包含乌饭树叶提取物的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物的制作方法

本发明涉及一种包含乌饭树(vacciniumbracteatumthunb.)叶提取物的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物，更具体地，涉及可通过利用作为天然原料的乌饭树叶提取物来无毒性、无副作用地且可安全使用的一种用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物。

背景技术：

将当人们在心理或身体上处于难以承受的情况时所感受到的不安和危险情绪称为应激，作为应激反应，出现不安、抑郁、焦虑等心理反应或食欲不振等身体反应。

抑郁症是一种以意志低落和抑郁感为主要症状来引起各种认知及精神上、身体上的症状并导致日常功能下降的疾病。抑郁障碍是一种导致感情、思想、身体状况以及行为等发生变化的严重疾病，从而影响个人整体生活。抑郁症与暂时的抑郁感不同，无法用个人的懦弱表现或意志来消除。

抑郁障碍是非常常见的精神疾病之一，从根据国家的比较中表现出患病率的差异。相比于美国或欧洲、新西兰等国家的主要忧郁障碍终生患病率高达10.1％～16.6％，包括韩国或中国在内的非西方国家的患病率则为5％以下的低水平。

2011年的韩国保健福祉部的精神疾病流行病学调查显示，主要抑郁症的终生患病率为6.7％，年患病率为3.1％，比2006年的流行病学的结果略高，但低于西方国家的水平，处于与非西方国家相似或略高的水平。关于抑郁症的明确原因尚不清楚，但如同其他精神疾病，各种生化、遗传以及环境因素都可导致抑郁症。抑郁症与其他疾病不同，若接受专家的适当治疗，则可预计抑郁症好转，并且可以恢复如往的正常生活。

另一方面，乌饭树为属于杜鹃花目的双子叶植物，生长于海边的山地。乌饭树高1～3m，幼枝呈灰褐至红色，几乎无毛。叶是交替的叶序且厚实，呈椭圆形或长椭圆形，具有革质。边缘具有稀疏锯齿，后基部有小腺体，6月份开花呈红白色，下垂的总状花序中开着钟状花10余朵，留有苞片。果实为浆果，呈圆形，上面覆盖着白色粉末，直径约6mm，10月份成熟，可食用。

最近，随着现代人的生活水平的提高，对几乎没有副作用且可从自然中采取的自然资源的兴趣日益增加。尤其，随着积极进行对含有人体所需的营养素或对疾病的预防和恢复有特殊帮助的天然功能性物质的健康食品的研究，对乌饭树或其功能的调查正在实施当中，但至今为止，营养学价值或生理活性功能的相关信息仍然不足。

技术实现要素：

技术问题

为了提供生理活性功能尚不明确的作为天然资源的乌饭树的功能食品组合物及药学组合物，本发明提供包含通过从乌饭树果中提取有效成分来以无毒性、无副作用地且可安全使用的乌饭树叶提取物作为有效成分的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物。

解决问题的手段

本发明提供利用作为韩国天然资源的乌饭树叶提取物来无毒性、无副作用地且可安全使用的一种用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物。

在用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物及功能性食品组合物的提取方法中，向400g的乌饭树叶中添加8l的蒸馏水，并利用流提取器使温度从100℃升温后，对通过进行3小时的加热、萃取来对获得的提取物进行减压过滤后，通过减压浓缩来获得31.52g的浓缩液。

本发明提供以0.01重量百分比至99.9重量百分比的量包含可溶于上述水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或它们的混合溶剂中的一种的提取物作为有效成分的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物。上述组合物可制备成选自片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、液剂或饮料中的一种以上的形态。

发明的效果

本发明的乌饭树叶提取物减少四肢完全不动的不动时间，因此抗抑郁效果突出，且相比于80％的甲醇提取物，在热水提取物中呈现出更高的抗抑郁效果，因此其可用作用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物，并且，利用栖息于自然的植物替代生产原料，因此可以降低制造生产成本并预期通过工业化来替代进口及出口效果。

附图说明

图1为示出在针对将本发明的乌饭树叶提取物给药1天的小鼠的强迫游泳实验(forcedswimmingtest，fst)中，对对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠的不动时间(immobilitytime)、游泳时间(swimmingtime)、爬升时间(climbingtime)进行比较的图形。

图2为示出在针对将本发明的乌饭树叶提取物给药6天的小鼠的强迫游泳实验中，对对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠的不动时间、游泳时间、爬升时间进行比较的图形。

图3为示出对于给药乌饭树叶提取物的小鼠的应激激素水平，将对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠进行比较的图形。

图4为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠中本发明的乌饭树叶提取物对强迫游泳实验的效果的图形。

图5为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠中本发明的乌饭树叶提取物对开场实验(openfieldtest，oft)的效果的图形。

图6为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠中本发明的乌饭树叶提取物对应激激素水平的效果的图形。

图7为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠的海马(hc)部位中本发明的乌饭树叶提取物对作为神经传达物质的血清素、去甲肾上腺素、多巴胺水平的效果的图形。

图8为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠的前额叶皮质(pfc)部位中本发明的乌饭树叶提取物对作为神经传达物质的血清素、去甲肾上腺素、多巴胺生成的效果的图形。

图9为示出本发明的乌饭树叶提取物对sh-sy5y细胞(神经母细胞瘤(neuroblastoma)、人多巴胺能神经细胞(humandopaminergicneuronalcell))的细胞毒性程度以及对通过进行作为精神应激激素的皮质酮(corticosterone)处理来诱导神经细胞毒性的神经细胞保护效果的图形。

图10为示出本发明的乌饭树叶提取物通过pi3k/akt及pka/erk信号通路(signalingpathway)来呈现出神经细胞保护效果的图形。

图11为示出本发明的乌饭树叶提取物在5-ht6受体基因被表达的细胞系中抑制由5-ht诱导的细胞内camp的增加的效果的图形。

图12为示出本发明的乌饭树叶提取物在5-ht2a受体基因被表达的细胞系中抑制由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加的效果的图形。

具体实施方式

1.乌饭树叶热水提取物的制备

向400g的乌饭树叶中添加8l的蒸馏水，并利用回流提取器使温度从100℃升温后，进行3小时的加热、萃取。将获得的提取物减压过滤后进行减压浓缩，获得31.52g的浓缩液。

2.乌饭树叶80％甲醇提取物的制备

向20g的乌饭树叶中添加20l的80％甲醇，并利用回流提取器使温度从100℃升温后，进行3小时的加热、萃取。将获得的提取物减压过滤后进行减压浓缩，获得6.99g的浓缩液。

3.实验动物及饲养

从(株)桑塔科(samtaco，韩国(korea))购买6周龄的雄性icr小鼠来作为用于测定乌饭树叶提取物的抗抑郁效果的实验动物，并将小鼠在动物饲养室以恒定条件(温度：22±2℃，湿度：50±5％，明暗度：12小时光照/黑暗循环(light/darkcycle))适应一周后使用。

4.利用乌饭树叶提取物的正常小鼠中的抗抑郁动物行为实验

给雄性icr小鼠口服本发明的乌饭树叶提取物，并且作为比较组，口服用作抗抑郁剂的艾司西酞普兰草酸盐。根据实验给药1天或6天。

强迫游泳实验作为本实验(post-swim)的前一天进行的预实验(pre-swim)，在圆柱形水槽(直径20cm，高40cm)中将25℃左右的自来水从槽底倒入至15cm后，将小鼠放入水中并使强迫游泳15分钟，从水中捞出后用干毛巾擦干并送回饲养箱。给药1天或6天后，进行了本实验，将小鼠放入水中并使其强迫游泳6分钟，同时进行了影像拍摄。在记录的影像中，除了最初1分钟之外，将其余5分钟的动物行为分为3种进行分析，即，分为动物将包括脸在内的上身的一部分露出水面并仅作出轻微的动作而漂浮在水面的行为(浮动姿势，immobilitybehavior)，随着向水平方向移动水槽周围并作出用前脚和后脚打水的行为(游泳，swimmingbehavior)，以及朝向墙壁将前脚踢向水面外稍微剧烈地移动并作出刮墙壁的行为(爬升，climbingbehavior)后测定了各个时间。

图1为示出在针对将本发明的乌饭树叶提取物给药1天的白鼠的强迫游泳实验法中，对对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠的不动时间、游泳时间、爬升时间进行比较的图形。如图1所示，在将各给药1天后进行强迫游泳的期间，与对照组(234.59±5.95秒)相比，在给药艾司西酞普兰草酸盐的比较组中的不动时间为194.65±11.55秒，在给药乌饭树叶的热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的不动时间分别为155.14±11.14秒、173.78±6.95秒，在给药乌饭树叶的80％甲醇提取物(vbl80％m100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的不动时间分别为191.83±5.21秒、189.81±11.41秒，乌饭树叶的热水提取物给药组中呈现出显著性减少(p＜0.05)。而且，与对照组(3.34±0.88秒)相比，在给药艾司西酞普兰草酸盐的比较组中的爬升时间为12.43±3.47秒，在给药乌饭树叶的热水提取物(100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的爬升时间分别为21.50±3.02秒、15.87±1.72秒，在给药乌饭树叶的80％甲醇提取物(100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的爬升时间分别为25.45±2.64秒、15.22±2.48秒，其呈现出显著性增加(p＜0.05)。

图2为示出在针对将本发明的乌饭树叶提取物给药6天的白鼠的强迫游泳实验法中，对对照组与艾司西酞普兰草酸盐给药组的小鼠的不动时间、游泳时间、爬升时间进行比较的图形。如图2所示，在将各给药6天后进行强迫游泳的期间，与对照组(245.48±4.05秒)相比，在给药艾司西酞普兰草酸盐的比较组中的不动时间为169.65±7.15秒，在给药乌饭树叶的热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的不动时间分别为125.85±7.90秒、91.66±12.86秒，在给药乌饭树叶的80％甲醇提取物(vbl80％m100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的不动时间分别为166.34±8.36秒、198.01±4.73秒，乌饭树叶提取物给药组中呈现出显著性减少(p＜0.01和p＜0.001)。

而且，与对照组(51.82±3.38秒)相比，在给药艾司西酞普兰草酸盐的比较组中的游泳时间为128.16±6.65秒，在给药乌饭树叶的热水提取物(100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的游泳时间分别为168.56±7.28秒、198.95±14.33秒，在给药乌饭树叶的80％甲醇提取物(vbl80％m100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的游泳时间分别为123.06±7.69秒、100.71±4.688秒，其呈现出显著性增加(p＜0.01和p＜0.001)。

如上所述，由于本发明的乌饭树叶提取物减少四肢完全不动的不动时间，因此抗抑郁效果突出，且相比于80％的甲醇提取物，在热水提取物中呈现出更高的抗抑郁效果。

5.利用乌饭树叶提取物的在正常小鼠血清中作为应激激素的皮质酮的测定

在正常状态下，从给药各药物6天后开始，通过从小鼠分离血清(serum)并使用亚诺法(abnova)公司的酶联免疫试剂盒(elisakit)根据制造商的指示测定了对作为应激激素的皮质酮的浓度变化产生的影响。

图3为在给药乌饭树叶提取物的小鼠中测定作为应激激素的皮质酮的结果，当比较乌饭树叶的热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kg)给药组与对照组(control，1943.10±175.29pg/ml)时，在给药艾司西酞普兰草酸盐的比较组中的作为应激激素的皮质酮的指数为764.57±97.50pg/ml，在给药乌饭树叶的热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的作为应激激素的皮质酮的指数分别为396.22±75.73pg/ml、218.26±34.16pg/ml，在给药乌饭树叶的80％甲醇提取物(vbl80％m100mg/kg及200mg/kgp.o)的比较组中的作为应激激素的皮质酮的指数分别为608.10±121.11pg/ml、420.92±99.83pg/ml，应激激素浓度呈现出显著性减少(p＜0.05和p＜0.01)。

如上所述，由于本发明的乌饭树叶提取物减少由强迫游泳实验法导致增加的应激激素，因此显著地减少由应激导致增加的皮质酮水平(corticosteronelevel)。

6.利用乌饭树叶提取物的慢性束缚应激(chronicrestraintstress，crs)中的抗抑郁郁动物行为实验

购买雄性icr小鼠后，将小鼠放入高度为20cm、直径为7cm的压克力箱中每天施加6小时的慢性束缚应激(crs)并持续3周。按各浓度每天在相同的时间在施加束缚应激30分钟之前口服乌饭树叶的热水提取物，向对照组中给药相同体积的盐水(saline)，作为比较组，口服用作抗抑郁剂的艾司西酞普兰草酸盐。在结束3周的由束缚应激施加产生的刺激的第二天，进行了动物行为评价，在评价强迫游泳实验之前，先测定了开场实验。结束强迫游泳实验评价后，进行解剖来采集全血并立即分离摘取的脑组织海马(hippocampus)和前额叶皮质(prefrontalcortex)，在－70℃的温度下进行保管来用于实验。

图4为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠中本发明的乌饭树叶提取物对强迫游泳实验的效果的图形。如图4所示，在结束3周的慢性束缚应激施加和各个药物的处理的第二天执行强迫游泳实验结果，与对照组(224.22±1.99秒)相比，束缚应激组(crs)中的不动时间为252.29±4.67秒，处理艾司西酞普兰草酸盐(eo10mg/kgp.o)的阳性对照组中的不动时间为154.74±14.80秒，处理乌饭树叶热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)的阳性对照组中的不动时间分别为127.81±18.28秒、183.49±15.27秒，其呈现出显著性减少(p＜0.05)。而且，与对照组(74.95±1.90秒)相比，束缚应激组中的游泳时间为46.67±4.29秒，处理艾司西酞普兰草酸盐(eo10mg/kgp.o)的阳性对照组中的游泳时间为146.58±14.84秒，处理乌饭树叶热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)的阳性对照组中的游泳时间分别为172.40±18.31秒、116.91±15.11秒，其呈现出显著性增加(p＜0.05)。并且，与对照组(37.06±8.90秒)相比，束缚应激组中的爬升时间为10.43±3.37秒，处理艾司西酞普兰草酸盐(eo10mg/kgp.o)的阳性对照组中的爬升时间为105.23±15.37秒，处理乌饭树叶热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)的阳性对照组中的爬升时间分别为92.93±11.98秒、79.50±20.75秒，其呈现出显著性增加(p＜0.05)。

开场实验作为测定实验动物的活动性的评价法，是确认动物的活动性对药物的抗不安及抗抑郁作用产生的效果的实验方法。开场实验箱为将底面划分为25份的直径60cm×高度20cm的四方形箱子，在其中每次放入一只实验动物来测定实验动物自主移动格的次数，由此，利用各组的平均值来比较活动性。

图5为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠中本发明的乌饭树叶提取物对开场实验的效果的图形。如图5所示，与对照组(133.09±1.86格)相比，束缚应激组(crs，88.00±4.82格)移动格的次数减少，与此相反，处理艾司西酞普兰草酸盐和乌饭树叶热水提取物(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)的阳性对照组移动格的次数分别为182.73±5.60格、147.00±3.64格、158.22±2.64格，因此可确认，相比于束缚应激组，活动性增加(p＜0.01和p＜0.001)。

7.利用乌饭树叶提取物的慢性束缚应激中的血清中应激激素及海马和前额叶皮质中神经传达物质测定

在施加3周的由束缚应激刺激和给药的第二天，确认了与应激相关的血清皮质酮水平和摘取的脑的海马和在前额叶皮质中对神经传达物质(血清素(serotonin)、多巴胺(dopamine)、去甲肾上腺素(norepinephrine))产生的影像。

如图6所示，与对照组(ctl)相比，束缚应激组(crs)中的血清皮质酮指数显著地增加(p＜0.05)，与束缚应激组相比，乌饭树叶的热水提取物组(vblw100mg/kg及300mg/kgp.o)中的作为应激激素的皮质酮水平显著地减少(p＜0.05)。

图7及图8为示出在由慢性束缚应激诱导的小鼠的海马和前额叶皮质部位中本发明的乌饭树叶提取物对作为神经传达物质的血清素、去甲肾上腺素、多巴胺水平(levels)的效果的图形。

如图7所示，可确认，与对照组(ctl)相比，在海马部位中的神经传达物质(血清素、去甲肾上腺素、多巴胺)的水平在束缚应激组(crs)中出现减少的趋势，与束缚应激组相比，血清素和去甲肾上腺素的水平在乌饭树叶的热水提取物组(vblw100mg/kgp.o)中出现显著增加的趋势(p＜0.05)，而多巴胺的水平在乌饭树叶的热水提取物组(100mg/kg及200mg/kgp.o)中显著地增加(p＜0.05和p＜0.01)。

如图8所示，与对照组(ctl)相比，在前额叶皮质中的神经传达物质(血清素、去甲肾上腺素、多巴胺)的水平在束缚应激组(crs)中显著地减少(p＜0.05和p＜0.01)，与束缚应激组相比，血清素和多巴胺的水平在乌饭树叶的热水提取物给药组(vblw100mg/kgp.o)中显著地增加(p＜0.01)。与束缚应激组相比，去甲肾上腺素的水平在乌饭树叶的热水提取物给药组(vblw100mg/kg及200mg/kgp.o)中出现增加的趋势，但没有显著性差异。

8.利用乌饭树叶提取物的在作为脑神经细胞的sh-sy5y细胞中应激缓解活性确认

将sh-sy5y细胞(神经母细胞瘤、人多巴胺能神经细胞)在含有1％抗真菌剂/抗生素(antimicotics/antibiotics)和10％胎牛血清(fbs)的最低必需培养基(mem)中培养，在96-孔板(wellplate)中接种使得细胞数为10⁵cell/ml后，培养了24小时。为了确定乌饭树叶提取物对神经细胞的细胞毒性，按浓度进行处理。在对乌饭树叶的热水提取物处理24小时后，用mtt比色法(mttassay)测定了细胞存活率。

图9的(a)部分中，通过测定乌饭树叶提取物的细胞毒性(cytotoxicity)来设定了使用浓度的最大安全范围。通过以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml的乌饭树叶的热水提取物浓度处理来确认作为所使用细胞系的sh-sy5y细胞的细胞毒性，与对照组(0μg/ml)相比，在1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml的浓度下未发现显著性差异。然而，在100μg/ml的浓度下，与对照组相比，细胞存活率降低(p＜0.05)。作为本实验结果，在30μg/ml内进行了实验。

为了从细胞水平上确认乌饭树提取物的精神应激的抵抗活性，为了确认对作为应激激素的皮质酮诱发的神经细胞损伤的保护效果而进行了实验。所使用细胞系为sh-sy5y细胞，将皮质酮按浓度处理24小时来确认细胞毒性，确定呈现出50～60％的细胞毒性的浓度后将其用于实验中(datanotshown)。对于乌饭树叶提取物的神经细胞保护效果实验，将实验细胞系分成96孔微量培养板(96-wellmicroplate)培养24小时，然后将乌饭树叶提取物处理2小时，并处理1mm的皮质酮来培养24小时。24小时后，利用mtt比色法测定细胞存活率(cellviability)。

图9的(b)部分为通过处理作为精神应激激素的皮质酮来示出乌饭树叶提取物对神经细胞损伤的神经细胞保护效果的图形。皮质酮的使用浓度为50～60％，试验中使用了呈现细胞毒性的1mm的量，并且可确认，当与皮质酮一起处理乌饭树叶的热水提取物时，在3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml的浓度下，细胞存活率显著增加(p＜0.01)。

为了确认乌饭树叶提取物对由皮质酮诱导的神经细胞损伤的神经细胞保护效果的作用信号通路而进行了实验。所使用细胞系为sh-sy5y细胞，对细胞预处理1小时的磷酸肌醇3-激酶(pi3k，phosphoinositide3-kinase)、mtor、蛋白激酶a(pka，proteinkinasea)以及作为mapk/erk激酶通路(kinasepathway)的药理学抑制剂(pharmacologicalinhibitors)的渥曼青霉素(wortmanin)、雷帕霉素(rapamycin)、h89及pd98059后，处理2小时的乌饭树叶的热水提取物(3μg/ml)。药物处理2小时后，处理皮质酮(1mm)24小时，然后，利用mtt比色法测定细胞存活率。

图10为在处理pi3k、mtor、pka及mapk/erkkinase(mek)的药理学抑制剂的状态下示出乌饭树叶的热水提取物对神经细胞保护效果产生的信号通路的图形。

仅处理实验中所使用的抑制剂(inhibitor)来确认了对细胞存活产生的效果，在除了处理作为pi3k抑制剂的渥曼青霉素之外还处理了mtor抑制剂(雷帕霉素)、pka抑制剂(h89)、mapk/erkkinase(mek)抑制剂(pd98059)24小时的状态下，没有出现细胞毒性。与处理皮质酮的组(54.45±4.04％)相比，处理3μg/ml浓度的乌饭树叶的热水提取物(vblw)的组中产生75.21±1.75％的保护效果(p＜0.05)。与处理皮质酮及乌饭树叶的热水提取物的组相比，在处理药理学抑制剂、乌饭树叶的热水提取物以及皮质酮的组中，产生pi3k抑制剂(44.84±1.40％，p＜0.001)、mtor抑制剂(52.46±2.82％，p＜0.01)、pka抑制剂(51.08±2.27％，p＜0.05)、mek抑制剂(50.34±2.31％，p＜0.01)的效果，因此可确认到，显著地隔离神经细胞保护效果。

因此，以上述结果为基础，乌饭树叶的热水提取物对由皮质酮诱导的细胞损伤中通过pi3k/akt及pka/erk信号通路来产生神经细胞保护效果。

9.利用乌饭树叶提取物的在5-ht6受体基因被表达的细胞系中cyclicamp的活性测定

从珀金埃尔默(perkinelmer)公司购买人5-羟色胺6受体基因(humanserotonin5-ht6receptorgene)被表达的稳定型人星形细胞瘤(stablyhumanastrocytoma)1321n1细胞作为细胞系，培养细胞24小时后，去除上清液，用包含磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesteraseinhibitors)ibmx(0.5mm)和ro20-1724(0.1mm)的1xpbs更换培养基后，按浓度处理乌饭树叶的热水提取物30分钟来测定所获得的细胞裂解产物(celllysate)(药物单独试样)。并且，处理乌饭树叶提取物15分钟后，按照r&dsystemscampassaykit实验方法对处理15分钟的100μm的5-ht的细胞裂解产物(药物预处理试样，药物+5-ht)进行测定。

如图11所示，可确认，当单独处理乌饭树叶的热水提取物时，没有对cyclicamp活性产生效果。在按各浓度处理乌饭树叶的热水提取物15分钟后处理15分钟的5-ht的结果中，当仅处理5-ht(100μm)时，将camp活性看做0进行计算的结果，在5-ht6受体-特异性(specific)增加的cyclicamp中乌饭树叶的热水提取物对5-ht6受体产生反协同效应(antagonistic-effect)。

10.利用乌饭树叶提取物的在5-ht2a受体基因被表达的细胞系中细胞内ca²⁺的活性测定

从atcc购买cho-k1细胞系(chinesehamsterovarycell)，使用培养液(rpmi1640、10％的胎牛血清(fetalbovineserum)、100iu/ml的青霉素(penicilin)、100μg/ml的链霉素(streptomycine))在96孔黑壁/透明底(96-wellblackwall/clearbottom，bdfalcon)中分裂细胞后，在37℃、5％co2培养箱(incubator)中培养了24小时。利用等离子体变换试剂脂质体2000(lipofectamine2000)，将血清素2a受体(5-ht2areceptor)的每个cdna在细胞中瞬时表达48小时的细胞用于实验。用hepes缓冲溶液(155mm的nacl、2mm的cacl2、1mm的mgcl2、3mm的kcl、10mm的hepes、10mm的葡萄糖、ph7.4)对荧光染色之前的细胞洗涤一次，然后，使用用于测定细胞内钙浓度的荧光染料对fura-2/am以最终5μm浓度处理，在37℃、5％co2培养箱中以遮光状态反应了60分钟。60分钟后，用hepes缓冲溶液洗涤一次，然后使用高通量系统(hts)测定细胞内钙浓度使得340/380nm光以选择性地暴露，之后使用数字荧光分析仪测定经分析的340/380nm比(ratio)值。由于细胞中的fura-2/am在与ca²⁺结合状态下在340nm激发，在未结合状态下在380nm激发，因此，340/380nm比值的增加意味着与细胞内ca²⁺结合的fura-2/am变多。

将处理100μm的血清素(5-ht)来获得的值使用于对照组，将乌饭树叶的热水提取物以1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml的浓度预处理1分钟后，通过处理100μm的5-ht来确认细胞内钙的含量变化。作为参考，在图10中各项的误差条上显示的数字表示实验中使用的细胞数量。

图12为示出本发明的乌饭树叶的热水提取物将在5-ht2a受体基因被表达的细胞系中使由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加浓度依赖性地抑制的效果的图形。乌饭树叶的热水提取物在5-ht2a受体中由5-ht诱导的细胞内ca²⁺的增加过程中，与5-ht相比，通过抑制细胞内ca²⁺浓度来确认5-ht2a受体的反协同效应。如图10所示，与处理5-ht(100μm)的对照组相比，在处理1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml的乌饭树叶的热水提取物的组中，分别为16.23±2.03％、27.33±1.35％、45.00±1.22％、56.73±2.23％、62.31±1.10％，因此可确认到，抑制由5-ht2a受体-特异性血清素诱导的细胞内ca²⁺。

11.利用乌饭树叶提取物的药剂或保健食品的制备

将乌饭树叶提取物作为有效成分的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物可制备成片剂及胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、液剂的形态。根据另一适当的实施方式，上述组合物可以制备成饮料添加剂。上述用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药剂或保健食品可剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶、硬皮剂、栓剂或灭菌注射用液来制备，以包含0.01重量百分比至99.9重量百分比的组合物，其将乌饭树叶提取物作为有效成分。

在灭菌注射液的情况下，可通过包含0.01重量百分比至99.9重量百分比的上述药物组合物，并混合99.9重量百分比至0.01重量百分比的纯净水或葡萄糖来制备，在胶囊剂的情况下，可通过将上述药物组合物冻干，以包含0.01重量百分比至99.9重量百分比，并混合99.9重量百分比至0.01重量百分比的维生素剂和钙制剂来制备。

上述制备的药物组合物的日剂量为含有上述提取物100mg/kg至200mg/kg体重的含量，并且可制备成包含0.01重量百分比至99.9重量百分比的上述药物组合物的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的保健功能食品。

产业上的可利用性

本发明提供包含乌饭树叶提取物作为有效成分的用于预防或治疗应激性疾病及抑郁症的药学组合物，从而利用栖息于自然的植物替代生产原料，可以降低制造生产成本并预期通过工业化来替代进口及出口效果，因此具有产业上可利用性。