本申请要求2017年2月22日提交的标题为“IMPROVED REFINING OF MICROBIAL OILS”的美国临时专利申请序列号62/462,015的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
发明背景
含有长链多不饱和脂肪酸LC-PUFA的油可能很难纯化。这些油极易氧化，并且容易被产物氧化，从而使油有异味和臭味。典型的植物油精制用于纯化这些油。例如，通常将藻类生产的含二十二碳六烯酸(DHA)的粗制油脱胶以除去磷脂，然后精制以除去游离脂肪酸。然后将这些油漂白和除臭，从而产生最终被精制、漂白且除臭的油(RBD油)。但是由于这些加工条件的高温和持续时间，只能将氧化副产物除去到一定程度，因为它们也可以在这些过程中产生。此外，产生RBD油的加工步骤会除去有益组分，包括但不限于生育酚、甾醇和类胡萝卜素，包括β-胡萝卜素和角黄素。
具体实施方式
本文所述的各种实施方案的油组合物不是已反加有益组分(例如，类胡萝卜素)的传统RBD油。相反，本文所述的各种实施方案的油组合物来源于已轻度精制的含DHA的粗制油。结果是一种油组合物，该组合物含有i)大量有益组分，这些有益组分通常仅存在于含DHA的粗制油中，在RBD油中的量最少/可忽略不计，但ii)还含有量可忽略不计的不期望的引起气味的组分，这些组分通常存在于含DHA的粗制油中。有益组分包括但不限于类胡萝卜素，诸如叶黄素类(例如角黄素)和胡萝卜素类(例如β-胡萝卜素)。类胡萝卜素等有益组分要么在RBD油中被去除，要么在RBD过程中被破坏/降解。不期望的引起气味的组分包括但不限于醛类(例如反式-2-戊烯醛(t-2-P)、己醛)、酮(例如，2-甲基环戊酮(2-MCP))和硫化合物(例如，二甲基二硫醚，也称为DMDS)。
由于本文所用的新型加工，本文所述的各种实施方案的油组合物可以是高度着色的。因此，本文所述的各种实施方案的油组合物含有大量有益组分(包括类胡萝卜素)，这使得这些油具有颜色以及相对于RBD油更高的营养价值。并且由于本领域普通技术人员通常寻求几乎没有颜色或没有颜色的用于人体营养的RBD油，因此本文所述的各种实施方案的油组合物不是直观的产品。此外，本文所述的各种实施方案的油组合物可比没有外加抗氧化剂的RBD油更稳定，而无需添加过量的此类抗氧化剂。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但相信本文所述的各种实施方案的油组合物比可能需要增加量的外部抗氧化剂的RBD油更稳定，因为用作内置抗氧化剂的组分诸如类胡萝卜素已经被去除。
因此，本公开的一些实施方案涉及油组合物，其包含至少一种类胡萝卜素，所述类胡萝卜素的量按油组合物的重量计大于约50mg/kg；大于油组合物中存在的脂肪酸的总重量的约25％的DHA含量；和少于约80ppb的t-2-P、少于约30ppb的己醛、少于约100ppb的2-MCP或少于约1500ppb的DMDS。
如本文所用，术语“类胡萝卜素”通常是指由植物和藻类以及几种细菌和真菌产生的四萜类化合物。可通过所有这些生物由脂肪和其它基本的有机代谢构建块产生类胡萝卜素。类胡萝卜素是一个通用术语，用于指600多种已知的类胡萝卜素。类胡萝卜素可分为两类，叶黄素类和胡萝卜素类。类胡萝卜素的实例包括但不限于β-胡萝卜素、角黄素、虾青素、十氢番茄红素(7,8,11,12,15,7',8',11',12',15'-十氢-γ,γ-胡萝卜素)、六氢番茄红素(phytofluene)、六氢番茄红素(hexahydrolycopene)(15-顺式-7,8,11,12,7',8'-六氢-γ,γ-胡萝卜素)、类胡萝卜素(torulene)(3',4'-二脱氢-β,γ-胡萝卜素)、α-玉米胡萝卜素(7',8'-二氢-ε,γ-胡萝卜素)、异黄素、梳黄质、蛤黄质、cryptomonaxanthin((3R,3'R)-7,8,7',8'-四脱氢-β,β-胡萝卜素-3,3'-二醇)、甲壳黄素(β,-胡萝卜素-3,4,3',4'-四醇)、尬赞黄素((3R)-5'-顺式-β,γ-胡萝卜素-3-醇)、OH-氯杆菌素(OH-chlorobactene)(1',2'-二氢-f,γ-胡萝卜素-1'-醇)、绿藻黄素(β,ε-胡萝卜素-3,19,3'-三醇、叶黄素(lutein)((3R,3'R,6'R)-β,ε-胡萝卜素-3,3'-二醇)、番茄黄素(γ,γ-胡萝卜素-16-醇)、玫红品(1,2-二氢-γ,γ-胡萝卜素-1-醇)、玫红品醇(也称为warmingol/13-顺式-1,2-二氢-γ,γ-胡萝卜素-1,20-二醇)、腐菌黄素(3',4'-二脱氢-1',2'-二氢-β,γ-胡萝卜素-3,1'-二醇)和玉米黄质。
本文所述的各种实施方案的油组合物包含至少一种类胡萝卜素，其量大于约50mg/kg、大于约55mg/kg、大于约60mg/kg、大于约65mg/kg、大于约70mg/kg、大于约75mg/kg、大于约80mg/kg、大于约85mg/kg、大于约90mg/kg、大于约95mg/kg、大于约100mg/kg；约50mg/kg至约100mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约70mg/kg至约90mg/kg或约80mg/kg至约100mg/kg。应当理解，所述至少一种类胡萝卜素的量是存在于本文所述的各种实施方案的油组合物中的所有类胡萝卜素的总和。一些生物甚至可以生产具有远超过100mg/kg类胡萝卜素的油，并且也在本发明的范围内。
或者，类胡萝卜素含量可以表示为挥发性组分减少后残留在油中的总类胡萝卜素或单独类胡萝卜素的百分比。在一些实施方案中，在挥发性组分已经减少之后，大于50％、60％、70％、80％或90％的存在于粗制油中的总类胡萝卜素或单独类胡萝卜素被保留。
在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种类胡萝卜素。在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物包含至少β-胡萝卜素和角黄素。在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物包含至少β-胡萝卜素和角黄素，其量为约50mg/kg至约60mg/kgβ-胡萝卜素和约20mg/kg至约30mg/kg角黄素。
本文所述的各种实施方案的油组合物还具有油组合物中存在的脂肪酸总重量的大于约25％、大于约30％、大于约35％、大于约40％、大于约45％、大于约50％、大于约55％；约30％至约50％或约25％至约60％或25％至约70％或约40％至约50％的二十二碳六烯酸(DHA)含量。在一些实施方案中，DHA基本上为甘油三酯的形式。油的DHA含量可以通过本领域熟知的方法容易地确定。例如，本文使用AOCS方法Ce-2b-11和Ce1i-07和Ce-1b-89。
本文所述的各种实施方案的油组合物可具有相对低含量的引起气味的组分，诸如反式-2-戊烯醛(t-2-P)、庚醛、DMDS和2-甲基环戊酮(2-MCP)。
例如，本文所述的各种实施方案的油组合物可具有少于约100ppb、少于约90ppb、少于约80ppb、少于约70ppb、少于约60ppb、少于约50ppb、少于约40ppb、少于约30ppb、少于约20ppb、少于约10ppb、少于约5ppb、少于约2.5ppb的t-2-P含量；约2.5ppb至约20ppb；或约2.5ppb至约10ppb的t-2-P。各种实施方案还可具有低于检测限或低于本文所用方法的定量限的水平。
本文所述的各种实施方案的油组合物可具有少于约30ppb、少于约50ppb、少于约40ppb、少于约30ppb、少于约20ppb、少于约10ppb、少于约5ppb、少于约2.5ppb的己醛含量；约2.5ppb至约20ppb；或约2.5ppb至约10ppb的己醛。各种实施方案还可具有低于检测限或低于本文所用方法的定量限的水平。
本文所述的各种实施方案的油组合物可具有少于约2000ppb、少于1500ppb、少于1000ppb、少于约500ppb、少于约400、少于约200ppb、少于约100ppb、少于约90ppb、少于约80ppb、少于约70ppb、少于约60ppb、少于约50ppb、少于约40ppb、少于约30ppb、少于约20ppb、少于约10ppb、少于约5ppb、少于约2.5ppb的DMDS含量；约2.5ppb至约20ppb；或约2.5ppb至约10ppb的DMDS。各种实施方案还可具有低于检测限或低于本文所用方法的定量限的水平。
在一些实施方案中、本文所述的各种实施方案的油组合物可具有少于约2000ppb、少于1500ppb、少于1000ppb、少于约500ppb、少于约400、少于约200ppb、少于约100ppb、少于约90ppb、少于约80ppb、少于约70ppb、少于约60ppb、少于约50ppb、少于约40ppb、少于约30ppb、少于约20ppb、少于约10ppb、少于约5ppb、少于约2.5ppb的2-MCP含量；约2.5ppb至约20ppb；或约2.5ppb至约10ppb的2-MCP。各种实施方案还可具有低于检测限或低于本文所用方法的定量限的水平。
本文所述的各种实施方案的油组合物可具有少于约1重量％、少于约0.5重量％、少于约0.2重量％、少于约0.1重量％；约0.01重量％至约0.5重量％；约0.01重量％至约0.2重量％；或约0.01重量％至约0.03重量％的总挥发物含量。本文中所用的“总挥发物”是指以下各项重量百分比的总和：己醛、t-2-P、DMDS和2-MCP。
在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物可具有本文所述的DHA、类胡萝卜素含量、t-2-P含量、己醛含量、DMDS含量和2-MCP含量中的一个或多个或全部值的组合。因此，在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物可具有约0.01重量％至约0.5重量％的总挥发物含量；约25％至约60％的DHA含量；约70mg/kg至约90mg/kg的存在于本文所述的各种实施方案的油组合物中的所有类胡萝卜素的总和；少于约2.5ppb的t-2-P含量；少于约2.5ppb的己醛含量；少于约2.5ppb的DMDS含量；或少于约2.5ppb至约3ppb的2-MCP含量。
在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物可具有本文所述的DHA、类胡萝卜素含量、t-2-P含量、己醛含量、DMDS含量和2-MCP含量中的一个或多个或全部值的组合。因此，在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物可具有约25％至约50％的DHA含量；大于约50mg/kg的存在于本文所述的各种实施方案的油组合物中的所有类胡萝卜素的总和；少于约2.5ppb的t-2-P含量；少于约2.5ppb的己醛含量；少于约2.5ppb的DMDS含量；或少于约2.5ppb的2-MCP含量。
在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物可具有本文所述的DHA、类胡萝卜素含量、t-2-P含量、己醛含量、DMDS含量和2-MCP含量中的一个或多个或全部值的组合。因此，在一些实施方案中，本文所述的各种实施方案的油组合物可具有约25％至约60％的DHA含量；大于约50mg/kg的存在于油组合物中的所有类胡萝卜素的总和；低于检测或定量限的t-2-P含量；低于检测或定量限的己醛含量；低于检测或定量限的DMDS含量；或低于检测或定量限的2-MCP含量。
本文所述的各种实施方案的油组合物来源于从生物质中分离的油，并且可使用本领域已知的方法生产。这些方法包括从包含海洋微生物的生物质中分离油。合适的海洋微生物的实例包括但不限于藻类、细菌、真菌和原生生物中的至少一种。可用于产生和分离本文所述的各种实施方案的油组合物的海洋微生物的一些具体实例包括微藻类和绿藻门藻类(chromophytic algae)，如公开的PCT申请号WO94/28913中所述，所述文献通过引用结合于此，如同在此被完整阐述一样。也可参见公布的PCT申请号WO94/008467；美国专利号5,908,622；美国专利号5,688,500；美国专利号5,518,918；美国专利号5,340,742；美国专利号5,340,594；美国专利号8,163,515；美国专利号9,023,616；公布的欧洲申请号512997和669809，所有这些文献都通过引用结合于此，如同在此被完整阐述一样。
任何已知产生含DHA的油的生物都可用于本文所述的油的发酵，包括但不限于真核生物，诸如球等鞭金藻(Isochrysis gaibana)和破囊壶菌门(thraustochytrids)(例如，裂殖壶菌属的海洋微生物)诸如裂殖壶菌属和破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)。参见，例如，Structured and Modified Lipids 376(Frank D.Gunstone编辑，Marcel Dekker Inc.2001)，其通过引用结合于此，如同在此被完整阐述一样。技术人员将理解，自20世纪80年代末以来，已经在文献中广泛描述了通过发酵从海洋生物中产生DHA。许多产生生物和方法是众所周知的。有用生物的具体实例包括但不限于以下破囊壶菌属ATCC26185，和裂殖壶菌属ATCC 20888。
在发酵完成后，可以将收获的细胞干燥至合适的水分含量(例如，约4％的水分含量)。然后，可以将合适的非极性溶剂(例如，戊烷、己烷等)添加到合适容器(例如，玻璃釜)中的干燥生物质中，并搅拌合适的时间和温度(例如25℃下2小时)。在过滤生物质之后，可以通过任何合适的方法(例如，旋转蒸发器)除去滤液中的溶剂，以产生含DHA的粗制油。或者，可以通过本领域熟知的无溶剂方法分离粗制油。参见，例如US 9,745,538或US 9,745,539；这两篇文献都通过引用结合于此。
本领域技术人员充分理解，粗制油中DHA、类胡萝卜素的水平以及各种挥发性化合物和杂质的水平将是发酵、分离和精制中使用的特定生产参数的一个因子。因此，这些不同组分的起始值将因粗制油批次不同而不同。
本文所述的各种实施方案的油组合物来源于分离自生物质的油，诸如含DHA的粗制油。然后将含DHA的粗制油轻度精制，以获得本文所述的各种实施方案的油组合物。本文所述的各种实施方案的油组合物不是已反加有益组分(例如，类胡萝卜素)的传统RBD油。相反，本文所述的各种实施方案的油组合物来源于已轻度精制的含DHA的粗制油。
如本文所用，术语“轻度精制”通常是指含DHA的粗制油没有精制到可以获得RBD油的程度。相反，含DHA的粗制油仅被精制到获得一种油组合物所必需的程度，该油组合物；i)保留了大量有益组分，这些有益组分通常只存在于含DHA的粗制油中，在RBD油中量最少/可忽略不计，以及ii)通常存在于含DHA的粗制油中的不期望的引起气味或异味的组分基本上被除去。
预处理
分离自天然来源的粗制油有时含有主要由磷脂组成的“树胶”，还含有游离脂肪酸、甾醇、甾醇酯、微量金属、微量碳水化合物和蛋白质，以及固体颗粒。在某些情况下，油还含有抗氧化剂，诸如生育酚和类胡萝卜素。从油中除去磷脂可防止在精制过程中进一步形成胶质沉积物，并防止在储存期间产生异味和颜色。或者，粗制油可能含有聚集在一起的小颗粒，并在以后的加工中产生问题。虽然对于本文所述的目的是任选的，但是可以使用诸如脱胶或过滤的预处理步骤来避免进一步加工中的问题。
水脱胶通常用于从油中除去磷脂和其它水溶性组分。一般方法包括在60-90℃下在搅拌下用250-2000ppm的磷酸或柠檬酸处理粗制油(例如，含DHA的粗制油)。然后在60-75℃下在搅拌下将水(例如1-5％)添加到酸处理的粗制油中，以帮助粗制油中磷脂的水合。然后将油再轻轻混合15-60分钟。形成由水合磷脂和其它水溶性化合物的乳液组成的水相以及一些夹带的油。通过沉降和倾析或通过离心将两相彼此分离，产生酸脱胶油流和湿树胶流。用碱水溶液进行的中和步骤可用于除去残留的酸，以及用去离子水进行的一个或多个萃取步骤用于除去油中的可溶性盐。
在一些实施方案中，在使用合适的酸水溶液(诸如磷酸或柠檬酸)进行轻度除臭之前，任选将含DHA的粗制油进行脱胶。在其它实施方案中，在轻度除臭之前，首先用水洗涤含DHA的粗制油。然而，本文所述的各种实施方案的油在传统条件下决不会漂白以加工植物油。
另外，可以在轻度除臭之前任选地将粗制油过滤以除去颗粒物质。通过常规方法过滤是众所周知的。它可以以分批方式进行，也可以作为集成过程的一部分连续进行。过滤助剂(包括但不限于纤维素、硅藻土、市售粘土或硅胶)或其它加工助剂可用于除去不需要的颗粒或溶解的物质。这些助剂还可以用于增加过滤的简易性和有效性。过滤可以在升高的温度下进行，并且油可以与助滤剂接触一段延长的时间，以帮助颗粒吸附或粘附到助滤剂上。
除臭
简而言之，轻度除臭除去了导致“异味和臭味”的挥发性化合物，但该过程也可以除去游离脂肪酸和一些生育酚和甾醇。该过程通常在真空下进行，以帮助除去特定的挥发性化合物，并保护油不被氧化。蒸汽、氮气或其它惰性气体可用作剥离剂。
该过程完全由温度、时间和压力限定。当以商业规模进行时，它可以包括多步骤过程，包括脱气、多级加热、除臭-脱酸和油的多级冷却。如果进行脱气，则可以在连接到真空系统(例如，30-50mm Hg)的单独容器中完成，或者在除臭器中甚至更低的压力下完成。喷射蒸汽(或任何其它惰性气体)可用于改善脱气。
该过程可以分批、在半连续系统或连续系统中进行。剥离效率在连续系统中可能更好，该系统通常具有填充有规整填料的柱，该规整填料提供高表面积。油与剥离剂在规整填料上的逆流接触可以在短的接触时间内提供有效的剥离。可以使用各种配置的装置(水平或垂直容器、盘式柱、填充柱或薄膜/刮膜蒸发器/蒸馏器)。
本文所述的各种实施方案的油组合物通过在轻度除臭过程下处理含DHA的粗制油获得，所述过程利用如本文所述的合适装置。
本发明的另一方面是填充柱用于纯化含PUFA的油的用途。该类型的除臭柱在本领域中是已知的并且用于植物油的物理精制。
一种生产纯化PUFA油的方法，包括使PUFA粗制油通过填充柱：其中将柱加热至140与200℃之间，并以与PUFA粗制油流逆流的方式将蒸汽通入柱中，并且从柱中收集纯化油。
油组合物
最后，本文所述的各种实施方案的油组合物来源于通过本文所述的轻度精制方法从生物质中分离的油，具有本文所述的总挥发物含量、DHA、类胡萝卜素含量、t-2-P含量、己醛含量、DMDS含量和2-MCP含量中的一个或多个或全部值的组合。因此，在一些实施方案中，从生物质中分离的轻度精制的油可具有约0.01重量％至约0.5重量％的总挥发物含量；约25％至约60％的DHA含量；在从生物质中分离的轻度精制的油中大于约70mg/kg的总类胡萝卜素含量；约0.5ppb至约3ppb的t-2-P含量；约0.5ppb至约3ppb的己醛含量；约0.5ppb至约3ppb的庚醛含量；约0.5ppb至约3ppb的DMDS含量；以及约0.5ppb至约3ppb的2-MCP含量。
如本文所述，已知的用于人体营养的含DHA的油已使用典型的植物油技术充分精制以产生高度纯化的RBD油。精制除去挥发性化合物、金属和色素。但该过程不仅除去对人体营养有益的组分，诸如类胡萝卜素，还需要高水平的抗氧化剂来保护油。本文所述的各种实施方案的油组合物来源于通过本文所述的轻度精制方法从生物质中分离的油，具有低含量的引起气味的化合物，并且同时保留有益组分诸如类胡萝卜素。类胡萝卜素的存在导致更加营养或稳定的产品，而不需要使用同样多的额外抗氧化剂-即使抗氧化剂(例如，γ-生育酚(维生素E)、生育三烯酚、抗坏血酸(维生素C)、视黄醇(维生素A)、叔丁基氢醌(TBHQ)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT))可以添加到本文所述的各种实施方案的油组合物中。
本文所述的组合物可用于食品、膳食补充剂和饲料应用。本发明的另一个实施方案是包含本文所述的油的食品。食物可以是给婴儿或成人的，并以本领域技术人员已知的任何方式递送。或者，本文所述的组合物可以配制成液体、粉末或胶囊形式的膳食补充剂来食用。
以范围格式表示的值应该以灵活的方式解释为不仅包括作为范围界限明确列举的数值，而且包括该范围内包含的所有个别数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确列举一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅包括约0.1％至约5％，而且还包括在所示范围内的个别值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另外说明，否则“约X至Y”的陈述具有与“约X至约Y”相同的含义。同样，除非另外说明，否则“约X、Y或约Z”的陈述具有与“约X、约Y或约Z”相同的含义。
在本文件中，术语“一个/种(a/an)”或“所述/该”用于包括一个或多个，除非上下文另有明确规定。除非另外说明，否则术语“或”用于表示非排他性的“或”。另外，应理解，本文采用的措辞或术语(未另外定义)仅用于描述的目的而非限制。章节标题的任何使用旨在帮助阅读文件，而不应被解释为限制。此外，与章节标题相关的信息可以出现在该特定章节之内或之外。此外，本文中提及的所有出版物、专利和专利文献均通过引用整体并入本文，如同通过引用单独并入一样。如果本文件和通过引用并入的文件之间的用法不一致，则并入的参考文件中的用法应被认为是对本文件用法的补充；对于不可调和的不一致，以本文件中的用法为准。
在本文所述的方法中，除了明确地陈述时间或操作顺序之外，可以以任何顺序执行这些步骤而不脱离本发明的原理。此外，指定的步骤可以同时执行，除非明确的权利要求语言说明它们是分开执行的。例如，要求保护的X步骤和要求保护的Y步骤可以在单个操作中同时进行，并且所得到的方法将落入要求保护的方法的字面范围内。
如本文所用的术语“约”可以允许值或范围的变化程度，例如，在规定值或范围的规定界限的10％内、5％内或1％内。另外，本文提到的所有范围在没有量词“约”的情况下可以替代地被读取。因此，如果范围被陈述为“从约X到约Y”，则发明人特别考虑“从X到Y”的确切范围。
如本文所用的术语“基本上”是指大部分或居多，如至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或至少约99.999％或更高。
实施例
通过参考以举例方式提供的以下实施例可以更好地理解本发明。本发明不限于本文给出的实施例。
如上所述，用于生产和加工来自微藻类和绿藻门藻类的DHA油的方法在本领域中已众所周知超过30年了。或者，含DHA的粗藻油可以购自Cargill Incorporated。其它的粗藻油商业供应商也是本领域技术人员已知的。
实施例1：
材料
用柠檬酸进行的含DHA的粗制油的精制
将装有四端口帽盔的1L夹套烧瓶配备直接驱动顶置式搅拌器和设定在60℃的加热循环浴。在实验期间将容器保持在氮气下。向烧瓶中装入750mL粗藻油。打开机械搅拌器并设定至100RPM。将油在60℃下平衡30分钟。在脱气的去离子水中制备500ppm柠檬酸溶液。将37.5mL(相对于藻油的量为5％)的500ppm柠檬酸溶液添加到容器中。将该材料在60℃下搅拌30分钟。关闭搅拌器，使水层与藻油分离。15分钟后，除去水层，并将37.5mL脱气的去离子水添加到反应烧瓶中。将该材料在60℃下搅拌10分钟。关闭搅拌器，使水层与藻油分离。除去水层，并向反应烧瓶中再添加37.5mL脱气的去离子水。将该材料在60℃下搅拌10分钟。关闭搅拌器，使水层与藻油分离并将之除去。在氮气下将藻油转移至250mL离心瓶中。将油在30℃和3000RPM下离心10分钟，并与剩余的水层分离。将油转移到玻璃储存容器中，顶部空间用氮气冲洗，并储存在-9℃的冰箱中。
无需柠檬酸的含DHA的粗制油的精制
将装有四端口帽盔的1L夹套烧瓶配备直接驱动顶置式搅拌器和设定在60℃的加热循环浴。在精制步骤期间将容器保持在氮气下。向烧瓶中装入750mL粗藻油。打开机械搅拌器并设定至100rpm。将油在60℃下平衡30分钟，并将37.5mL脱气的去离子水添加到反应烧瓶中。将该材料在60℃下搅拌10分钟。关闭搅拌器，使水层与藻油分离。除去水层。将藻油除去并在氮气下置于250mL离心瓶中。将油在30℃和3000RPM下离心10分钟，并与剩余的水层分离。将油转移到玻璃储存容器中，顶部空间用氮气冲洗，并储存在-9℃的冰箱中。
除臭
Pope Scientific Inc.2”刮膜蒸发器(部件号40450-01)配有(i)变速驱动机构(润湿部件316不锈钢)、玻璃内部冷凝器、2000mL玻璃刻度进料装置和带塞子的脱气器；(ii)可旋转的多接收器烧瓶(包括四个200mL接收器烧瓶)；(iii)500mL馏出液接收瓶、玻璃冷阱、316不锈钢擦拭器固定器和碳擦拭器刮片；(iv)带有高温“J”热电偶组件和保持所需温度的绝缘护套的金属带式加热器装置(部件号40782-G1)；(v)硅橡胶加热器和热电偶(部件号40645)以及用于维持进料温度的绝缘护套(部件号40669)；(vi)用于在实验过程中提供真空的爱德华式机械旋转真空泵/油扩散泵系统；(vii)量程为0.001托至1000托的皮拉尼型压力计；(viii)用于持续监控变速驱动器的数字RPM指示器；(ix)用于保持内部冷凝器温度的Cole-Palmer冷却器。
向进料和脱气器组件中装入精制的含DHA的粗制油(用或不用柠檬酸进行精制)。在运行期间将整个系统保持在氮气下。将进料组件保持在45℃。使用纯氮气对进料脱气1小时。通过冷却器将刮膜蒸发器的内部冷凝器保持在2℃，用于所有除臭操作。将蒸发器的变速驱动机构设定为400RPM的恒定速度。在整个实验过程中，除臭器的进料速率为175mL/hr。改变除臭温度和压力以评估除臭条件，同时保持类胡萝卜素含量。在整个运行期间，在所需的条件下获得样品。将样品转移到储存容器中，顶部空间用氮气冲洗，并冷冻储存直至进行分析。
精制和除臭的过程条件示于表1中：
表1
轻度精制的含DHA的油(样品1A-1F)具有在表2中示出的性质。在t-2-P含量、己醛含量、DMDS含量和2-MCP含量方面，轻度精制的含DHA的油(样品1A-1F)具有在表3中示出的特征。
表2
*根据英国标准684-2.20:1977测量的总类胡萝卜素含量
**β-胡萝卜素和角黄素分别根据规定的方法EN 12823-2:2000和Roche Index no2264由外部实验室Eurofins测量。
表3
t-2-P是反式-2-戊烯醛；DMDS是二甲基二硫醚；
2-MCP是2-甲基环戊酮
实施例2：
精制容器-精制容器用于使用各种加工助剂对粗制油进行预处理。测试了粘土、二氧化硅和纤维素的不同组合。连接到顶部的混合器允许内容物的混合/搅拌。供应商：HAB Heiland Apparatebau(德国)。形状：垂直圆柱形，圆锥形底部，带有观察孔。体积：40L(内部)，带5.68L(护套)。构造材料：不锈钢。配有加热套、变速搅拌器(螺旋桨式，2翼)、挡板、用于从过滤回路返回油的喷嘴。
烛式过滤器-带有复丝布的烛式过滤器用于对来自精制容器的油进行过滤。在布上堆积滤饼，当过滤器下游的油清澈时(从观察孔视觉观察)，开始向分批除臭器的转移操作。供应商：Amafilter group Lochem B.V.(荷兰)-Filtration Group。形状：垂直圆柱形。体积：8L。过滤面积：0.05m2。构造材料：不锈钢和氟橡胶(垫圈)；聚乙烯(滤布)。
增泽过滤器-当将油从精制容器转移到分批除臭器时，增泽过滤器位于烛式过滤器的下游。该过滤器可除去烛式过滤器未截留的任何颗粒。供应商：Amafilter group Lochem B.V.(荷兰)-Filtration Group。颗粒截留：1微米。过滤面积：0.09m2。构造材料：不锈钢和氟橡胶垫圈。袋式过滤器(来自EATON(比利时)的聚丙烯针刺毛毡)
分批除臭器-用于进行分批除臭操作的容器。通常在施加～2毫巴-a的减压时，可以通过油连续喷射蒸汽(或氮气)。供应商：HAB Heiland Apparatebau(德国)。形状：垂直圆柱形，平底。体积：31L(内部)；5.5L(护套)。构造材料：不锈钢。配有加热套、喷射蒸汽环和观察孔。
填充柱除臭器-填充柱除臭器由规整填充床组成，其可以适应不同类型的填料和高度。Raschig Superpack RSP 250X用作填充材料。油在直列式电加热器中加热并喷射到柱顶的填料床上，以确保良好的油分布和与剥离剂的紧密接触。剥离蒸汽(或氮气)从柱的底部引入，与油的流动逆流。由Cargill设计，由VGM(荷兰)制造。形状：垂直圆柱形。规整填料：Raschig Superpack RSP 250X；直径：255mm；最大高度：708mm。容量(油过程)：15-25kg/h。构造材料：不锈钢。在配油喷嘴附近的观察孔。具有冷却夹套的出口容器位于填充柱除臭器的底部。
最终产品增泽过滤器-第二个增泽过滤器位于整个过程的下游，其在收集样品进行分析之前、在分批除臭器之后或填充柱除臭器之后使用。供应商：Amafilter group Lochem B.V.(荷兰)-Filtration Group。颗粒截留：1微米。过滤面积：0.09m2。构造材料：不锈钢和氟橡胶垫圈。袋式过滤器(来自EATON(比利时)的聚丙烯针刺毛毡)
加工助剂：硅胶-JKC-5和JKC-7(FIT，荷兰)；漂白粘土-Tonsil772FF(Clariant Iberia，西班牙)；纤维素-Filtracel Active 112(JRS，德国)。
从Cargill Incorporated获得一桶粗藻油(190kg)，其已在-20℃下冷冻储存。使用粗制油桶周围的热毯将油熔化。为了在转移粗制油用于实验时尽量减少与空气的接触，将顶部空间抽空并连续地通过油喷射氮气，并且在桶中保持氮气的正压力。
使用预先用氮气冲洗的含有塑料内盖的铝瓶收集样品。在用氮气冲洗瓶子的同时收集样品，同时保持顶部空间最小，并在-30℃下储存。
实施例2A
将粗制油(43Kg)从桶转移到精制容器中并加热至80℃。在氮气下将约0.5L加热的粗藻油从精制容器移入1L烧瓶中，并将1.0重量％二氧化硅(JKC-5)和0.03重量％纤维素(Filtracel Active 112)(均相对于初始粗制油质量)添加到烧瓶中。将氮气鼓泡通过烧瓶中的油，以尽量减少空气与油的接触。将脱矿质水(相对于初始油质量为0.4重量％)添加到烧瓶中的浆料中。然后在氮气下将浆料倒入精制容器中。将精制容器中的内容物在大气压下以270rpm搅拌20分钟，然后在<2毫巴-a下搅拌5分钟。
含有二氧化硅和纤维素的油通过过滤回路(经由烛式过滤器)循环，直至通过观察孔观察到它是清澈的。然后，也将其通过增泽过滤器并转移到储存容器中，该储存容器用作填充柱除臭器的进料罐。在轻微氮气压力下将储存容器中的油保持在40℃。
将来自储存容器的过滤油以20kg/h的流速进料至填充柱除臭器。柱入口喷嘴上游的直列式电加热器将油加热至190℃的温度。将柱中的真空保持恒定在～2.0毫巴-a。以逆流模式使用剥离蒸汽(相对于油流速为2.0重量％)，以促进挥发性化合物的去除。仅在达到稳态时收集用于分析的油样，如通过恒定流速和温度所观察到的。将除臭的油收集在冷却至～50℃的收集容器中，并通过增泽过滤器取样。收集的样品是2A。
实施例2B
将粗藻油(30Kg)从桶转移到精制容器中。然后将粗制油加热至80℃。将大约2L的热粗藻油倒入用氮气冲洗的5L塑料桶中。在保持氮气氛的同时，将0.5重量％粘土(Tonsil 772FF)和0.03重量％纤维素(Filtracel Active 112)(均相对于初始粗制油量)添加到塑料桶中的油中，同时搅拌。然后在氮气下将浆料转移到精制容器中。将水(相对于初始粗制油质量为0.5重量％)添加到浆料中。将精制容器中的混合物在大气压下以270rpm搅拌5分钟，然后在150毫巴-a下搅拌15分钟，并且在<2毫巴-a下再搅拌5分钟。由于难以过滤粘土，因此将更多的纤维素(相对于初始粗制油质量为2重量％)添加到精制容器中，以使烛式过滤器中的过滤速率更快。然后使油通过烛式过滤器，直至通过观察孔观察时它是清澈的，然后当被送到分批除臭器时，使其通过增泽过滤器。
然后在分批除臭器中将粘土处理过的油加热至150℃的除臭温度，并将压力降至2.4-2.9毫巴-a之间。一旦油达到100℃，就供应喷射蒸汽(相对于除臭器中油的质量为每小时2.0重量％)。3小时后关闭加热，将油冷却至60℃，然后通过最后的增泽过滤器收集用于分析的样品。收集的样品是2B。
实施例2C
将粗藻油(40Kg)从桶转移到精制容器中并加热至80℃。如前所述，使用2L热粗藻油和2.0重量％纤维素(Filtracel Active 112)(相对于初始粗制油质量)在5L塑料桶中制备油/纤维素浆料。通过塑料桶中的油喷射氮气以尽量减少与空气的接触。在将该浆料转移到精制容器后，将精制容器中的混合物以270rpm搅拌5分钟，然后在开始过滤之前降至30-60rpm。将纤维素处理过的油通过烛式过滤器过滤，直至从观察孔视觉上观察为清澈的，然后当被转移到分批除臭器时，使其通过增泽过滤器。
在3.2-3.5毫巴-a的减压下，在分批除臭器中将纤维素处理过的油加热至150℃。当油达到100℃时开始喷射蒸汽。使用每小时1.0重量％的喷射蒸汽量(相对于除臭器中的油质量)。1小时后，将油冷却至100℃，然后进料至填充柱除臭器中，同时在分批除臭器中保持～1.1巴-a的氮气过压。将来自分批除臭器的油以20kg/hr的速率进料至填充柱除臭器中。填充柱除臭器在～2.0毫巴-a的减压下操作。使用柱入口喷嘴上游的直列式加热器将进入填充柱除臭器的油加热至190℃。剥离蒸汽(相对于油流速为2.0重量％)以与油的流动逆流的方式供应。当该过程达到稳态时，由稳定的流速和温度指示，将离开填充柱除臭器的油冷却至<60℃并收集。然后将柱入口喷嘴的温度设置改为200℃，并且一旦过程达到新的稳态，再次收集样品。收集的样品标记为2C(i)(190℃)和2C(ii)(200℃)。
实施例2D
将粗藻油(40kg)从桶转移到精制容器中。将油加热至120℃。在氮气氛下将两升热油转移到5L塑料桶中，并向塑料桶中添加0.5重量％二氧化硅(JKC-7)和1.0重量％纤维素(Filtracel Active 112)(均相对于初始粗制油质量)，同时通过油喷射氮气。旋转内容物直至混合物变得均匀。然后在氮气下将浆料倒入精制容器中。将精制容器中的内容物在大气压下以270rpm搅拌30分钟，然后在<2毫巴-a下搅拌5分钟。
在进行烛式过滤器中的过滤之前，在精制容器中将温度降至100℃。过滤完成后，将油通过增泽过滤器转移到分批除臭器中。将分批除臭器中的过滤油在减压(～3.3毫巴-a)下保持在100℃持续30分钟，在此期间提供喷射蒸汽(基于除臭器中的油质量为1.5重量％每小时)。
然后将来自分批除臭器的油送至填充柱除臭器。柱入口喷嘴上游的直列式加热器将进入柱的油加热至190℃。油以15kg/hr的流速供应。在填充柱除臭器中保持～2.0毫巴-a的减压。与油的流动逆流提供剥离蒸汽(相对于油流速为2.0重量％)。一旦达到稳态，如通过恒定流速和温度所指示，通过最后的增泽过滤器收集用于分析的样品。将冷却水供应到连接至填充柱除臭器底部的收集容器中，因此可以在<60℃下进行取样。然后将柱入口喷嘴上游的温度设定至200℃，并在系统达到新的稳态后再次收集样品。收集的样品是3D(i)(190℃)和3D(ii)(200℃)。
表4
表4中使用的“ND”表示未检测到指定化合物的存在，并且检测限为2.5ppb。因此ND也可以解释为<2.5ppb。表4中使用的“<LOQ”是指在定量限以上未检测到指定化合物的存在。LOQ为2.5ppb；所以<LOQ也可以解释为<2.5ppb。所有样品的DHA含量介于42.5％和44.5％之间。
从表4可清楚地看出，上述过程的轻度除臭对杂质水平具有显著影响，将其降至低于检测限(ND)或定量限(LOQ)。然而，与此同时，基本保持了类胡萝卜素的水平，保留率为68.2％至86.9％，允许油保持它们的有色外观。相比之下，粗制油含有表3和表4中描述的高含量挥发性化合物，并且常规精制、漂白和除臭的油(RBD)含有非常少或没有保留的类胡萝卜素。
挥发物分析
藻油的动态顶空取样。
将轻度精制的含DHA的油的样品装载到自动取样器托盘上。将装有Tenax(Gerstel，P/N 013741-005-00)的热解吸管装入自动取样器上的Gerstel热解吸装置(TDU)管盘中。Gerstel多功能取样器(MPS)将样品瓶转移至动态顶空(DHS)培养箱，在75℃下平衡10分钟。在该平衡期间，以1000RPM摇动样品。平衡后，将TDU管装入DHS萃取器中，用氦气以75mL/分钟的流速吹扫样品，使1升的总气体流流经样品并通过TDU捕集器(13.33分钟)。萃取温度为75℃，并且在萃取期间将捕集器保持在35℃。萃取后，将TDU管转移至TDU进行解吸，并将挥发物捕集在低温冷却的入口中。在不分流传输模式下，TDU温度程序在120℃/分钟下为35℃(0.5分钟)至300℃(5分钟)。入口温度程序在12℃/s下为-120℃(0.2分钟)至270℃(5分钟)。入口保持在溶剂排放模式设置，氦柱流速设为1.5mL/分钟(恒定流速)。入口吹扫时间为1秒，吹扫流速为30mL/分钟。溶剂排放时间设为30秒，溶剂排放流速设置为75mL/分钟，溶剂排放压力设置为12.9psi。将萃取的挥发物分离，并在4D二维气相色谱-飞行时间质谱仪(2DGC-TOFMS)上进行分析。第一维中使用30m DBTM-624(0.25mm x 1.4μm)柱(Agilent Technologies,P/N122-1334)，并且第二维中使用1.5m BPXTM90(0.25mm x 0.25μm)柱(SGE Analytical Science,P/N054570)。第一维柱的温度程序为40℃(2分钟)至120℃(在5℃/分钟下)至250℃(3分钟)(在10℃/分钟下)。第二维温度程序与第一维程序相同，有5度偏移。该方法不使用调制器，因此在1D模式下运行系统。传输线温度为250℃。质谱仪以50次扫描/秒的速度扫描,质量范围为25-550amu。检测器电压设为偏离调谐电压200V，源温度为225℃。
来自藻油的挥发物的定量。
使用精制、漂白和除臭(RBD)的藻油制作校准曲线。反式-2-戊烯醛、己醛、二甲基二硫醚和2-甲基环戊酮的高纯度标准品购自Sigma。RBD油中每种标准品的浓度低于2.5ppb的定量限。通过向一个含有6.5克RBD油的20mL小瓶中添加大约15mg每种标准品来制备储备校准油，该小瓶被加盖并混合以产生每种标准品约百万分之2500的储备液。将储备油连续稀释以形成0ppb至～400ppb的校准曲线。将每种标准品的两克称量到小瓶中，并根据分析方法萃取和分析。通过绘制每种化合物的注入量(x轴)与每种化合物峰下面积(y轴)的关系，生成校准曲线。通过使用回归线方程并求解x(注入量)来确定样品中监测的每种化合物的量(以μg计)。浓度(以ppb计)通过将注入的化合物量乘以样品质量并乘以1000来确定。具有非常低水平的样品可以以两种方式之一解释。在非常低的浓度下，校准曲线的线性度不足以量化样品数据。因此，将定量限确定为2.5ppb。水平低于该定量限(LOQ)的样品只能报告为<2.5ppb或<LOQ。或者，可以分析样品，且没有检测到信号，认为样品低于检测水平(LOD)。这也将低于定量水平，但可报告为<2.5ppb或未检测到(ND)。监测的挥发物是：反式-2-戊烯醛(t-2-P)；己醛；二甲基二硫醚(DMDS)；2-甲基环戊酮(2-MCP)。
UV-Vis法测量油中的类胡萝卜素浓度
本文遵循的测量总类胡萝卜素的方法是英国标准684-2.20:1977(脂肪和脂肪油的分析方法-第2部分：其它方法-第2.20节：植物油中胡萝卜素的测定)，这是一种测量植物油中胡萝卜素的吸光度法。
在该研究中使用的分光光度计是Genesys 10S UV-Vis分光仪型号(Thermo Scientific)。该仪器使用1cm光程长度的比色皿。ACS级己烷(Fisher)用作溶剂。在445nm处测量吸光度。将待测油稀释在己烷中。使用容量瓶用己烷将大约0.5-1.0g油稀释成25ml溶液。浓度记录为c(g油/100mL溶液)。根据油中类胡萝卜素的浓度，调节油在己烷中的稀释度，使得在445nm处测量的吸光度落在0.1和1个吸光度单位之间。测量类胡萝卜素浓度的公式是：
浓度(ppm)＝(383*E)/(L*c)
其中E是在445nm处测量的吸光度(校正空白后)；L是比色皿的光程长度(cm)；并且c是油的浓度(g油/100mL溶液)。
因此，作为实例，将0.4793g轻度精制的含DHA的油的样品添加到25mL容量瓶中。用己烷将烧瓶填充至25mL标记。盖上烧瓶并混合样品以确保溶液均匀。用稀释溶液填充1cm光程的比色皿。己烷填充单独的1cm光程比色皿，并用于在445nm处空白校正UV-Vis光谱仪。测量油样并记录0.525单位的吸光度。己烷中油的浓度c为(0.4793g/25ml)*4＝1.917g/100ml。则胡萝卜素浓度为：(383*0.525)/(1*1.917)＝油中104.9ppm的类胡萝卜素。
表2中报告的个别类胡萝卜素由外部测试实验室Eurofins利用其内部商业方法进行测量。