组)，注射抗体从i.v.注射t-all的前一天开始一直到处死小鼠，也就是t-all注射后的20-30天(图7a)。两组的脾脏和骨髓中人cd45+细胞比率没有明显差别，说明了pd-1阻断对t-all在脾脏和骨髓中的浸润没有明显影响(图7b，图12a)。对两组的骨髓和脾脏中人cd5+细胞和人cd7+细胞的检测也证实了这个结果(图13)。ki67染色结果显示实验组的脾脏t-all细胞增殖明显减少，然而两组的骨髓t-all细胞增殖没有明显差异(图7c，图12b)。另外，annexinv/7-aad表达分析结果显示两组的脾脏和骨髓t-all细胞的凋亡并无统计学差异(图7d，图12c)。这些结果显示抗pd-1抗体治疗仅仅抑制了t-all细胞在脾脏内的增殖，却对t-all的器官浸润和凋亡并无影响。

讨论

本发明人对此例t-all细胞进行snp单核苷酸多态性测序，发现pd-1基因的第5个外显子的单等位基因的胞嘧啶c突变成胸腺嘧啶t，可能导致此处的蛋白质序列由甘氨酸突变成了缬氨酸，二者都属于非极性氨基酸，且突变位点在pd-1胞内区域的功能基序itim、itsm之外，所以这个突变可能对蛋白的结构和功能没有影响。

现在在不同免疫细胞中对pd-1表达调控的转录因子，包括抑制蛋白t-bet和blimp-1，诱导蛋白isgf3、stat3、stat4、cfos/ap-1、foxo1、notch、nfatc1、nf-kb。在慢性lcmv感染中，体内体外t-bet的过表达和体内t-bet的的基因删除实验都表明，t-bet能抑制pd-1表达。从急性感染lcmv的blimp-1敲除小鼠中分离出的t细胞研究发现，在急性感染后blimp-1缺乏的t细胞有更高的pd-1表达。在体外实验中特异地抑制notch信号通路，活化t细胞上的pd-1转录和蛋白表达都减少了。因此本发明人认为t急淋细胞上抑制蛋白t-bet和blimp-1的表达下调以及诱导蛋白notch1的表达上调可能是pd-1表达升高的原因。

sult1a3属于sult细胞溶质磺基转移酶超家族，这个家族催化各种外源性物质、激素和神经递质的硫酸盐化作用。据报导，在肝癌细胞上sult1a3/4能刺激肿瘤细胞的迁移、侵袭、上皮-间质转化，以及促进癌症干细胞的活化，可能是肝癌的潜在治疗靶标和生物标志。igfbp3是胰岛素样生长因子结合蛋白3insulin-likegrowthfactor-bindingprotein3，据报导，在一些肿瘤细胞中，igfbp3通过调节细胞的增殖、凋亡、迁移来发挥肿瘤抑制作用，比如肺癌，t-all和b-all，乳腺癌，其中，研究发现在all病人的的骨髓和外周血中igfbp3表达是下调的。在本发明人的体外实验中pd-1阻断抗体导致t-all细胞中的sult1a3的mrna表达下降，igfbp3的mrna表达升高，本发明人认为pd-1在t-all细胞上可能通过上调促癌蛋白sult1a3、下调抑癌蛋白igfbp3，促进了t-all细胞生长。

在b-ndg小鼠体内，抗pd-1抗体的使用并没有使t-all在脾脏和骨髓中的浸润和凋亡发生变化，本发明人认为pd-1对此例t-all细胞的移植和凋亡并无明显影响；但是抗pd-1抗体使脾脏内的t-all细胞增殖减少了，本发明人认为pd-1有促进t-all细胞的增殖的功能，即能加快肿瘤生长，而这不依赖于适应性免疫系统。据报导，在黑色素瘤和肝细胞癌细胞内部的pd-1也有促瘤作用，这和本发明人的研究结果相符合。本发明人认为，临床上抗pd-1抗体治疗不仅可以靶向肿瘤微环境中的高表达pd-1的功能耗竭性t细胞，使它们重新活化，产生抗肿瘤免疫反应，可以靶向表达有pd-1的其他免疫细胞，还可以靶向肿瘤细胞上的pd-1，抑制pd-1对肿瘤细胞的促瘤作用，减少肿瘤细胞本身的增殖，这样就多方面的提高了抗pd-1抗体治疗的效果。实际上，本发明人的t-all异种移植小鼠模型的实验中，抗pd-1抗体抑制了脾脏内t-all细胞的增值，揭示了pd-1在t-all治疗中的潜在作用。

总结

本发明成功构建了t-all异种移植模型，应用流式细胞术确定了从小鼠脾脏获得的细胞主要是pdt-all细胞。应用流式细胞术、q-pcr和rt-pcr检测在pdt-all细胞和健康人cd3+t细胞上免疫检验点的表达，结果显示icos、pd-1、cd200在pdt-all细胞上是有表达的。和健康人cd3+t细胞相比，pdt-all细胞上抑制蛋白t-bet和blimp-1的表达下调以及诱导蛋白notch1的表达上调可能是pd-1表达升高的原因。在体外，pd-1阻断抗体导致pdt-all细胞中的sult1a3的mrna表达下降，igfbp3的mrna表达升高。在pdt-all细胞上pd-1可能通过上调促癌蛋白sult1a3、下调抑癌蛋白igfbp3，促进了pdt-all细胞生长。在t-all异种移植模型中，抗pd-1抗体治疗抑制了pdt-all细胞在脾脏内的增殖，但是对pdt-all细胞的器官浸润和凋亡并无影响。pd-1有促进pdt-all细胞增殖的功能，即能加快肿瘤生长，而这不依赖于适应性免疫系统。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120>pd1分子抑制剂在t淋巴细胞白血病治疗中的应用

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