用于偶联的半胱氨酸突变抗体的制作方法
本申请要求2017年2月28日提交的美国临时申请us62/465,129和2017年9月20日提交的美国临时申请us62/561,151的权益，这两个美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
对序列表的引用
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背景技术：
抗体的重链恒定区经历多种不同的突变以实现各种不同的作用。这些作用包括提高或降低效应子功能，提高或降低稳定性或半衰期，提高或降低翻译后修饰以及为提供偶联位点。s239c已被描述为偶联位点，但是其自身仅允许在两个重链和两个轻链的抗体中装载两个药物分子。不同的偶联位点的适用性可能会发生改变，这取决于对偶联试剂的可接近性，抗体的表达和糖基化模式以及储存稳定性，抗体药物偶联物的细胞毒性和体内半衰期。
技术实现要素：
本发明提供一种包含重链恒定区的抗体或融合蛋白，在所述重链恒定区中，eu编号的位置295被半胱氨酸占据。任选地，所述抗体或融合蛋白通过位置295处的半胱氨酸与药物或标签偶联。任选地，eu编号的位置239被半胱氨酸占据。任选地，所述抗体或融合蛋白通过位置295和位置239处的半胱氨酸与药物或标签偶联。
在另一实施方式中，抗体或融合蛋白通过eu编号的位置294处的半胱氨酸与药物或标签偶联。任选地，eu编号的位置239被半胱氨酸占据。
本发明还提供一种作为异源二聚体的抗体，其包含两条重链和两条轻链，其中，一分子抗体通过两条重链中的位置295和位置239处的半胱氨酸偶联而结合四个药物分子。任选地，恒定区具有同种型，其是人igg1，igg2，igg3或igg4。
本发明还提供一种作为异源二聚体的抗体，其包含两条重链和两条轻链，其中，一分子抗体通过两条重链中的位置294和位置239处的半胱氨酸偶联而结合四个药物分子。任选地，恒定区具有同种型，其是人igg1，igg2，igg3或igg4。
在一些抗体或融合蛋白中，药物是tubulysin。任选地，药物通过葡糖苷酸连接体与抗体偶联。任选地，所述抗体与具有如下所示的结构的tubulysin和葡糖苷酸连接体偶联。
任选地，所述药物是mmae，mmaf，或小沟结合物，或pbd。任选地，所述重链恒定区具有seqidno：5-12中任一个的序列，条件是不存在c-末端赖氨酸。
任选地，所述抗体或融合蛋白通过可裂解连接体与药物偶联。
本发明还提供包含上文所述的抗体或融合蛋白的药物组合物。
本发明还提供包含如下重链恒定区的抗体或融合蛋白，在该重链恒定区中，eu编号的位置239被半胱氨酸占据，该半胱氨酸进而与tubulysinm偶联。
本发明还提供生产包含如下重链恒定区的抗体或融合蛋白的方法，在所述重链恒定区中，eu编号的位置239和位置295被半胱氨酸占据。所述方法包括培养工程化为编码所述抗体或融合蛋白的细胞，其中，所述抗体或融合蛋白被表达，以及纯化所述抗体或融合蛋白。任选地，所述方法还包括通过位置239和位置295处的半胱氨酸使所述抗体或融合蛋白与药物偶联。任选地，所述方法还包括使所述抗体与还原剂接触，所述还原剂抑制在位置239和位置295处的半胱氨酸之间形成二硫键。任选地，所述抗体或融合蛋白通过将所述还原剂包含在培养所述抗体或融合蛋白的培养基中而与所述还原剂接触。任选地，所述还原剂是二硫苏糖醇，β-巯基乙醇或三(2-羧基乙基)磷化氢。任选地，所述还原剂是浓度为0.1mm至2mm的二硫苏糖醇。
附图说明
图1显示了抗体结构模型，其举例说明了突变位点和多糖链的相对位置。
图2显示了突变的引入导致多糖分布发生改变。
图3显示了vcmmaeadc进入大鼠血浆七天后的马来酰亚胺稳定性。
图4显示了tubulysinadc进入大鼠血浆七天后的tubylysin稳定性。
图5显示了在两个突变位点偶联的tubulysinadc暴露于大鼠血浆七天后的tubulysin稳定性。
图6还显示了tubulysin稳定性。
图7显示了具有两个突变的adc进入大鼠血浆之后在细胞毒性方面的不同。
图8和图9比较了肿瘤异种移植物模型中不同的抗体药物偶联物。
图10a显示了典型的igg1糖基化模式，图10b显示了s239c突变糖基化模式，图10c显示了q295c糖基化模式，图10d显示了s239c/q295c双突变的糖基化模式。
图11：(上部图)带有s239c/q295c突变的稳定表达的mab的糖基化模式，(下部图)带有s239c/q295c突变的瞬时表达的mab。
图12：s239c/e294c突变的mab(上部图)，s239c/q95c突变的mab(中间图)和野生型多糖(下部图)的多糖模式的plrp-ms分析。
图13：未还原的肽绘图，其显示了母体mab中共价连接在一起的h16(s239c)(seqidno：21)和h19(q295c)(seqidno：22)。
图14：比较细胞培养基中各种不同的dtt和三(2-羧基乙基)磷化氢(tcep)的浓度和使用s239c/q295c突变所生成的多糖的稳定表达数据。
图15：在维持在1.2mm二硫苏糖醇(dtt)中进行培养时瞬时表达的s239c/q295c突变的多糖分析。
具体实施方式
释义
分离的抗体或adc通常是相对于干扰蛋白质和其他由该分离的抗体或adc的制备或纯化产生的污染物的至少50％w/w纯的，但是不排除抗体与过量的药学上可接受的载体或意在促进该抗体的使用的其他载剂结合的可能。有时，抗体或adc是相对于干扰蛋白质和制备或纯化过程中的污染物的至少60％，70％，80％，90％，95或99％w/w纯的。
单独的抗体与其靶向抗原的特异性结合或作为adc的成分的抗体与其靶向抗原的特异性结合是指至少106，107，108，109，或1010m-1的亲和性。特异性结合相对于在至少一个非相关靶点发生的非特异性结合具有可检测的较高的结合程度并且相对于在至少一个非相关靶点发生的非特异性结合是可区分的。特异性结合可以是特定官能团之间或特定空间匹配模式(spatialfit)(例如，锁和钥匙的类型)之间的键的形成而产生的，而非特异性结合通常是由范德华力产生的。然而，特异性结合不必然暗示单克隆抗体结合一个且只有一个靶点。
基本的抗体结构单元是四聚物亚单元。每个四聚物包括两对多肽链，其中一对多肽链具有一个“轻”(约25kda)链和一个“重(约50-70kda)”链。每个链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。该可变区最初连接至可裂解的信号肽而被表达。不含信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是不含轻链信号肽的轻链可变区。每个链的羧基末端部分界定了恒定区。重链恒定区主要负责效应子功能。
轻链被分为kappa或lambda。重链被分为γ，mu，α，δ或ε，并且重链分别界定了抗体的亚型为igg，igm，iga，igd和ige。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个氨基酸或更多个氨基酸的“j”区域连接，其中，重链还包括约10个氨基酸或更多个氨基酸的“d”区域。(参见，fundamentalimmunology(paul，w.编辑，第二版.ravenpress，n.y.，1989，ch.7，其通过引用并入本文)。
每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，这两个结合位点是相同的。所有链均表现出通过三个高变区连接的相对保守的骨架区(fr)的相同总体结构，所述高变区也被称为互补决定区或cdr。每对轻链和重链的两个链中cdr通过骨架区对齐，能够结合至特异性表位。从n末端至c末端，轻链和重链均包含结构域fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3和fr4。给每个结构域分配氨基酸根据kabat的定义(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，1987and1991)，或chothia&lesk，j.mol.biol.196：901-917(1987)；chothia等人，nature342：878-883(1989))进行。kabat还提供广泛使用的编号规则(kabat编号)，其中，给不同的重链之间的相应残基或不同轻链之间的相应残基分配相同的编号。
术语“抗体”包括完整抗体及其结合片段。通常，抗体片段与衍生所述抗体片段的完整抗体相当，用于特异性结合包括单独的重链，轻链，fab，fab’，f(ab’)2，f(ab)c，双抗体，dabs，纳米抗体和fv在内的靶点。片段可通过重组dna技术产生或通过完整免疫球蛋白的酶分离或化学分离而产生。术语“抗体”还包括双抗体(同源性fv片段)或微小抗体(vl-vh-ch3)，双特异性抗体，等等。双特异性抗体或双功能抗体是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体(参见，例如，songsivilaiandlachmann，clin.exp.immunol.，79：315-321(1990)；kostelny等人，j.immunol.，148：1547-53(1992))。术语“抗体”包括抗体自身(裸抗体)或与细胞毒性药物或细胞抑制药物偶联的抗体。
术语“表位”是指抗原上的与抗体结合的位点。表面可由连续氨基酸形成或由通过一个或多个蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂之后仍然保留，而由三级折叠形成的表位通常在由变性溶剂处理之后而失去。表位通常包括至少3个处于独特空间构象中的氨基酸和更多个(至少5个或8-10个)处于独特空间构象中的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如，x-射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，epitopemappingprotocols，inmethodsinmolecularbiology，vo1.66，glenne.morris，ed.(1996)。
术语“患者”包括接受预防治疗或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受治者。
为了将氨基酸取代分为保守取代或非保守取代，将氨基酸进行如下分组：i组(疏水性侧链)：met，ala，val，leu，ile；ii组(中性亲水性侧链)：cys，ser，thr；iii组(酸性侧链)：asp，glu；iv组(碱性侧链)：asn，gln，his，lys，arg；v组(影响链方向的残基)：gly，pro；以及vi组(芳香性侧链)：trp，tyr，phe。保守取代涉及相同类型的氨基酸之间的取代。非保守取代包括上述这些类别中的一个类别中的一个成员与另一类别中的成员的交换。
序列一致性百分比通过序列最大化比对确定。
序列一致性可通过使用诸如wisonsingenetics软件数据包版本7.0(geneticscomputergroup，575sciencedr.，madison，wis.)中的bestfit，fasta和tfasta之类的算法，使用默认gap参数比对序列进行确定或通过检查和最佳比对(即，在比较窗口上得到序列类似性的最高百分比)进行确定。序列一致性百分比如下进行计算：在比较窗口上对两个最佳比对的序列进行比较，确定两个序列中出现相同残基的位置数目以得到匹配的位置数目，由匹配的位置数目除比较窗口(即，窗口尺寸)中匹配的和不匹配的位置的总数(不计算空位)，得到的结果乘以100，从而得到序列一致性百分比。抗体序列通过kabat编号规则进行比对，从而将占据相同编号的位置的残基进行比对。在比对之后，如果目标序列与参比序列进行比较，那么目标序列和参比序列之间的序列一致性百分数是目标序列和参比序列中的相同氨基酸所占据的位置的数目除两个区域中比对的位置总数(不计算空位)随后乘以100而转化成百分数。
组合物或方法“包含”一种或多个记载的要素可包括其他没有特别记载的要素。例如，包含抗体的组合物可包含抗体自身或抗体与其他成分的组合。
数值范围的指定包括该范围内的所有整数或界定该范围的所有整数。
抗体效应子功能是指由ig的fc结构域产生的功能。这些功能可以是例如，抗体依赖性细胞毒性，抗体依赖性细胞吞噬作用或补体依赖性细胞毒性。这些功能可受到例如fc效应子结构域与具有细胞吞噬活性或细胞溶解活性的免疫细胞上的fc受体的结合的影响或受到fc效应子结构域与补体系统的成分的结合的影响。通常，由fc结合细胞或补体成分介导的作用导致靶细胞的抑制和/或耗尽。抗体的fc区域可招募表达fc受体(fcr)的细胞并使它们与抗体包被的靶细胞并置。igg的细胞表达表面fcr可用作破坏igg包被的细胞的效应子细胞，其中，igg的细胞表达表面fcr包括fcγriii(cd16)，fcγrii(cd32)和fcγriii(cd64)。这些效应子细胞包括单核细胞，巨噬细胞，天然杀伤(nk)细胞，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。通过igg结合fcγr活化抗体依赖性细胞毒性(adcc)或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。adcc由cd16+效应子细胞通过膜孔形成蛋白和蛋白酶的分泌而介导，而细胞吞噬作用由cd32+和cd64+效应子细胞介导(参见，fundamentalimmunology，4thed.，pauled.，lippincott-raven，n.y.，1997，chapters3，17and30；uchida等人，2004，j.exp.med.199：1659-69；akewanlop等人，2001，cancerres.61：4061-65；watanabe等人，1999，breastcancerres.treat.53：199-207)。除了adcc和adcp之外，结合有细胞的抗体的fc区域还可活化补体经典通路以诱导补体依赖性细胞毒性(cdc)。当抗体的fc区域与抗原复合时，补体系统的c1q结合至抗体的fc区域。c1q与结合有细胞的抗体的结合可启动涉及c4和c2的蛋白酶活化的事件的级联反应，从而产生c3转化酶。c3通过c3转化酶裂解为c3b能够活化包括c5b，c6，c7，c8和c9在内的末端补体成分。笼统而言，这些蛋白质在抗体包被的细胞上形成攻膜复合物孔。这些孔破坏了细胞膜的完整性，杀伤靶细胞(参见，immunobiology，第6版，janeway等人，garlandscience，n.y.，2005，chapter2)。
“细胞毒性作用”是指耗尽，消除和/或杀伤靶细胞。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性作用的试剂。细胞毒性剂可与抗体偶联或与抗体联合施用。
“细胞抑制作用”是指抑制细胞增殖。“细胞抑制剂”是指对细胞具有细胞抑制作用的试剂，从而抑制细胞的特定亚组的生长和/或扩增。细胞抑制试剂可与抗体偶联或与抗体联合施用。
术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府的管理机构批准可用于动物或(更加具体而言，用于人类)可由联邦政府或州政府的管理机构批准可用于动物(更加具体而言，用于人类)或在美国药典或其他通常已知的药典中列出的可用于动物(更加具体而言，用于人类)。术语“药学上相容的成分”是指药学上可接受的稀释剂，佐剂，赋形剂或与抗体或adc结合的载剂。
术语“药学上可接受的盐”是指抗体或其偶联物或与抗体一同给药的试剂的药学上可接受的有机或无机盐。示例性的盐包括硫酸盐，柠檬酸盐，醋酸盐，草酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，硝酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，异烟酸盐，乳酸盐，水杨酸盐，酸式柠檬酸盐，酒石酸盐，油酸盐，丹宁酸盐，泛酸盐，酒石酸氢盐，抗坏血酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，龙胆酸盐(gentisinate)，富马酸盐，葡萄糖酸盐，葡糖醛酸盐，糖酸盐，甲酸盐，苯酸盐，谷氨酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，甲苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1，1’亚甲基双-(2-羟基3萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可包括诸如醋酸盐离子，琥珀酸盐离子或其他对离子之类的另一分子。所述对离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机基团或无机基团。而且，药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个带电荷的原子。多个带电荷的原子是药学上可接受的盐的一部分的实例可具有多个对离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电荷的原子和/或一个或多个对离子。
除非另有明确说明，术语“约”包括所述值的标准偏差内的值。
人源化抗体是基因工程抗体，其中，来自非人类“供体”抗体的cdr被接枝至人类“受体”抗体序列(参见，例如，queen，美国专利us5,530,101和us5,585,089；winter，美国专利us5,225,539，carter，美国专利us6,407,213，adair，美国专利us5,859,205us6,881,557，foote，美国专利us6,881,557)。例如，受体抗体序列可以是成熟人类抗体序列，这些序列的组合，人抗体序列的共有序列或种系区域序列。因此，人源化抗体是具有人源化抗体的cdr的抗体，优选地如kabat所定义的，其整体或基本来自供体抗体和可变区域骨架序列以及恒定区，如果存在的话，人源化抗体整体或基本来自人抗体序列。不同于纳米抗体和dab，人源化抗体包括人源化的重链和人源化的轻链。当人源化抗体的cdr和非人类抗体的cdr之间对应的残基(如kabat所界定的)的至少85％，90％，95％或100％相同时，人源化抗体中的cdr基本来自于非人类抗体中的对应的cdr。当kabaat界定的对应残基的至少85％，90％，95％或100％相同时，抗体链的可变区骨架序列或抗体链的恒定区基本分别来自人可变区骨架序列或人恒定区。
嵌合抗体是如下抗体，其中，非人类抗体(例如，小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人或非人类灵长动物的轻链和重链恒定区结合。这些抗体基本或整体保留了小鼠抗体的结合特异性并且约三分之二是人序列或非人类灵长动物序列。
饰面抗体(veneeredantibody)是一类如下的人源化抗体，其保留了一些cdr且通常是全部cdr并且保留了非人类抗体的非人类可变区骨架残基中的一些但是可能有利于b细胞表位或t细胞表位的其他可变区骨架残基(例如，暴露的残基(padlan，mol.immunol.28：489，1991))被人抗体序列的相应位置的残基取代。由此得到的抗体中，cdr全部或基本来自非人类抗体并且非人类抗体的可变区骨架通过取代而更加类似人类抗体的可变区骨架。
抗体-药物偶联物(adc)包含与药物偶联的抗体。药物是已知的化合物或可能具有药理学活性(通常是细胞毒性或细胞抑制活性)的化合物。
当抗体药物偶联物的抗体成分被认为包括位于位置239和/或295或位于位置239和/或294的半胱氨酸时，这意味着抗体包括在随后与偶联物中的药物偶联的半胱氨酸。在偶联物中，半胱氨酸通过将其巯基与药物或连接体键合而进行衍生。
当抗体被认为偶联至药物时，键合可以是直接键合或可以是通过一个或多个连接基团的间接键合。
i.概述
本发明提供修饰的重链恒定区，其包括位于eu编号的位置294或295的半胱氨酸和任选地位于eu编号的位置239的半胱氨酸。这些半胱氨酸残基提供与药物或标签偶联的位点。在正常异源二聚抗体版本中，当两个半胱氨酸存在于每个重链中时，每个抗体分子中存在有四个这样的位点，这使得一个抗体分子的化学计量为四个药物或标签。选择位于位置294或295的半胱氨酸并带有位于位置239的半胱氨酸或选择位于位置294或295的半胱氨酸但不带有位于位置239的半胱氨酸相对于位于许多其他位置的半胱氨酸由于易于表达，稳定性和细胞毒性而具有优势。本发明还提供修饰的重链恒定区，其包括与tubulysinm偶联的位于eu编码的位置295的半胱氨酸。
位于位置239，294和295的半胱氨酸对于偶联至疏水性药物(例如，tubulysin或pbd)而言特别有优势。虽然对本发明的实施不依赖于对机理的理解，但是，靠近这些偶联位点的糖基化作用被认为遮盖了提高这些位点的稳定性和半衰期的疏水基团。
ii.重链恒定区
人igg1，igg2，igg3和igg4的示例性的野生型序列在seqidno：1-4中提供。本发明的优选的恒定区具有seqidno：1，2，3或4的序列，除了位置295被半胱氨酸占据(分别为seqidno：5-8)或位置295和位置239被半胱氨酸占据(分别为seqidno：9-12)。本发明其他优选的恒定区具有seqidno：1，2，3或4的序列，除了位置294被半胱氨酸占据(分别为seqidno：13-16)或位置294和位置239被半胱氨酸占据(分别为seqidno：17-20)。
除了ch1结构域可被整体省略之外，因为其可以是上部铰链区，如果恒定区通过不超过1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个的取代，删除或内部插入而不同于指定的亚型，那么，恒定区被认为是这种指定的亚型。对指定的seqidno进行的改变可代表一个或多个天然同种异型变异(allotypic)或同族同种异型变异(isoallotypic)，增加或降低效应子功能的变异(例如，补体介导的细胞毒性或adcc(参见，例如，winter等人，uspatentno.5,624,821；tso等人，美国专利us5,834,597；andlazar等人，proc.natl.acad.sci.usa103：4005，2006))或延迟人体内半衰期的变异(参见，例如，hinton等人，j.biol.chem.279：6213，2004)，这种变异的示例性的取代包括位于位置250的gln和/或位于位置428的leu(eu编号)。其他变异可添加或删除翻译后修饰的位点，例如，n-x-s/t基序的n-连接的糖基化作用。变异还可包括引入榫头(knob)(即，用较大的氨基酸取代一个或多个氨基酸)或卯眼(hole)(即，用较小的氨基酸取代一个或多个氨基酸)以促进在不同的重链之间形成异源二聚体，从而生成双特异性抗体。示例性的形成榫头和卯眼对的取代分别是t336y和y407t(ridgeway等人，proteinengineeringvol.9no.7pp.617-621，1996)。来自恒定区的c末端的一个或多个残基，尤其是重链上的c-末端赖氨酸，因翻译后修饰而可被删去。
修饰的恒定区和合并了这些恒定区的抗体或融合蛋白优选地通过易于表达，稳定性，糖基化作用降低，对偶联的接近性以及基本不发生改变的效应子功能和对抗原的亲和性进行表征。也就是说，结合亲和性在实验误差范围内是相同的或至少在带有亚型匹配的野生型恒定区的合适的对照抗体的2个或3个因子内是相同的。
相对于亚型匹配的对照的修饰的恒定区的免疫原性或合并有该修饰的恒定区的抗体或融合蛋白的免疫原性可通过测试树突成熟或t细胞增殖进行体外评估(gaitonde等人，methodsmol.biol.2011；716：267-80)或可通过比较人群之间给药的抗体中的反应性抗体的比例进行体内评估。修饰的恒定区的免疫原性或合并有该修饰的恒定区的抗体或融合蛋白的免疫原性优选地不会显著不同于亚型匹配的对照或不会不及亚型匹配的对照的2倍，3倍或5倍。
iii.抗体和融合蛋白
上文描述的修饰的重链恒定区可并入抗体或融合蛋白中。例如，对于二价单特异性抗体的表达而言，修饰的重链恒定区融合至重链可变区以及包括轻链可变区和轻链恒定区在内的轻链而进行表达。重链和轻链通过重链恒定区的和轻链恒定区的ch1区彼此结合以形成异源二聚体。随后两个异源二聚体通过结合igg重链的铰链，ch2和ch3区配对而形成四聚体单元，这是常规抗体的情况。对于双特异性抗体的表达而言，修饰的重链恒定区融合至不同靶特异性的两个重链可变区中的每一个而进行表达。重链可分别与共表达的轻链组装并且重链-轻链复合物形成异源二聚体，该异源二聚体中存在两条重链。单元中的轻链可变区可以是相同的(参见，例如，us20100331527a1)或不同的。
修饰的恒定区可用于任何类型的工程化的抗体(包括，嵌合抗体，人源化抗体，饰面抗体或人抗体)。抗体可以是单克隆抗体或基因工程化的多克隆抗体制剂(参见，us6,986,986)。
对于融合蛋白而言，修饰的恒定区连接至异源多肽而进行表达。融合蛋白中的异源多肽是未天然连接至免疫球蛋白恒定区的多肽。这样的多肽可以是全长蛋白质或其任何片段，所述片段具有足以保持与结合有全长蛋白质的抗原结合的特异性的长度。例如，异源多肽可以是受体细胞外结构域或其配体。异源多肽提供位于恒定区n末端的结合区并且有时被简称为结合区。iggch1区通常不包括在融合蛋白的恒定区内。铰链区或其部分，尤其是上部铰链区，有时被省略或由合成的连接体肽取代。示例性的受体蛋白质(其细胞外结构域可与本发明的修饰的重链恒定区结合)包括tnf-α受体ecd，lfa-3ecd，ctla-4ecd，il-1r1ecd，tpo模拟物，vegfr1或vegfr2ecd。
iv.抗体表达
编码抗体链或融合蛋白的核酸可通过固相合成、重叠的寡核苷酸片段的pcr扩增或已有核酸的位点定向突变制备。这些核酸在表达载体中表达。载体可被配置成编码修饰的重链恒定区和/或人轻链恒定区，这样所述载体可被表达为与插入的重链可变区和轻链可变区或异源多肽融合。
载体中复制的来源和表达控制元件(启动子、增强子、信号肽等等)可被配置成用于不同的细胞类型，例如，细菌，酵母或其他真菌，昆虫细胞和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞是用于表达编码本发明的抗体或融合蛋白的核苷酸片段的优选宿主(参见，winnacker，fromgenestoclones，(vchpublishers，ny，1987))。本领域已研发了多种能够分泌完整的异源蛋白质的合适的宿主细胞系，并且包括cho细胞系，各种不同的cos细胞系，hela细胞，hek293细胞，l细胞和包括sp2/0和ns0在内的非抗体生成的骨髓瘤细胞。优选地，所述细胞是非人类细胞。优选地，本发明的抗体或融合蛋白由单克隆细胞系表达。
这些细胞的表达载体可包括表达控制序列(例如，复制来源，启动子，增强子(queen等人，immunol.rev.89：49(1986)))和必需的加工信息位点(例如，核糖体结合位点，rna剪接位点，多腺苷酸化位点)以及转录终止子序列。优选的表达控制序列是源自内源基因，巨细胞病毒，sv40，腺病毒，牛乳头瘤病毒等等的启动子(参见，co等人，j.immunol.148：1149(1992))。
使用一个或多个编码待表达的抗体或融合蛋白的载体转染细胞。对于多链抗体而言，重链和轻链可在相同的载体上表达或在单独的载体上表达。对于多特异性复合物而言，编码复合物成分的dna(即，不同的抗体或融合蛋白)可位于相同或不同的载体上。
对抗体或融合蛋白链进行表达，进行移除信号肽的加工，进行组装并从宿主细胞中分泌。抗体或融合蛋白可通过常规抗体纯化方法从细胞培养物上清液中纯化。如果混合的恒定区包括igg部分，那么，纯化可包括使用作为亲和性试剂的蛋白质a或蛋白质g的色谱分析法。还可使用常规抗体纯化步骤，例如，离子交换，羟磷灰石色谱分析法或hplc(参见，scopes，proteinpurification(springer-verlag，ny，1982))。
在一些方法中，在偶联之前，重链包括位于位置(a)239和(b)294或295的半胱氨酸的抗体或融合蛋白使用还原剂进行处理，以抑制二硫键的形成，尤其是抑制位置239和位置294或295的半胱氨酸之间的分子内二硫键的形成。优选地，还原剂被包括在用于培养抗体的培养基内。合适的用于保护巯基键的还原剂的实例包括二硫苏糖醇，β-巯基乙醇或三(2-羧基乙基)磷化氢，或它们的任何组合。优选的还原剂是培养基中的二硫苏糖醇。培养基中二硫苏糖醇或其他还原剂的浓度可以是例如0.1-5mm，或0.5-2.5mm或0.9-1.5mm。
相反地，当在不含还原剂的培养基中进行培养时，具有位于位置239和位置294或295的半胱氨酸的抗体或融合蛋白产生高唾液酸化作用(hypersialyation)和/或三个或四个触角分支glcnac。
v.抗体药物偶联物
引入重链恒定区中的半胱氨酸残基提供与药物偶联的位点，尤其是与作为抗体药物偶联物(adc)的细胞毒性基团或细胞抑制基团偶联的位点。与裸抗体相比，adc提供额外的机理，具体而言，将与抗体偶联的毒性基团递送至细胞内部，从而杀伤细胞或抑制细胞增殖。目前市售的四种adc为：brentuximabvedotin(抗-cd30，商品名：
用于将药物与抗体偶联的技术是本领域熟知的(参见，例如，arnon等人，“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy，”inmonoclonalantibodiesandcancertherapy(reisfeld等人eds.，alanr.liss，inc.，1985)；hellstrom等人，“antibodiesfordrugdelivery，”incontrolleddrugdelivery(robinson等人eds.，marceldekker，inc.，2nded.1987)；thorpe，“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy：areview，”inmonoclonalantibodies‘84：biologicalandclinicalapplications(pinchera等人eds.，1985)；“analysis，results，andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy，”inmonoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy(baldwin等人eds.，academicpress，1985)；andthorpe等人，1982，immunol.rev.62：119-58.还可参见例如wo89/12624)。
半胱氨酸含有游离巯基，其相对于胺基更具有亲核性并且通常是蛋白质中最具有反应性的官能团。不像大多数胺基，巯基通常在中性ph条件下具有反应性，因此巯基可在胺基存在的情况下选择性地与其他分子连接。这种选择性使得巯基成为连接抗体所选择的连接体。每分子抗体中的药物分子的平均数目通常为1个，2个，3个或4个。
药物可以降低其活性的方式进行偶联，除非其从抗体中裂解(例如，通过水解，抗体降解或裂解试剂)。这样的药物通过可裂解的连接体连接至抗体，所述可裂解的连接体对靶细胞的细胞内环境中的裂解敏感但是对细胞外环境基本不敏感，这样，当偶联物被靶细胞内在化时，偶联物从抗体中裂解出来(例如，在胞内体环境中裂解，或例如，在溶酶体环境中或在小窝环境中凭借ph敏感性或蛋白酶敏感性裂解)。
通常，adc包含位于药物和抗体之间的连接体区域。所述连接体可以是在细胞内条件下可裂解的，这样，在细胞内环境(例如，溶酶体或胞内体或小窝中)中，连接体的裂解使药物从抗体中释放出来。所述连接体可以是例如由细胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体蛋白酶或胞内体蛋白酶)裂解的肽基连接体。通常，肽基连接体的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。裂解试剂可包括组织蛋白酶b和d以及纤溶酶(参见，例如，dubowchikandwalker，1999，pharm.therapeutics83：67-123)。大多数典型的肽基连接体可被靶细胞中存在的酶裂解。例如，可使用在癌组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-b裂解的肽基连接体(例如，包括phe-leu或gly-phe-leu-gly肽的连接体)。其他这样的连接体在例如us6,214,345中描述。可被细胞内蛋白酶裂解的示例性的肽基连接体包括val-cit连接体或phe-lys二肽(参见，例如，us6,214,345，其描述了使用val-cit连接体合成多柔比星)。使用细胞内蛋白酶释放药物的一个优势在于所述药物在发生偶联时通常毒性减低并且偶联物的血清稳定性通常较高。
可裂解的连接体可以是ph-敏感的，即，对一定ph值条件下的水解是敏感的。通常，ph敏感的连接体是在酸性条件下可水解的。例如，可使用溶酶体中可水解的酸性不稳定的连接体(例如，腙，缩氨基脲，缩胺基硫脲，顺式乌头酰胺(aconiticamide)，原酸酯、缩醛、缩酮等，(参见，例如，us5,122,368；5,824,805；5,622,929；dubowchikandwalker，1999，pharm.therapeutics83：67-123；neville等人，1989，biol.chem.264：14653-14661))。这样的连接体在中性ph条件下是相对稳定的(例如，在血液中相对稳定的那些连接体)，但是其在ph低于5.5或5.0的条件(溶酶体的大致ph)下是不稳定的。这样的可水解的连接体的一个实例是硫醚连接体(例如，通过酰基腙键连接至药物的硫醚(参见，例如，us5,622,929))。
其他连接体是在还原条件下可裂解的(例如，二硫化物连接体)。二硫化物连接体包括可使用sata(n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫代乙酸酯)，spdp(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)，spdb(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯)和smpt(n-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯)形成的那些二硫化物连接体。(参见，例如，thorpe等人，1987，cancerres.47：5924-5931；wawrzynczak等人，inimmunoconjugates：antibodyconjugatesinradioimageryandiherapyofcancer(c.w.vogeled.，oxfordu.press，1987.还可参见美国专利us4,880,935)。
连接体还可以是丙二酸盐连接体(johnson等人，1995，anticancerres.15：1387-93)，马来酰亚胺苯甲酰基连接体(lau等人，1995，bioorg-med-chem.3(10)：1299-1304)或3’-n-酰胺类似物(lau等人，1995，bioorg-med-chem.3(10)：1305-12)。
连接体还可以是非可裂解的连接体，例如，直接连接至药物的马来酰亚胺基-亚烷基连接体或马来酰亚胺-芳基连接体。活性药物连接体通过抗体的降解而被释放。
连接体是包括对抗体中存在的基团具有反应性的官能团的连接体。例如，连接体可通过连接体的硫原子和抗体的硫原子之间的二硫键连接至抗体。作为另一实例，连接体可通过伸展单元的马来酰亚胺基团与抗体的硫原子形成键合。硫原子可来自于链间二硫化物的半胱氨酸残基或引入抗体中的半胱氨酸残基。
与抗体偶联的有用的细胞毒性试剂的类别包括例如，抗微管蛋白剂、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、化疗增敏剂、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体等。其它示例性的细胞毒试剂的类别包括蒽环类抗生素、澳瑞他汀、喜树碱、多卡米星、依托泊苷、美登醇和长春花生物碱。一些示例性的细胞毒试剂包括澳瑞他汀(例如，澳瑞他汀e、afp、mmaf、mmae)、dna小沟结合剂(例如，烯二炔和偏端霉素)、多卡米星、紫杉烷(例如，紫杉醇和多西紫杉醇)、长春花生物碱、多柔比星、吗啉代-多柔比星和氰基吗啉代-多柔比星。
细胞毒性试剂可以是化疗剂，例如，多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、氨甲蝶呤、丝裂霉素c或依托泊甙。该试剂还可以是cc-1065类似物、卡奇霉素、美登素、多拉司他汀10类似物、根霉素或海葵毒素。
细胞毒性试剂还可以是澳瑞他汀。该澳瑞他汀可以是澳瑞他汀e衍生物，其是例如澳瑞他汀e和酮酸之间形成的酯。例如，澳瑞他汀e可与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应，从而分别生成aeb和aevb。其它典型的澳瑞他汀包括澳瑞他汀苯基丙氨酸苯二胺(afp)、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)和单甲基澳瑞他汀e(mmae)。例如，在us2005-0238649和us2006-0074008中对各种澳瑞他汀的合成和结构进行了描述。
细胞毒性试剂可以是dna小沟结合剂(参见，例如，us6,130,237)。例如，所述小沟结合剂可以是cbi化合物或烯二炔(例如，卡奇霉素)。小沟结合剂的另一类别是吡咯并苯并二氮杂卓(pdb)二聚体。pdb通过其n10-c11亚胺/甲醇胺基团与dna小沟内的鸟嘌呤的c2-氨基位置的共价键合发挥其生物活性。示例性的抗体-药物偶联物包括基于pbd的抗体药物偶联物，即，其中药物成分为pbd药物的抗体药物偶联物。
pbd具有如下通式结构：
各种不同的pbd之间的区别在于其芳香a环和吡咯c环中的取代基的数量、类型和位置并且还在于c环的饱和程度。在b环中，在n10-c11位置具有亚胺(n＝c)，或甲醇胺(nh-ch(oh))或甲醇胺甲醚(nh-ch(ome))，其是用于对dna进行烷基化的亲电中心。本领域已知的所有天然产物在手性c11a位置具有(s)-结构，其为天然产物提供从c环向a环观察时的右手螺旋。这为天然产物提供与b-形式dna的小沟具有等螺旋性的合适的三维形状，从而在结合位点形成滑动配合。pbd在小沟中形成加合物的能力使得pbd干扰dna加工，因此，pbd用作抗肿瘤试剂。
这些分子的生物活性可通过由柔性亚烷基连接体通过这些分子的c8/c’羟基官能团将两个pbd单元连接在一起而被增强。pbd二聚体被认为形成序列选择性dna损伤(例如，回文5’-pu-gatc-py-3’链间交联)，该序列选择性dna损伤被认为主要负责这些分子的生物活性。
在一些实施方式中，基于pbd的抗体药物偶联物包括连接至抗体的pbd二聚体。形成pbd二聚体的单体可以是相同的或不同的，即，对称的或非对称的。pbd二聚体可以在任何适于偶联至连接体的位置连接至抗体。例如，在一些实施方式中，pbd二聚体将在c2位置具有取代基，所述c2位置提供用于将化合物连接至抗体的锚。在可选的实施方式中，pbd二聚体的n10位置将会提供用于将化合物连接至抗体的锚。
通常，基于pbd的抗体-药物偶联物包含位于pbd药物和结合至原发性癌症的抗原的抗体之间的连接体。所述连接体可包含可裂解单元(例如，氨基酸或作为酶的目标底物的氨基酸的连续序列)或非可裂解的连接体(例如，抗体降解释放的连接体)。所述连接体还可包含用于连接至抗体的马来酰亚胺基团，例如，马来酰亚胺基已酰基。在一些实施方式中，所述连接体还可包含自消耗基团，例如，对氨基苯甲醇(pab)单元。
用作偶联物的示例性的pbd或其药学上可接受的盐在国际申请wo2011/130613中描述并且如下所示，其中，波浪线表示连接至连接体的位点：
示例性的连接体如下所示，其中，波浪线表示连接至药物的位点并且抗体通过马来酰亚胺基团连接。
示例性的基于pbd的抗体-药物偶联物包括如下所示的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中，ab是本文所述的抗体：
药物载量由p表示，其是每个抗体中的药物-连接体分子的数量。
细胞毒性试剂或细胞抑制试剂可以是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括紫杉烷(例如，
细胞毒性试剂可以是美登木素，其是另一类抗微管蛋白剂。例如，美登木素可以是美登素或含有诸如dm-1或dm-4(immunogen，inc.；还可参见chari等人，1992，cancerres.52：127-131)之类的药物连接体的美登素。
示例性的抗体药物偶联物包括如下所示的vcmmae和mcmmaf抗体药物偶联物，其中，p表示药物载量并且其通常为1至4，优选地为2至4，ab是抗体：
与抗体偶联的其他细胞毒性试剂可以是tubulysin及其类似物，其是下文举例说明的另一类抗微管蛋白剂。
在一些方面，那些细胞毒性试剂通过β-葡糖苷酸连接体与抗体偶联。该葡糖苷酸连接体是蛋白酶可裂解的连接体(例如，缬氨酸-瓜氨酸和缬氨酸丙氨酸)的亲水性替代物，并且该葡糖苷酸连接体利用细胞内β葡糖醛酸酶以启动药物释放。
位置295或294和位置239双半胱氨酸变体特别适用于与疏水药物偶联，这是因为靠近多糖残基的偶联位点用于遮挡疏水药物。连接至这些细胞毒性试剂的tubulysin和葡糖苷酸连接体在wo2016040684中更加全面地描述。
用于与双半胱氨酸残基偶联的葡糖苷酸连接的tubulysin药物连接体化合物的非限定性实例由化合物8和化合物9(下文)给出，其中，tubulysin药物单元是tubulysinm或去甲基tubulysinm。已知tubulysinm是：(as，γr)-γ-[[[2-[(1r，3r)-1-(乙酰氧基)-4-甲基-3-[甲基[(2s，3s)-3-甲基-2-[[[(2r)-1-甲基-2-哌啶基]羰基]氨基]-1-氧戊烷基]氨基]戊烷基]-4-噻唑基]羰基]氨基]-α-甲基-苯戊酸，并且其cas号为：936691-46-2。
连接至葡糖苷酸连接体的tubulysinm的醚变体如上所示。
基于葡糖苷酸的tubulysin药物连接体化合物8和tubulysin酯和醚变体的制备在wo20160404684中详细描述，并且该pct申请通过引用并入本文，制备方法由下述反应方案举例说明。
mdpr(boc)-oh(其转化为其活化的酯mdpr(boc)-osu和mdpr(boc)-opff)的制备在naturebiotech，2014，32，1059-1062中描述，制备方法步骤特别地通过引用并入本文，并且葡糖苷酸中间体(其被溴化以和tubulysinm进行季铵化作用)的制备在molecularcancertherapeutics15，938-945(2016)中描述，制备方法步骤特别地通过引用并入本文。
tubulysinm及其类似物的抗体药物偶联物如下进行举例说明，在tubulysinm的类似物中，频氨酸(tubuvaline)的乙酸酯基团被醚或另一酯基团取代，所述醚或另一酯基团通过tubulysinmep残基的叔胺氮的季铵化将葡糖苷酸连接体连接至tubulysinmep残基的叔胺氮，并且tubulysinm的类似物可由药物连接体化合物(例如上文所述的那些)来制备，其示例如下：
其中，r2a是-c(＝o)r2b，其中，r2b是甲基，乙基，丙基，异丙基，3-甲基-丙-1-基，3，3-二甲基-丙-1基，或乙烯基，或者，r2a是甲基，乙基，丙基，异丙基，丙-2-烯-1-基，或2-甲基-丙-2-烯-1-基，并且，其中，r7b是-h或-oh，其中，p代表药物载量，通常为1至4，在一些方面，p为2或4，ab是抗体，s是半胱氨酸295的硫原子或半胱氨酸239的硫原子。
抗体或融合蛋白还可通过占据位置295以及任选地占据位置239的半胱氨酸偶联至可检测的标志物，例如，酶，发色团或荧光标签。
偶联至药物或标签抗体还可通过可裂解连接体进行连接，该可裂解连接体连接至抑制抗体结合的抑制剂或遮挡结构域(参见，例如，wo2003/068934，wo2004/009638，wo2009/025846，wo2101/081173和wo2014103973)。所述连接体可被设计为由对某些组织或病状具有特异性的酶裂解，因此，抗体能够优先在期望的位置被活化。遮挡基团可通过直接结合至抗体的结合位点发挥作用或可通过空间阻碍间接发挥作用。
vi.靶点
一些这样的抗体对癌细胞抗原具有免疫特异性，优选地对在抗体结合的细胞内可内在化的细胞表面上的癌细胞抗原具有免疫特异性。抗体可靶向的靶点包括癌细胞上的受体及其配体或相对受体(例如，cd3，cd19，cd20，cd22，cd30，cd33，cd34，cd40，cd44，cd47，cd52，cd70，cd79a，cd123，her-2，epha2，gpc3淋巴细胞相关抗原1，vegf或vegfr，ctla-4，liv-1，粘连蛋白-4，cd74，和sltrk-6)。
商售抗体及其适用于本发明的方法的应用的靶点的一些实例包括本妥昔单抗(brentuximab或brentuximabvedotin)，cd30，阿来组单抗，cd52，利妥昔单抗，cd20，曲妥珠单抗her/neu，尼妥珠单抗，西妥昔单抗，egfr，贝伐单抗，vegf，帕丽珠单抗，rsv，阿昔单抗，gpiib/iiia，英利昔单抗，阿达木单抗，赛妥珠单抗，戈利木单抗，tnf-α，巴昔利单抗(baciliximab)，达利珠单抗，il-2，奥马珠单抗，ige，吉姆单抗或vadastuximab，cd33，那他珠单抗，vla-4，维多珠单抗α4β7，贝利木单抗，baff，奥特力昔珠单抗，特普利珠单抗cd3，奥法木单抗，奥瑞珠单抗cd20，依帕珠单抗cd22，阿伦单抗cd52，依库丽单抗c5，卡那木单抗(canakimumab)il-1β，美泊利单抗il-5，瑞利珠单抗，托珠单抗il-6r，乌斯克努单抗，布雷奴单抗il12，il23，hbu12(cd19)(us20120294853)，人源化if6或2f12(cd70)(us20120294863)，br-14a和br2-22a(liv-1)(wo2012078688)。示例性的抗体的一些序列在序列表中提供。
vii.药物组合物以及治疗方法
根据上述方法生成的抗体药物偶联物以如下有效方案给药，所述有效方案是指延缓需要治疗的疾病的发作，降低需要治疗的疾病的严重性，抑制需要治疗的疾病的进一步恶化和/或改善需要治疗的疾病的至少一个征象或症状的给药剂量，给药途径以及给药频率，所述需要治疗的疾病例如，癌症，自体免疫疾病或包括上述任何指症在内的感染。如果患者已患有疾病，那么方案是指治疗有效方案。如果患者相对于普通人群具有高疾病风险但是尚未经历症状，那么，方案可以是指预防有效方案。在一些情况下，治疗或预防疗效可在个体患者相对于历史对照中观察到或可在相同患者相对于过去的感受中观察到。在其他情况下，治疗或预防疗效可在相对于未被治疗的患者的对照群体的接受治疗的患者群体的预临床或临床试验中得到证明。
抗体药物偶联物的示例性的剂量为0.001mg/kg受治者体重至100mg/kg受治者体重，5mg/kg受治者体重至50mg/kg受治者体重，10mg/kg受治者体重至25mg/kg受治者体重，1mg/kg受治者体重至7.5mg/kg受治者体重，或2mg/kg受治者体重至7.5mg/kg受治者体重或3mg/kg受治者体重至7.5mg/kg受治者体重，或0.1-20mg/kg体重，或0.5-5mg/kg体重(例如，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/kg体重)或10-15000mg，200-15000mg或500-10,000mg的固定剂量。偶联至澳瑞他汀或tubulysin的活性单克隆抗体药物偶联物的示例性的剂量为1mg/kg受治者体重至7.5mg/kg受治者体重，或2mg/kg受治者体重至7.5mg/kg受治者体重，或3mg/kg受治者体重至7.5mg/kg受治者体重，或0.1-20mg/kg体重，或0.5-5mg/kg体重(例如，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/kg体重)或10-1500mg或200-1500mg的固定剂量。偶联至pbd的高活性单克隆抗体药物偶联物的示例性的剂量为1.0μg/kg受治者体重至1.0mg/kg受治者体重，或1.0μg/kg受治者体重至500.0μg/kg受治者体重。
在一些方法中，每两周，每三周或每四周向患者给药adc。无论治疗是预防性的还是治疗性的并且无论疾病是急性还是慢性的，剂量取决于给药的频率，患者的情况以及对先前治疗的响应(如果有的话)。剂量还取决于结合、效应子功能或细胞毒性的降低。
给药可以是肠胃外给药，静脉内给药，口服给药，皮下给药，动脉内给药，颅内给药，鞘内给药，腹膜内给药，局部给药，鼻内给药或肌肉内给药。给药还可以直接定位至例如肿瘤。通过静脉内给药或皮下给药的向身体循环的给药是优选的。静脉内给药可以是在诸如30-90分钟之类的时间段内进行输注或通过单次大剂量注射给药。
给药的频率取决于抗体在循环中的半衰期，患者的情况和给药途径以及其他因素。所述频率可以是每天、每周、每月、每季度或响应患者的情况或正在治疗的癌症的进展的非规律间隔。静脉内给药的示例性的频率为在连续治疗期间每周两次给药和每季度给药，虽然还可以使用更高或更低的频率给药。静脉内给药的另一示例性的频率为在连续治疗期间每周给药或每四周给药三次，虽然还可以使用更高或更低的频率给药。对于皮下给药而言，虽然还可以使用更高或更低的频率给药，示例性的给药频率为每天给药至每月给药。
给药的剂量数取决于疾病的特性(例如，是否存在急性症状或慢性症状)以及疾病对治疗的反应。对于急性疾病或慢性疾病的急性加重期而言，1个剂量至10个剂量通常是足够的。有时，单次大剂量(任选地，为分开的形式)对于急性疾病或慢性疾病的急性加重期而言是足够的。可在急性疾病或急性加重期的复发时进行重复治疗。对于慢性疾病而言，抗体可以规律的间隔给药，例如，每周给药，每两周给药，每月给药，每季度给药，每六个月给药，持续至少1年，5年或10年或患者终身。
肠胃外给药的药物组合物优选地为无菌的并且基本是等渗的(240-360mosm/kg)并且在gmp条件下生产。药物组合物可以单位剂量的形式(即，单次给药的剂量)提供。药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅剂来配制。剂型取决于所选择的给药途径。对于注射而言，抗体可在水溶液中配制，优选地，在诸如hank溶液，ringer溶液之类的生理学相容的缓冲液或生理盐水或醋酸缓冲液中配制(以降低注射位点的不适)。溶液可包含诸如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂之类的配方剂。可选地，抗体可以是在使用前采用合适的载剂(例如，无菌无热原水)溶解的冻干形式。液体制剂中的抗体浓度可以是例如，1-100mg/ml，例如10mg/ml。
采用本发明的抗体的治疗可以与化疗、放疗、干细胞治疗、手术、抗病毒治疗、抗生素、免疫抑制剂或免疫刺激剂或其他对正在治疗的疾病有效的治疗联合。可与用于治疗癌症或自体免疫疾病的adc联合给药的有用的其他试剂的类别包括例如，在癌细胞上表达的其他受体的抗体，抗微管蛋白剂(例如，澳瑞他汀)，dna小沟结合剂，dna复制抑制剂，烷基化剂(例如，铂复合物，例如，顺铂，单(铂)，双(铂)和三核铂复合物以及卡铂)，蒽环霉素，抗生素，抗叶酸剂，抗代谢剂，化疗增敏剂，多卡米星，依托泊苷，氟化嘧啶，离子载体，脂肪酸释放激素，亚硝基脲，顺铂，预形成化合物，嘌呤抗代谢剂，嘌呤霉素，放疗增敏剂，类固醇，紫杉烷，拓扑异构酶抑制剂，长春花生物碱等。
与不使用抗体的相同治疗(例如，化疗)相比，使用抗体的治疗可使患有肿瘤的患者的无进展生存期中位值或总体生存期增加至少30％或40％，但是优选地增加50％，60％至70％或甚至100％或更高，尤其是当肿瘤复发或难治时。此外或可选地，与不使用抗体的相同治疗(例如，化疗)相比，包括抗体在内的治疗(例如，标准化疗)可使患有肿瘤的患者的完全反应率，部分反应率或目标反应率(完全+部分)增加至少30％或40％，但是优选地增加50％，60％至70％或甚至100％。
通常，在临床试验(例如，ii期，ii/iii期或iii期试验)中，相对于仅接受了标准治疗的对照组患者(或加安慰剂)而言，前述接受标准治疗和抗体治疗的患者的无进展生存期中位值和/或反应率的增加是统计学上显著的，例如，p＝0.05或0.01或甚至0.001。完全反应率和部分反应率由癌症临床试验中普遍使用的客观标准来确定，例如，国家癌症研究所和/或食品药品监督局所列出的或接受的标准。
虽然为了清楚理解起见对本发明做了详细描述，但是在所附的权利要求的范围内可对本发明做出一些修改。本申请中引用的所有公开出版物，登记号，网站，专利文件等等的全部内容通过引用并入本文，这与单独引用这些参考文献的程度相同。不同的信息与不同时间的引用相关，申请信息是指有效申请日期。有效申请日期是公开了登记号的最早优先权申请的日期。除非另有明确说明，本发明的任何元件、实施方式、步骤、特征或方面可与任何其他元件、实施方式、步骤、特征或方面联合实施。
实施例
抗体的表达和纯化
含有igg1fc突变的dna链可使用gibsonassembly被克隆至表达载体。半胱氨酸突变质粒连同相应的轻链被转染至freestylecho-s细胞并在9天后收获得到的上清液。重链中含有半胱氨酸突变的抗体可通过mab选择蛋白a亲和性柱进行纯化。
多糖分析
使用反相(rp)uplc-ms对半胱氨酸工程化抗体的质量和多糖含量进行评估。使用dtt还原抗体并且随后分析进行了去糖基化处理(pngase)的抗体和未进行去糖基化处理(pngase)的抗体。
马来酰亚胺和tubulysin的稳定性分析
为了评价马来酰亚胺的水解和稳定性，使用vcmmae偶联半胱氨酸工程化的抗体并随后在大鼠血浆中孵育0天，4天和7天。adc使用抗-人捕获树脂由血浆中纯化，使用dtt还原并随后使用rpuplc-ms进行分析。马来酰亚胺的水解通过分析含有药物的重链并评估18道尔顿的质量增加来识别。马来酰亚胺的稳定性通过在每个时间点比较dar(药物抗体比例)来评估。药物损失被测量为1317道尔顿的损失并基于t＝0的总药物计算为保留的总药物的百分数。
为了评价tubulysin的稳定性，使用tubulysinm偶联半胱氨酸突变的抗体并随后在大鼠血浆中孵育0天，4天和7天。adc使用抗人捕获树脂由血浆中纯化，还原并随后使用rpuplc-ms进行分析。tubulysin醋酸酯的水解通过分析包含药物的重链并评估42道尔顿的质量损失来识别。
细胞培养
hep3b，hepg2和huh7细胞获自atcc。jhh-7细胞获自creativebioarray。hep3b和hepg2细胞在37℃，湿度为5％co2的孵育器内，含有10％fbs的emem中生长。huh7细胞在37℃，湿度为5％co2的孵育器内，含有10％fbs的dmem中生长。jhh-7细胞在37℃，湿度为5％co2的孵育器内，含有10％fbs的williams-e中生长。
体外细胞毒性
在384孔组织培养物处理的平板中进行分析并且使用celltiter
体内抗肿瘤活性
动物研究根据实验动物管理和使用委员会的规程进行。2.5x106hep3b细胞或5x105jhh-7细胞皮下移植至无胸腺裸鼠。通过双边游标卡尺测量在整个研究过程中监控肿瘤生长并且使用方程式(0.5×[长度×宽度2])计算平均肿瘤体积。当肿瘤达到约100mm3时，将小鼠随机分配至标明的治疗组并腹膜内给药单次200μl合适的治疗剂量。对于hep38研究而言，每个治疗组由5个小鼠构成。对于jhh-7研究而言，每个治疗组由6个小鼠构成。每周两次测量肿瘤并在肿瘤达到1000mm3时处死动物。
结果
如图1所示，基于对位置297的多糖链的物理接近，选择20个突变作为潜在的偶联位点。多糖链被认为可用于遮挡连接至偶联位点的疏水药物。成功地表达和偶联了14个突变。选择8个突变与s239c结合，作为双突变。对双突变进行表达和结合。
图2显示了不同突变的多糖分布。主要为g0的多糖分布是优选的，还有少量的g1，g2和其他多糖分布。因此，a295c的多糖分布是有优势的(例如，k246c，q294c，y296c，v303c，k334c，i336c和s337c)，而r301c，f243c，v262c，v264c，s267c是没有优势的。
偶联至tubulys的抗体在37℃下在大鼠血浆中浸泡7天。随后，使用质谱对adc进行纯化并且评估药物降解。粗血浆混合物使用体外细胞毒性分析评估效力损失。
图3表示了q295c显示了马来酰亚胺连接体的中间体稳定性。s239c显示所测试的突变的最大马来酰亚胺稳定性。
图4表示了q295c还显示tubulysin药物的中间体稳定性。而且，s239c显示所测试的突变的最大马来酰亚胺稳定性。
图5表示了其中一个突变为s239c的几个双突变组合的tubulysin稳定性。q295c显示了相对于所测试的其他突变的中间体稳定性。然而，s239cq295c双突变的稳定性高于图6柱状图所代表的单个突变所预期的稳定性。
图7显示了各种不同的双突变组合分别对两种癌细胞系的细胞毒性。s239cq295c双突变显示了中间体细胞毒性。
s239cq295c双突变的细胞毒性使用相同抗体的各种不同的其他偶联物在小鼠异种移植物模型中进行如下比较：
4830(8)[at]1mg/kg
5937(4)2mg/kg
s239ck246c-5937(4)2mg/kg
s239ck290c-5937(4)2mg/kg
s239ck295c-5937(4)2mg/kg
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s239ck246cv303ck295c-5937(8)1mg/kg
1-6183(8)1mg/kg
无论装载的药物的化学计量如何，剂量显示出均递送等摩尔的药物。
图8显示了偶联至tubulysin的s239cq295c双突变对肿瘤hep3b-8显示出最大肿瘤生长抑制。图9表示对jhh-e肿瘤细胞系的相同结果。
双突变的多糖分析
含有单点突变s239c或q295c的抗体包含经典糖基化模式(图10a至d)。突变s239c和q295c的配对产生异常n连接的多糖。这些异常多糖(表1)包括高唾液酸化作用(hypersialyation)以及三个和四个触角侧链glcnac。这说明这些糖基化模式使用瞬时(图10d)和稳定(图11)cho细胞生成技术而保留。此外，s239c与e294c的配对也说明了这种类似的糖基化模式(图12)。
通过非还原的rp-ms和非还原肽绘图(图13)对这些分子的分析表明在非常靠近n连接的多糖的工程化的半胱氨酸位点的链内二硫固定。这些抗体的常规还原和还原氧化消除了这种固定并留下工程化的位点，用于与保留的异常多糖偶联。
使用dtt(二硫苏糖醇)的细胞培养
含有双突变s239c和q295c的抗体在还原条件下瞬时表达。dtt，tcep和β-巯基乙醇(bme)在细胞培养基中用作还原剂，其总浓度为0.1，1.0和1.2mm(图14)。这些蛋白质的多糖模式的分析表现出在使用dtt作为培养基的一部分时还原多糖复合物。dtt浓度的增加与唾液酸化作用中的还原以及多糖的三个和四个触角分支中的还原相关联。在这些还原条件下表达的抗体看起来通过sec成为单体并且具有与母体抗体类似的结合。这些抗体的还原和氧化留下工程化位点，用于与母体抗体偶联。
s239c/q295c抗体的糖基化模式不受细胞表达系统的影响。当抗体在稳定转染的细胞系和瞬时转染的细胞系中表达时，糖基化模式本质上相同。参见例如，下表1。
表1：s239c/q295c突变的瞬时表达和稳定表达的糖基化作用分析
序列表
igg1(seqidno：1)
igg2(seqidno：2)
igg3(seqidno：3)
igg4(seqidno：4)
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igg2(seqidno：18)
igg3(seqidno：19)
igg4(seqidno：20)
序列表
<110>西雅图遗传学公司
安德鲁·维特
克里斯·莱斯克
特拉维斯·比歇勒
姜戈·苏斯曼
帕特里克·伯克
乔斯林·莱斯克
<120>用于偶联的半胱氨酸突变抗体
<130>057762-508682
<150>us62/465,129
<151>2017-02-28
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