抗病毒剂及治疗病毒感染的方法与流程

本申请案主张于2017年1月24日递交的美国临时申请案62/449,600的优先权，该临时申请案通过引用而以其整体并入本文中用于全部目的。

本发明涉及用于治疗病毒感染的反义寡核苷酸，以及采用该寡核苷酸的抗病毒治疗方法。

背景技术：

细菌感染及病毒感染为威胁人类健康的主要问题(morensandfauci,2013)。细菌感染的治疗很大程度上依赖于抗生素(bassettietal.,2016；bushandbradford,2016)，而抗病毒疗法仍然以支持性疗法及症状治疗为主。此外，由于对未发展地区持续开发及文明化，使得新兴及再次流行的病原菌持续带给人类威胁。由于缺乏即时可用的抗病毒剂，人类将无法因应突发的流行性病毒感染，因此发展广谱抗病毒药物的策略极为重要(vigantetal.,2015)。

目前，市面上仅有数种抗病毒剂可用，其作用机制为作用于病毒的特定基因，如作用于1型人类免疫缺陷病毒(hiv-1)的蛋白酶及逆转录酶；以及针对丙肝病毒的非结构性蛋白，借以干扰病毒复制(o'connoretal.,2017；spengler,2017)。此外，新的抗病毒剂也以病毒-宿主相互作用或病毒传播所需的宿主细胞基因为标靶，如抑制病毒与宿主细胞膜融合，进而阻断病毒进入细胞；抑制病毒聚合酶的活性；或影响宿主对病毒感染的免疫反应等(britoandpinney,2017；koetal.,2017；prasadetal.,2017)。

然而，对于无需考虑病毒的高度突变特征并且能有效治疗多种病毒所造成的感染的广谱抗病毒剂，仍是未能满足的需求。

技术实现要素：

鉴于前述，本公开提供抗病毒剂。该抗病毒剂包含与哺乳动物近亲的dnaj(mammalianrelativeofdnaj,mrj)基因互补的核苷酸衍生物，其中，该核苷酸衍生物包含至少一个其糖基部分经吗啉(morpholine)取代的核苷酸。

于本公开的一具体例中，该核苷酸衍生物是吗啉代寡核苷酸。于本公开的另一具体例中，该核苷酸衍生物中的核苷酸是吗啉代核苷酸。

于本公开的一具体例中，该抗病毒剂中的核苷酸衍生物与该mrj基因的内含子8互补。于本公开的另一具体例中，该核苷酸衍生物与该mrj基因的内含子8的5’剪接位点区域互补。于本公开的再一具体例中，该mrj基因是人类mrj基因。

于本公开的一具体例中，该抗病毒剂中的核苷酸衍生物包含约20个至约40个核苷酸。于本公开的另一具体例中，该核苷酸衍生物的长度不超过30个核苷酸。于本公开的再一具体例中，该核苷酸衍生物的长度为25个核苷酸。

于本公开的一具体例中，该核苷酸衍生物包含seqidno:1。于本公开的另一具体例中，该核苷酸衍生物可为seqidno:1的序列，即，组成该核苷酸衍生物的序列确切为seqidno:1的序列，而无额外的序列。于本公开的另一方面，提供该抗病毒剂在对有此需要的个体治疗与病毒感染相关的疾病或病症的用途。

于本公开的一具体例中，该病毒感染由选自由下列所组成组的病毒造成：巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、1型人类免疫缺陷病毒(hiv-1)、2型人类免疫缺陷病毒(hiv-2)、人类偏肺病毒、人类副流感病毒(hpiv)、流感病毒、呼吸道合胞体病毒(rsv)、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、肠病毒71(ev-71)、肠病毒d68(ev-d68)、柯萨基病毒(coxsackievirus)、登革病毒、日本脑炎病毒(jev)、及其任意组合。于本公开的另一具体例中，该病毒感染由cmv、ebv、hiv、流感病毒、rsv或其任意组合造成。于本公开的再一具体例中，该病毒感染由rsv造成。

于本公开的一具体例中，该与病毒感染相关的疾病或病症选自由下列所组成的组：视网膜炎(由例如cmv造成)、结肠炎(由例如cmv造成)、传染性单核细胞增多症(由例如cmv及ebv造成)、霍奇金氏淋巴瘤(由例如ebv造成)、伯基特氏淋巴瘤(burkitt’slymphoma)(由例如ebv造成)、鼻咽癌(由例如ebv造成)、后天性免疫缺乏综合征(aids)(由例如hiv-1及hiv-2造成)、上呼吸道感染(uri)、下呼吸道感染(lri)(由例如hpiv、腺病毒、rsv、冠状病毒、鼻病毒、及ev-d68造成)、心肌炎(由例如柯萨基病毒造成)、脑炎(由例如ev-71、ev-d68、登革病毒、及jev造成)、登革出血热及登革休克综合征(dhf/dss)(由例如登革病毒造成)、及其任意组合。于本公开的另一具体例中，该与病毒感染相关的疾病或病症是uri或lri。

于本公开的另一方面，提供阻抑病毒感染的方法。该方法包含将该抗病毒剂投予有此需要的个体。于本公开的一具体例中，该病毒感染可由cmv、ebv、hiv、流感病毒、rsv或其任意组合造成。

于本公开的一具体例中，该方法还包含将额外的抗病毒疗法投予该个体。于本公开的一具体例中，该额外的抗病毒疗法可选自由下列所组成的组：卡巴韦(carbovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、干扰素、司他夫定(stavudine)、3’-叠氮基-2’,3’-二去氧-5-甲基-胞苷(cs-92)、β-d-二氧代环戊烷核苷酸、磷酸奥司他韦(oseltamivirphosphate)、及其任意组合。

于本公开的一具体例中，该方法还包含，当该个体具有二次细菌感染时，将抗生素投予该个体。

本公开的抗病毒剂可用于治疗病毒感染，尤其是由人类rsv及1型人类免疫缺陷病毒(hiv-1)造成的感染，而人类rsv是全世界婴儿和老年人群体中病毒性细支气管炎及肺炎的主要肇因。

附图说明

借由阅读对具体例的下述详细说明并参考附图，可更充分理解本揭露，其中：

图1a是显示含有外显子8及9以及内部截短的内含子8的mrj前体mrna受体的说明图。反义吗啉代寡核苷酸与mrj内含子8的5’剪接位点互补，且其结合阻止u1作用于该剪接位点上。经³²p标记的mrj前体mrna的体外剪接在hela细胞核提取物中进行。反义吗啉代寡核苷酸(momrj)或负对照组吗啉代寡核苷酸(moc)加入反应中(模拟组，无吗啉代寡核苷酸)。前体mrna及剪接中间体及产物的凝胶谱图如右侧描述。

图1b显示hek293t细胞中mrj亚型的rna及蛋白质表达量的rt-pcr及免疫印迹结果，该细胞经不同量的momrj或对照组moc于无血清的培养基中处理24h。柱状图显示mrj-l与总mrj(t)的相对比；资料皆获自三个独立实验。星号：*p≦0.05；**p≦0.01；***p≦0.001。

图2a显示，thp-1细胞在160nm的pma存在下培养24h而分化为巨噬细胞，并经momrj或对照组moc于无血清的培养基中处理24h后，该细胞中mrj亚型的rna及蛋白质表达量的rt-pcr及免疫印迹结果。星号：*p≦0.05；**p≦0.01。

图2b显示，将如图2a所示培养并以吗啉代寡核苷酸处理后且源自thp-1的巨噬细胞以野生型hiv-1感染，借由elisa检测培养上清液中的病毒p24gag蛋白。p24浓度的平均值获自两个独立实验。星号：**p≦0.01。

图2c显示，经如图2b所示培养并处理之后，在以vsv-g假模式hiv-1nl4-3的鼠热稳定抗原cd24(hsa)感染的细胞中，代表hiv-1阳性细胞的hsa的百分比，该百分比自两个独立实验获得。hsa的百分比借由使用pe标记的hsa抗体的facs分析而获得。星号：*p≦0.05。

图3a显示，以所指示浓度的对照组moc或momrj于无血清的培养基中处理24h的hep2细胞中mrj亚型的rna及蛋白质表达量及其各自的对照组──肌动蛋白及gapdh──的rt-pcr及免疫印迹结果。柱状图显示mrj-l与总mrj(t)的相对比。星号：*p≦0.05；**p≦0.01。

图3b显示，使用吗啉代寡核苷酸处理48h并经rsva2病毒株以moi0.1感染的hep2细胞中，rsvf、mrj亚型及gapdh的免疫印迹结果。

图3c显示经图3b所示处理的hep2细胞中的rsv病毒效价及rna表达量。病毒效价借由噬菌斑试验使用培养上清液测定。rsvrna表达量借由培养上清液中转录病毒核蛋白n，并以rt-qpcr予以测定。星号：**p≦0.01；***p≦0.001。

图3d显示，使用吗啉代寡核苷酸处理24h并随后经rsva2病毒株以moi1感染12h的hep2细胞中，借由rt-qpcr测定且使用肌动蛋白标准化的病毒mrna相对表达量。柱状图显示来自三个独立实验的平均值。星号：*p≦0.05；**p≦0.01；***p≦0.001。

具体实施方式

下述具体实施例用以例示性说明本公开。基于本公开的说明书，本发明所属领域技术人员可设想本公开的其它优点。本公开亦可如不同具体实施例中所述予以实施或应用。

除非另做定义，否则本文中使用的全部技术及科学术语具有与本发明所属领域技术人员所一般理解者相同的意义。本文描述优选的方法及材料，尽管本公开的实践或测试可使用与本文所述者相似或等效的任意方法及材料。对于本公开的目的，下述术语定义如下。

如本文中所用，除非语境中明确排除，否则单数形式“一”及“该”包括多个指示物。因此，举例而言，“一抗原”包括多种抗原的混合物；“一药学可接受的载剂”包括两种或更多种此等载剂的混合物等。如此，术语“一”、“一个或多个”、及“至少一个”于本文中可互换使用。

此外，本文中使用的“及/或”视为两个指定特征或组分中各自具有或不具有另一者的具体揭露。因此，于本文中，诸如“a及/或b”的短语中使用的术语“及/或”意图包括“a及b”、“a或b”、“a”(单独)、及“b”(单独)。

本公开提供用于抑制病毒生长并由此治疗与病毒感染相关的疾病或病症的抗病毒剂。该抗病毒剂包含用作反义寡核苷酸的与mrj基因互补的核苷酸衍生物，其中，该核苷酸衍生物可包含至少一个吗啉代核苷酸。特别地，该核苷酸衍生物与该mrj基因的非编码序列互补。

“编码序列”意指对用于基因的多肽产物的编码有贡献的任意核酸序列。与之相反，术语“非编码序列”指的是对用于基因的多肽产物的编码没有贡献的任意核酸序列。

术语“互补”及“互补性”指的是借由碱基配对规则而相关联的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。举例而言，序列“a-g-t”与序列“t-c-a”互补。互补性可为“部分的”，其中仅一部分核酸碱基根据碱基配对规则匹配。或者，该等核酸之间可存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度显著影响核酸链之间杂交的效率及强度。尽管一般所希望的是完美互补性，一些具体例可包括一个或多个，但优选为6、5、4、3、2、或1个对于靶标rna的误配。寡聚体中包括位于任意位置的变异。某些具体例中，相对于寡聚体内部的变异，优选位于接近该寡聚体端点处的序列中的变异；且若存在变异，则其典型处于5’及/或3’端的约6、5、4、3、2、或1个核苷酸内。

术语“反义寡聚体”或“反义化合物”或“反义寡核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，且指的是环状子单元的序列，其各自荷有碱基配对部分且借由子单元间的链结基链结，其中，该等链结基允许该等碱基配对部分借由沃森-克里克(watson-crick)碱基配对而杂交至核酸(典型为rna)中的靶标序列，以于该靶标序列内形成核酸：寡聚体异源双链。该环状子单元可以核糖或另一戊糖为主，或者，于某些具体例中，以吗啉代基团为主(参见下文的吗啉代寡核苷酸的说明)。还预期肽核酸(pnas)、锁定的核酸(lnas)、2’-o-甲基寡核苷酸及rna干扰剂(sirna剂)、及该领域中已知的其它反义剂。

反义寡聚体可设计为阻断或抑制mrna的转译，或抑制天然前体mrna剪接加工，或诱发靶标mrna的降解；且可称之为“指向”或“靶向”与其杂交的靶标序列。某些具体例中，该靶标序列包括一区域，该区域包括mrna的aug起始密码子、预加工的mrna的3’或5’剪接位点、分枝点。该靶标序列可位于外显子内或内含子内。用于剪接位点的靶标序列可包括一mrna序列，该mrna序列的5’端1至约25个碱基对处于预加工mrna中正常剪接受体连接的下游。优选的剪接位点靶标序列是预加工mrna的任何区域，包括剪接位点或完全包含在外显子编码序列内或跨越剪接受体或供体位点。当寡聚体以上揭方式靶向靶标时，更通常称寡聚体为“靶向”生物学相关的靶标，如蛋白质、病毒、或细菌。

术语“吗啉代寡核苷酸”或“pmo”(磷酰胺-或磷酰二胺吗啉代寡聚体)指的是由吗啉代子单元结构构成的寡核苷酸类似物，其中，(i)该等结构借由含磷的链结基链结在一起，该链结基的长度为1至3个原子，优选为2个原子，且优选不带电或阳离子性，使一个子单元中吗啉代的氮连接至相邻子单元的5’环外碳；以及(ii)每一吗啉代环荷有可借由碱基特异性氢键键结而有效结合至多核苷酸中碱基的一嘌呤或嘧啶或一等效碱基配对部分。可对此链结基作出变异，只要他们并不干扰结合或活性即可。举例而言，附接至磷的氧可取代为硫(硫代磷酰二胺)。该5’氧可取代为胺基或低级烷基取代的胺基。附接至磷的侧链氮可未经取代、或经(任选经取代的)低级烷基单取代或二取代。亦参见下文关于阳离子链结基的探讨。该嘌呤或嘧啶碱基配对部分典型为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。吗啉代寡聚体的合成、结构、及结合特征详述于美国专利5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063、及5,506,337和pct申请案pct/us07/11435(阳离子链结基)及pct申请案pct/us2008/012804(改善的合成)中，上述专利全部借由引用而并入本文。

“有效量”或“治疗有效量”指的是治疗性化合物(如反义寡聚体)投予至哺乳动物个体的量，该量作为单剂量或一系列剂量的一部分而有效产生所希望的治疗效果。对于反义寡聚体，这一效果典型借由抑制所选择的靶标序列的转译或天然前体mrna剪接加工而成。靶向病毒的“有效量”也指有效降低感染性病毒的复制速率、及/或病毒载量、及/或与该病毒感染相关的症状的量。

与借由无反义化合物或由对照组合物产生的反应相比，反应中的“降低”可为“统计学显著”且可包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的降低，且包括上述数字间的全部整数。

本文中使用的“序列同一性”或，举例而言，包含“与……50％一致的序列”的表述，指的是在比较窗口内，序列基于核苷酸与核苷酸比对或氨基酸与氨基酸比对而得出的一致程度。因此，“序列同一性的百分比”可借由下述者计算：比较两个在比较窗口内最佳对准的序列，确定两个序列中出现一致的核酸碱基(如，a、t、c、g、i)或一致的氨基酸残基(如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、he、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gin、cys及met)的位置的数目，以获得匹配位置的数目，将该匹配位置的数目除以该比较窗口中的位置总数(亦即，窗口尺寸)，所得的商乘以100以获得序列同一性的百分比。

治疗包括但不限于，投予例如药学组合物，且可预防性地实施，或于病理学事件启动后或与病原剂接触后实施。治疗包括对与病毒感染相关的疾病或病症的症状或病理的任意所欲效果。相对于被诊断为感染特定病毒的相关术语“改善的治疗结果”可指缓解或缩减病毒的生长、或病毒载量、或可检测的与该特定病毒感染相关的症状。

因此，本公开提供一种治疗病毒感染的方法，该方法借由将任选的作为药学制剂或剂型的一部分的本公开的一种或多种反义寡聚体(如，seqidno.1及其变体)投予至有此需要的个体。如本文中所使用，“个体”可包括任何显现可使用本公开的反义化合物治疗的症状或处于显现症状的风险下的动物，如患有病毒感染或处于病毒感染的风险下的个体。适当的个体(患者)包括实验动物(如，小鼠、大鼠、兔、或豚鼠)、农场动物、及驯养动物或宠物(如，猫或狗)。包括非人灵长动物，另优选为人类患者。

本公开中使用的反义寡聚体设计为以哺乳动物近亲的dnaj，即mrj为靶标。mrj亦称为dnajb6、人类dnaj/hsp40家族成员b6，且是具有两个交替剪接的亚型，分别名为大亚型(mrj-l)及小亚型(mrj-s)(hanaiandmashima,2003)。mrj-l包括10个外显子，编码326个氨基酸残基。mrj-s不具有最后两个外显子，故其缺少mrj-l的羧基端95个残基，但保留来自内含子8的10个残基的序列。

本公开提供一种反义寡聚体，其以mrj剪接位点为靶标且抑制其内含子8剪接，从而降低mrj-l的表达。

于一具体例中，本公开的抗病毒剂的核苷酸衍生物与该mrj基因的内含子8的5’剪接位点区域互补。

作为借由使用本公开中提供的反义寡聚体的结果，mrj-l的mrna表达及蛋白质生产中的降低可抑制细胞中的病毒感染、复制及生产。于一具体例中，细胞中病毒感染、复制及生产的抑制借由mrj-l形式的缺失并因此令病毒蛋白进入该细胞的细胞核而达成。

于一具体例中，作为借由使用本公开中提供的反义寡聚体的结果，mrj-l的mrna表达及蛋白质生产中的降低可抑制细胞中的hiv-1复制。

于一具体例中，作为借由使用本公开中提供的反义寡聚体的结果，mrj-l的mrna表达及蛋白质生产中的降低可抑制细胞中的rsv复制。

于一具体例中，本公开的抗病毒剂可用于阻抑病毒感染及治疗与病毒感染相关的疾病或病症。

于一具体例中，本公开的抗病毒剂可与其它抗病毒疗法合用。该抗病毒疗法的实例包括，但不限于，卡巴韦、阿昔洛韦、干扰素、司他夫定、3’-叠氮基-2’,3’-二去氧-5-甲基-胞苷(cs-92)、β-d-二氧代环戊烷核苷酸、及磷酸奥司他韦。

于一具体例中，当该个体具有二次细菌感染时，本公开的抗病毒剂可与抗生素合用。

多个实施例用以例示性说明本公开。下述实施例不应视为限制本公开的范畴。

[实施例]

细胞培养及化学品

将人类胚胎肾293t细胞(hek293t)保持在含有10％胎牛血清(fbs)的杜尔贝科改进伊格尔培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium(dmem)；hyclone)中。于含有dmem并以10％fbs补充的营养混合物f-12(dmem/f12；赛默飞科技公司(thermofisherscientific))中培养2型人类上皮(hep2)细胞。于以10％fbs补充的rpmi1640(hyclone)中培养人类单核thp-1细胞。借由将160nm佛波醇12-豆蔻酸盐13-醋酸盐(phorbol12-myristate13-acetate(pma)；p8139，西格玛公司(sigma))加入培养基24h，使thp-1细胞分化为类巨噬细胞。根据制造商的推荐，使用lipofectamine2000(invitrogen)实施转染。

体外剪接试验

借由使用ecori线性化pcdna-mrj-e89载体及t7聚合酶(promega)的体外转录而产生放射同位素(³²p)标记的mrj前体mrna。用于hela细胞核提取物制备及体外剪接反应的过程描述于tarnandsteitz,1994。如图示所示，加入吗啉代寡核苷酸。使用trizol试剂(invitrogen)提取总rna，并在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，之后进行放射显影。

吗啉代寡核苷酸处理

本研究中使用的吗啉代寡核苷酸包括与mrj内含子8的5’剪接位点区域互补的momrj(5’-cagcatctgctccttaccatttatt-3’(seqidno.1)；genetools,llc)、以及负对照组moc(5’-cctcttacctcagttacaatttata-3’(seqidno.2)；genetools,llc)。hek293t、thp-1及hep2细胞使用吗啉代寡核苷酸于无血清的培养基中处理24h。

hiv产生及感染

为了产生vsv-g假模式的hiv-1nl4-3，以nl4-3hsar⁺e^-载体(获自nihaidsreagentprogram)及封装载体pmd.g共转染2x10⁶hek293t细胞。为了测定病毒效价，在转染48h后收获细胞培养上清液，并使用抗p24gag(perkinelmer)进行elisa(heetal.,1995)。源自thp-1的巨噬细胞(参见上文)以吗啉代寡核苷酸在无血清的培养基中处理24h，之后以hiv-1nl4-3(20ngp24每1x10⁵细胞)感染48h。借由使用抗鼠cd24(hsa)的pe标记抗鼠单株抗体(m1/69；昂飞公司(affymetrixebiosciense))的facs分析来测定报导基因表达。hivada病毒株传播及效价如先前描述于chiangetal.,2014。如上文所述，以吗啉代寡核苷酸处理源自thp-1的巨噬细胞，之后进行hivada感染(20ngp24每1x10⁵细胞)6天。

rsv产生及感染

为传播rsv，于6孔盘中生长至80％汇集的hep2细胞以a2病毒株感染，并于含有2％fbs的dmem/f12培养基中培养3至4天。借由使用噬菌斑试验(mckimm-breschkin,2004)来测定上清液中的病毒效价。简而言之，将经稀释的病毒加入6孔盘中的hep2细胞，培育2h。吸收后，以pbs清洗细胞，并以含有2％fbs的dmem/f12培养基与0.3％琼脂的混合物于37℃培养箱里覆盖6天。使用rsva2以0.1的感染复数(moi)感染经减弱的细胞2h。使用pbs清洗未结合的病毒后，再培育细胞48h。进行抗rsv的衣壳融合蛋白(f)的免疫印迹分析细胞萃取物。收获上清液进行噬菌斑试验。此外，为评估基因体rna表达量，使用随机引子进行上清液rna的逆转录，之后使用特异性引物进行rsvn的定量pcr(roche)(表1)。借由使用寡(dt)引物的逆转录以及随后使用特异性引物进行的定量pcr(roche)(表1)，检查被感染细胞中ns1、m2-1及f基因的表达。对于吗啉代寡聚体的处理，使用rsva2以0.1的moi令细胞吸收2h。移除未结合的病毒后，于吗啉代寡聚体的存在下再继续培育48h。收集细胞萃取物及上清液进行上述分析。使用吗啉代寡聚体于无血清的培养基中处理细胞24h，随后使用rsva2以moi1感染12h。检测细胞萃取物中的病毒mrna表达。

pcr及rt-pcr

使用trizol试剂(invitrogen)萃取rna，且使用随机引物或寡(dt)及superscriptiii(invitrogen)进行逆转录，之后使用基因特异性引物进行pcr(表1)。pcr产物于2％琼脂凝胶上分离。

免疫印迹分析

如先前所述(chiangetal.,2014)，使用改进的化学发光检测试剂盒(thermoscientific)实施免疫印迹。所使用的抗体针对下述蛋白质或表位：mrj(abnova,h00010049-a01)、rsvf(santacruzbiotech,sc-101362)、ha(convance,16b12)、gfp(santacruzbiotech,sc-8334)、及gapdh(proteintech,10494-1-ap)。hrp-接合二次抗体包括抗鼠igg(seracare,5210-0183)及抗兔igg(genetex,gtx213110-01)。

统计分析

使用graphpadprism5双尾学生t测试来显示该等实验的显著性。使用imagej软体(nationalinstitutesofhealth,usa)来定量谱带。

表1.用于qpcr及pcr的引子组

实施例1：吗啉代寡核苷酸调节mrj剪接

具有如seqidno.1所示的序列的反义吗啉代寡核苷酸(momrj)与内含子8的5’剪接位点互补，且用于干扰mrj基因的剪接。使用体外剪接试验评估此吗啉代寡核苷酸的效能。mrj前体mrna含有外显子8至9以及内部截短的内含子(图1a，上排)。该mrj前体mrna在hela细胞核提取物中剪接。momrj抑制剪接，而吗啉代寡核苷酸的负对照组(moc)则无此效果(图1a，下排)。此结果表明，momrj特异性地扰乱内含子8剪接。接着，评估momrj对于hek293t细胞中mrj亚型表达的效果。rt-pcr及免疫印迹分析显示，增加momrj的量抑制了对外显子9/10的包含，因此减少mrj-lmrna及蛋白质的表达(图1b，道次7至10)。而moc并不影响mrj比例(道次2至5)。因此，本文中使用的以mrj剪接位点为靶向的吗啉代寡核苷酸是干扰细胞中mrj-l的表达量。

实施例2：以mrj为靶标的吗啉代寡核苷酸抑制hiv-1复制

通过对mrj剪接的干扰及对mrj-l表达的抑制，momrj能阻碍巨噬细胞中的hiv-1复制。如在hek293t细胞中所观察的，momrj减少了thp-1细胞中的mrj-lmrna及蛋白质表达量，而moc无此效果(图2a)。以momrj处理经hiv-1感染的源自thp-1的巨噬细胞(konopkaandduzgunes,2002)，且评估hiv核心蛋白p24的表达。免疫吸附试验显示，momrj大幅地降低了hiv-1感染细胞的上清液中p24的表达量，而moc无此效果(图2b)。使用hiv单次感染系统进一步评估momrj在hiv-1感染早期中的效果，于该系统中，vsv-g假模式hiv-1nl4-3病毒株包含位于nef区域的作用为报导基因的鼠热稳定抗原cd24(hsa)基因(heetal.,1995)。使用荧光激活细胞分选术(facs)评估hsa阳性细胞。如图2c中所示，momrj可减少呈现hsa的细胞的数目，而moc无显著效果。此等结果表明，以mrj为靶标的吗啉代寡核苷酸借由降低mrj-lmrna表达及蛋白质产生而于早期阶段抑制hiv-1的生命周期。

实施例3：以mrj为靶标的吗啉代寡核苷酸抑制rsv复制

进一步检查momrj对于限制rsv产生的能力。momrj及对照组moc经效价测试，并用于hep2细胞中。rt-pcr及免疫印迹分析显示，momrj有效地降低了mrj-l的mrna及蛋白质表达量，而未对mrj-s造成此效果(图3a)。随后，评估经吗啉代寡核苷酸处理的细胞内的rsv病毒量。免疫印迹分析显示，于经momrj处理的细胞，rsvf蛋白质表达显著地下降(图3b)。噬菌斑试验及rsvnmrna的rt-qpcr证实，momrj实质上抑制了病毒体产生(图3c)。当使用momrj处理时，病毒次基因体mrna生产亦下降，而moc显示无抑制效果(图3d)。因此，momrj借由降低mrj-l的mrna及蛋白质表达量而抑制rsv的次基因体mrna生成达到限制病毒复制的效果。

序列表

<110>黄立民

<120>抗病毒剂及治疗病毒感染的方法

<130>80044

<150>us62/449,600

<151>2017-01-24

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mrj的互补性mo

<400>1

cagcatctgctccttaccatttatt25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>momrj的控制组mo

<400>2

cctcttacctcagttacaatttata25

<210>3

<211>38

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(38)

<400>3

cacttgatggcttacccttatgatgtgccagattatgc38

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(32)

<400>4

cacttggaattcacctgctgcggacgcgaggg32

<210>5

<211>33

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(33)

<400>5

cacttggagctcgttcctgttaatcctcaaatg33

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(20)

<400>6

agcacggcatcgtcaccaac20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(20)

<400>7

tggctggggtgttgaaggtc20

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>呼吸道合胞体病毒

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(21)

<400>8

gcaggattgtttatgaatgcc21

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<211>22

<212>dna

<213>呼吸道合胞体病毒

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(22)

<400>9

cttccacaacttgytccatttc22

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<212>dna

<213>呼吸道合胞体病毒

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(24)

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catgagcaaactcctcactgaact24

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<212>dna

<213>呼吸道合胞体病毒

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(25)

<400>11

tcttgggtgaatttagctcttcatt25

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<211>22

<212>dna

<213>呼吸道合胞体病毒

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(22)

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cacaacaatgccagtgctacaa22

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<212>dna

<213>呼吸道合胞体病毒

<220>

<221>引物_结合

<222>(1)..(26)

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ttagaccattaggttgagagcaatgt26