靶向TRPV1的含月桂烯和大麻素的组合物的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月22日提交的美国临时申请号62/509,546的权益，出于所有目的，该临时申请的全部公开内容通过引用整体结合于此。
1.
背景技术：
瞬时受体超家族(trp)的通道，诸如trpv1、trpm8和trpa1，是将钙和钠传导到哺乳动物的多种细胞类型中的非选择性阳离子通道。它们存在于感觉神经元上，由于它们在分子水平上对为拟痛药(nociomimetic)的植物次生代谢产物(例如辣椒素)以及对刺激性和模拟性灼热或凉爽感的化合物(例如大蒜素、肉桂醛、薄荷醇)的响应能力，最初被鉴定为在伤害感受中起作用。
由于其在伤害感受中的作用，trp通道已被鉴定为治疗疼痛紊乱的靶标。trp通道的拮抗和激动均已用于疼痛控制。例如，trpv1拮抗剂在急性镇痛方面具有实用性。对于慢性疼痛控制，通常使用trpv1激动剂。后一策略利用了持续的trpv1受体激动导致细胞表面脱敏(受体内化、降解和再循环)这一事实。trpv1的长时间激动还导致含trpv1的感觉神经元的钙和钠阳离子超负荷，从而导致细胞死亡。
在实践中，使用trpv1激动剂来实现脱敏涉及随着时间向患处反复局部施用高水平的众所周知的trpv1激动剂辣椒素。这种治疗方法具有功效和低成本的优点。但是，它也有缺点。
第一，高亲和性和高特异性trpv1激动剂仅靶向含trpv1的伤害感受器，而疼痛中涉及的其他感觉神经元和trp通道则未受影响。第二，使用高亲和性和高特异性的trpv1激动剂(诸如辣椒素)会在初期治疗期间(脱敏之前的时段)引起高水平的不适感。正是出于这个原因，因该疗法对敏感区域(诸如胃粘膜和生殖道粘膜)的治疗具有高度刺激性，目前无法使用trpv1介导的脱敏来解决疱疹后疼痛。第三，辣椒素介导的脱敏治疗限于局部使用；这种疗法不能解决内脏痛、头痛和某些肌肉骨骼疼痛紊乱。
因此，需要亲和性低于辣椒素的治疗性trpv1配体，诸如trpv1激动剂。这种较低亲和性的配体应在脱敏期间减轻疼痛，从而可以局部治疗敏感的身体部位。需要trpv1配体具有更宽的靶标特异性、能够靶向多种类型的带有trp的伤害感受器，从而提高组织脱敏度。除局部应用外，还需要适合全身施用的trpv1配体。
这样的新药物还可用于治疗与trpv1相关的除了疼痛之外的各种疾病。尽管trp通道最初显示出与疼痛和伤害感受有关，但现在已知它们还具有多种其他生理作用，这表明它们可以成为治疗其他疾病的靶标。例如，trp通道已被确定为治疗心血管疾病的靶标；在小鼠模型中，trpv1的靶向药理抑制作用已显示显著减少心脏肥厚。参见美国专利no.9,084,786。因此，预期通过用trpv1激动剂使受体脱敏而长期下调trpv1水平会类似地保护并潜在地挽救心脏肥厚及其相关症状和结果(心脏重塑、心脏纤维化、凋亡、高血压或心力衰竭)。然而，目前尚不存在适用于全身施用和适用于在内脏器官中长期下调trpv1的trpv1激动剂，因此需要以与上述慢性疼痛方法类似的方式开发此类方法。
因此，需要寻找充当trpv1拮抗剂和trpv1激动剂的新化合物。这样的新化合物将提供新颖且更有效的治疗与trpv1通道相关的各种疾病的方法，所述疾病包括疼痛紊乱和心血管疾病。
2.
技术实现要素：
大麻(cannabis)已经被使用了数千年以提供镇痛并治疗各种类型的疼痛。如以下实验实施例中更全面地描述的那样，使用根据已知的医用大麻化学特征建模的萜烯和大麻素的复杂混合物，我们现已证明大麻至少部分通过trpv1受体发挥其抗伤害感受的作用。我们进一步证明，月桂烯对观察到的trpv1激动有显著贡献，并且像辣椒素一样，长时间暴露后会引起trpv1脱敏。
我们还已经证明，存在于复杂混合物中的其他萜烯和大麻素，包括那些本身没有表现出显著的trpv1激动剂活性的萜烯和大麻素，组合起来用来提高月桂烯的功效。我们已经证明，大麻样的“随行”(cannabis-like‘entourage’)起作用，至少部分地，阻止了多药耐药蛋白介导的生物活性配体月桂烯的输出。
最后，为了评估月桂烯的更广泛的治疗潜力，我们使用称为gb科学网络药理平台(“npp”)的专有计算机技术预测方法，生成了月桂烯的靶标分析和疾病预测网络。除trpv1外，网络中还存在多个trp通道，这表明月桂烯的功效可能会超出trpv1的范围，延伸至其他伤害感受神经元，其中主要的疼痛传导通道是不同的trp受体。
因此，第一方面，提供了药物组合物。该药物组合物包含月桂烯和药学上可接受的载体或稀释剂。该组合物任选地包含至少一种大麻素和/或除月桂烯之外的至少一种萜烯。该组合物包含不超过20种不同种类的大麻素和萜烯化合物，并且基本上不含thc。
在一些实施方案中，该组合物包含不超过15种的大麻素和萜烯化合物，不超过10种的大麻素和萜烯化合物，或不超过5种的大麻素和萜烯化合物。
在一些实施方案中，月桂烯的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少10％(w/w)，大麻素和萜烯的总含量的至少20％(w/w)，或大麻素和萜烯总含量的至少25％(w/w)。在某些实施方案中，月桂烯的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少50％(w/w)、75％(w/w)或至少90％(w/w)。
在一些实施方案中，药物组合物包含橙花叔醇。在这些实施方案的某些中，橙花叔醇的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少2％(w/w)，大麻素和萜烯的总含量的至少2.5％(w/w)，或甚至为大麻素和萜烯的总含量的至少5％(w/w)、7.5％(w/w)或10％(w/w)。
在一些实施方案中，药物组合物包含大麻萜酚酸(cannabigerolicacid，cbga)。在某些实施方案中，cbga的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少10％(w/w)。在特定的实施方案中，cbga的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少15％(w/w)、20％(w/w)或25％(w/w)。
在一些实施方案中，药物组合物包含大麻二酚(cbd)。在某些实施方案中，cbd的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少2.5％(w/w)。在特定的实施方案中，cbd的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少5％(w/w)、7.5％(w/w)或10％(w/w)。
在一些实施方案中，药物组合物包含次大麻二酚(cannabidivarin，cbdv)。在某些实施方案中，cbdv的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少5％(w/w)。在特定的实施方案中，cbdv的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少7.5％(w/w)或10％(w/w)。
在一些实施方案中，药物组合物包含大麻色原烯(cannabichromene)。在某些实施方案中，大麻色原烯的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少1％(w/w)、1.5％(w/w)、2％(w/w)或2.5％(w/w)。
在一些实施方案中，药物组合物包含大麻二酚酸(cannabidiolicacid，cbda)。在各种实施方案中，cbda的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少2.5％(w/w)。在某些实施方案中，cbda的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少5％(w/w)或7.5％(w/w)。
在一些实施方案中，药物组合物包含大麻萜酚(cannabigerol，cbg)。在某些实施方案中，cbg的存在量为大麻素和萜烯的总含量的至少2.5％(w/w)或5％(w/w)。
在各种实施方案中，月桂烯以0.025％(w/v)至5％(w/v)的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，月桂烯以0.025％(w/v)至2.5％(w/v)或0.025％(w/v)至1％(w/v)的浓度存在于该组合物中。
在当前优选的实施方案中，大麻素化合物和除月桂烯之外的萜烯化合物(如果存在的话)以有效增加月桂烯依赖性trpv1钙通量的量存在。
在各种实施方案中，药物组合物被配制用于局部施用。在各种实施方案中，药物组合物被配制成用于口服、经颊或舌下施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于静脉内、肌内或皮下施用。
在某些实施方案中，药物组合物被配制成用于通过吸入施用。在特定的实施方案中，药物组合物被配制成用于通过蒸发器、喷雾器或雾化器施用。
在另一方面，提供了在哺乳动物受试者的细胞中实现trpv1脱敏的方法。该方法包括通过施用途径向所述受试者施用一定量的本文所述的含月桂烯的药物组合物，并持续足以引起受试者的细胞内的trpv1脱敏的时间。
在该方法的某些实施方案中，细胞是伤害感受器。在特定的实施方案中，伤害感受器是外周伤害感受器。在特定的实施方案中，伤害感受器是内脏伤害感受器。
在该方法的各种实施方案中，药物组合物被局部施用。
在一些实施方案中，药物组合物被全身施用。在某些全身施用实施方案中，药物组合物被静脉内施用。在其他实施方案中，药物组合物被皮下施用。在其他实施方案中，药物组合物通过吸入施用。在一些实施方案中，药物组合物通过多种施用途径施用。
在另一方面，提供用于治疗哺乳动物受试者的疼痛的方法。该方法包括通过施用途径向所述受试者施用一定量的本文所述的含月桂烯的药物组合物，并持续足以引起受试者的伤害感受器的trpv1脱敏的时间。
在一些实施方案中，伤害感受器是外周伤害感受器，并且药物组合物被局部施用。在一些实施方案中，伤害感受器是内脏伤害感受器，并且药物组合物被全身施用。
在一些实施方案中，疼痛是神经性疼痛。在特定的实施方案中，神经性疼痛是糖尿病性周围神经性疼痛。在某些实施方案中，疼痛是疱疹后神经痛。
在各种实施方案中，药物组合物每天施用至少一次，持续至少3天、至少5天或至少7天。在特定的实施方案中，药物组合物每天施用至少一次，持续超过7天。
在各种实施方案中，通过施用途径施用一定剂量的药物组合物，并按照足以在伤害感受器上维持月桂烯的有效水平至少3天、至少5天或至少7天的时间表。
在另一方面，提供用于治疗哺乳动物受试者的心脏肥厚的方法。该方法包括向患有心脏肥厚的受试者施用抗肥厚有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
在典型的实施方案中，药物组合物被全身施用。在特定的实施方案中，药物组合物被静脉内施用。在某些实施方案中，药物组合物被皮下施用。在某些实施方案中，药物组合物通过吸入施用。在某些实施方案中，药物组合物被口服施用。
在相关方面，提供用于预防性治疗哺乳动物受试者的心脏肥厚的方法。该方法包括向处于心脏肥厚风险的受试者施用抗肥厚有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
在另一方面，提供治疗哺乳动物受试者的膀胱过度活动症的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物被全身施用。在一些实施方案中，药物组合物通过膀胱冲洗施用。
在又一方面，提供用于治疗哺乳动物受试者的难治性慢性咳嗽的方法。该方法包括向患有慢性咳嗽的受试者施用治疗有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物被全身施用。在一些实施方案中，药物组合物通过吸入施用。
如本文进一步所述，提供通过添加大麻素和萜烯的专有混合物来增强诸如月桂烯的主要治疗剂的比活性的方法。不希望受理论的束缚，活性药物成分中包含的其他化合物抑制由在靶细胞类型中具有组成性活性的多药耐药蛋白mrp转运蛋白家族介导的常见分子输出途径。
在典型的实施方案中，含月桂烯的复杂混合物含有从大麻(cannabisspp.)中鉴定的化合物，大致分为两类：(a)大麻素和(b)萜烯。这些化合物在植物中的浓度因大麻(cannabis)品系、品种、时间、培养方法和环境条件等的不同而有很大差异。这些化合物之间的复杂相互作用意味着从植物到临床的转化并不简单，并强调需要解构、优化和重建治疗上理想的组合物的混合物。本公开通过提供用于通过解构、优化和重建方法鉴定治疗上理想的组合物的方法以及通过该方法鉴定的组合物来满足需要。
如上所述，本文所述的药物组合物有效治疗涉及trp通道(包括但不限于trpv1)的各种疾病。在一些方面，该药物组合物可用于治疗和预防人和其他哺乳动物的慢性和急性疼痛，用于治疗心脏肥厚，用于预防性治疗心脏肥厚，用于治疗心血管疾病的其他方面，用于治疗膀胱过度活动症，和用于治疗慢性咳嗽。
特别地，本文公开的含月桂烯的药物组合物提供了治疗和预防各种疼痛紊乱的新颖且有效的方式。此类紊乱包括但不限于：偏头痛和其他严重头痛、关节炎和其他关节痛、纤维肌痛、子宫内膜异位、肠易激综合症、慢性间质性膀胱炎、外阴痛、外伤或术后疼痛、下背痛和其他肌骨失常、颞下颌关节紊乱、带状疱疹、镰状细胞病、心脏病(心绞痛)、癌症、中风、糖尿病、疱疹后疼痛等。
预期该混合物将替代或补充本领域可用的其他疼痛方法。首先，目前可用的方法无法在皮肤和内脏或内部位置靶向离子通道，例如trpv1。其次，本发明的化合物和混合物通过使用来自大麻(cannabis)植物次生代谢组的复杂混合物来激活trp通道，通过经由诸如多药耐药蛋白介导的输出的途径减少配体外排，为要部署的主要配体的较低剂量方案提供潜力。第三，trpv1介导的方法对疱疹后疼痛的潜力可以用本文所述的药物组合物得到改善，该方法需要使敏感的粘膜暴露于高刺激剂量的辣椒素中。
此外，预期本发明中的化合物及其混合物将替代或补充如下所述的本领域可用的、仍不完善的基于大麻的药物：首先，该方法“采用(homein)”理想组成的大麻素/萜烯用于疼痛治疗，这些成分随后可以以定制合成组合物的形式呈递，或以判断/排序某些天然存在的大麻(cannabis)品系/品种用于治疗应用的优点的形式呈递。这些是对当前处方或品系选择方法的改进，当前处方或品系选择方法主要基于轶事证据。其次，该方法提供了可以一致且以无污染的方式制造的合成组合物的设计，这是对当前医用大麻(marijuana)生产过程状态的一种改进，在上述状态下，不能保证批次之间的一致性(由于生长条件的差异、植物之间的遗传/表观遗传和代谢差异以及提取方法的变化)并且微生物和化学污染是持续存在的问题。第三，这里提供的单一化合物和定制混合物不含主要的精神活性大麻素δ-9四氢大麻酚(thc)。因此，与通常可买到的医用大麻(marijuana)相比，这些混合物呈现出降低的监管和道德负担。此外，由于大麻(cannabis)的任何成瘾或增强潜力都可能存在于主要的精神活性成分中，因此，基于患者成瘾的可能性降低，这里提供的定制混合物优于基于阿片类药物的疼痛疗法。因此，本发明对于治疗和预防各种疼痛紊乱具有巨大的价值。
另外，本文公开的含月桂烯的混合物提供了用于治疗包括心脏肥厚的心血管疾病的新颖方法，包括心脏重塑、心脏纤维化、细胞凋亡、高血压或心力衰竭的过程。
预期本文公开的化合物和混合物将替代或补充本领域可用的其他心血管治疗方法，这些方法仍不完善，如下：(1)需要下调内脏部位的trpv1的治疗方法，和(3)需要减少或逆转心脏重塑、心脏纤维化、细胞凋亡、高血压或心力衰竭过程的治疗方法。相应地，本发明对于治疗和预防各种心血管疾病具有潜在价值。
下面进一步详细描述本发明的这些和其他方面。
3.附图说明
图1示出了trpv1在含有非trpv1的细胞类型中的诱导型表达赋予细胞辣椒素敏感性钙通量响应。这里，在四环素诱导型启动子的控制下用大鼠trpv1基因转染的hek细胞被诱导以转录trpv1基因并通过以1微摩尔应用四环素16小时合成trpv1蛋白。由于辣椒素是trpv1的特异性配体，因此可以确定以下研究中使用的实验系统明确且具体地报告了trpv1特异性钙通量。
图2a至图2c示出了萜烯通过大麻衍生的大麻素和萜烯的混合物诱导的trpv1对钙通量的显著贡献。图2a显示了先是无刺激(“ns”)，然后是在施加媒介物(“veh”)后和在施加品系a混合物(“品系混合物”)后，用编码trpv1的构建体转染的hek细胞中钙流入(相对荧光单位，“fluo-4rfu”)随时间(秒，“s”)的变化。图2b显示了在施加仅包含品系a混合物中存在的大麻素的混合物(“大麻素混合物”)之后，表达trpv1的hek细胞中的钙流入。图2c显示了在施加仅包含品系a混合物中存在的萜烯的混合物(“萜烯混合物”)之后，表达trpv1的hek细胞中的钙流入。
图3a至图3l示出了各个萜烯对由萜烯混合物经由trpv1诱导的钙通量的差异贡献。图3a显示了先是无刺激(“ns”)，然后是在施加媒介物(“veh”)后和在施加萜烯混合物(“所有萜烯”)后用编码trpv1的构建体转染的hek细胞中钙流入随时间的变化。图3b至图3l图示了图3a中使用的萜烯混合物中存在的每种萜烯在表达trpv1的hek细胞中分别减去基线的钙流入随时间的变化。
图4示出了月桂烯对用萜烯混合物(“萜烯”)观察到的trpv1介导的钙响应的显著贡献，但不构成信号的100％。数据从用trpv1转染并诱导表达trpv1的hek细胞获得。
图5a至图5c示出了所测量的钙响应完全或部分取决于trpv1离子通道的存在。图5a显示了通过在施加完整的品系a混合物后施加四环素(1μm，持续16小时)(“hek+trpv1”)，在hek野生型细胞(“hek野生型”)和被trpv1转染并被诱导表达trpv1的hek细胞中钙流入随时间的变化。图5b显示了在施加仅包含品系a混合物中存在的大麻素的混合物(“大麻素混合物”)之后，hek野生型细胞和hek+trpv1细胞中钙流入随时间的变化。图5c显示了在施加仅包含品系a混合物中存在的萜烯的混合物(“萜烯混合物”)之后，hek野生型细胞和hek+trpv1细胞中钙流入随时间的变化。所有数据均减去媒介物。
图6a至图6c示出了月桂烯诱导的钙流入全部或部分取决于trpv1离子通道的存在。图6a至图6b显示了在以不同浓度：3.5μg/mg(图6a)、1.75μg/mg(图6b)、0.875μg/mg(图6c)和0.43μg/mg(图6d)施用月桂烯后，hek野生型细胞(“hek野生型”)和hek+trpv1细胞中钙流入随时间的变化。所有数据均减去基线。
图7a至图7b示出了通过trpv1离子通道的特定药理抑制剂抑制了测量的月桂烯诱导的钙流入响应。图7a显示了响应于施加媒介物(“veh”)、3.5μg/ml月桂烯以及进一步添加trpv1抑制剂辣椒平(capsazepine，10μm)的表达trpv1的hek细胞中的钙流入随时间(以秒为单位)的变化。图7b显示了响应于施加媒介物(“veh”)、3.5μg/ml月桂烯以及进一步添加磷酸盐缓冲盐水(“pbs”)而不是辣椒平的trpv1转染的hek细胞中的钙流入随时间(以秒为单位)的变化。数据减去基线。
图8a至图8d示出了当在没有外部钙的情况下施加高浓度月桂烯时，月桂烯可以诱导从内部储库中的trpv1依赖性钙释放。图8a至图8d显示了在表达trpv1的转染hek细胞(“hektrpv1”)或野生型hek细胞(“hek野生型”)中，响应于不同浓度的月桂烯-3.5μg/ml(图8a)、1.75μg/ml(图8b)、0.875μg/ml(图8c)和0.43μg/ml(图8d)的月桂烯-的胞质钙流入随时间的变化。实验在培养基中在不存在外部钙的情况下进行。所有数据均减去基线。
图9a至图9g示出大麻素通过trpv1对钙通量的差异贡献。图9a至图9g显示了分别对于图2b中测试的大麻素混合物中存在的每种大麻素，在hek野生型细胞和表达trpv1的hek细胞中钙流入随时间(秒，“sec”)的变化。在20秒时添加所有刺激。所有数据均减去基线。
图10示出了通过阻断多药耐药蛋白介导的生物活性配体的输出，可以通过共同孵育大麻样“随行”来增强生物活性配体例如月桂烯的比活性。在仅媒介物(“veh”)、已知mrp抑制剂氯喹(“氯喹”)的存在下和在“cbmix”(品系a混合物中除月桂烯以外的所有大麻素和萜烯的混合物)的存在下，通过流式细胞仪评估了荧光标志物cfda的多药耐药蛋白(mrp)介导的外排率。这些数据表明，如果用作主要治疗化合物的辅助药物，多种大麻素和/或萜烯的共同施加将倾向于延缓治疗化合物从细胞中流出，并增加每单位剂量的主要治疗化合物的比活性。
图11示出了ttd治疗靶标数据库的富集分析倾向于将月桂烯优先于橙花叔醇用于疼痛和心血管领域的发展。此外，月桂烯对为天然大麻设置的预测疾病靶标有显著贡献。
图12示出了预测各种离子通道靶标用于通过月桂烯的直接或间接调节。
图13示出了预测有限的离子通道靶标或cns活性靶标用于通过橙花叔醇的直接或间接调节。
图14a至图14b示出了由辣椒素对月桂烯引发的trpv1的比较的脱敏模式。图14a通过绘制在施加相应trpv1激动剂(y轴)后20秒至300秒相对于相应浓度(x轴)测得的钙流入曲线下的面积(auc)，描绘了对各种浓度的月桂烯和辣椒素的剂量依赖性钙响应。图14b提供了在施加离子载体离子霉素、月桂烯或辣椒素之前和之后24小时，在表达trpv1的hek细胞中测量的钙流入曲线的auc。还提供了在施加之前和之后测得的值中的百分比抑制(supp％)。
图15列出了在所述实验中使用的化合物。
图16a至图16b示出了两种萜烯：月桂烯(图16a)和橙花叔醇(图16b)的靶标分析和疾病预测网络。使用gb科学网络药理平台(“npp”)通过计算机模拟生成数据。该网络中存在多个trp通道表明，月桂烯的功效可能会超出trpv1，延伸至其他伤害感受性神经元，其中主要的疼痛传导通道是不同的trp。
图17示出了一种机制，通过该机制，品系a混合物中的大麻素和除月桂烯之外的萜烯通过阻断多药耐药蛋白介导的生物活性配体的输出而增强月桂烯的trpv1激动剂活性(参见图10)。
图18示出了预测的月桂烯和含有月桂烯的混合物靶向伤害感受神经束中的多个受体的潜力。
图19a至图19c示出了在施加增加量的月桂烯(m)后过表达trpv1的单个hek293细胞中的trpv1离子通道激活。图19a示出了5μm的月桂烯，图19b示出了10μm的月桂烯，图19c显示了150μm的月桂烯。
图20a至图20e示出了在添加5μm月桂烯(m)和1μm辣椒素(cap)后过表达trpv1的单个hek293细胞中的电生理数据。图20a和图20b示出了在添加月桂烯和辣椒素之前和之后细胞的向内和向外的离子电流(na)。图20b是图20a的放大图，示出了月桂烯诱导的响应。图20c至图20e示出了在添加月桂烯或辣椒素之前(图20c)，或者在添加5μm月桂烯(图20d)或1μm辣椒素之后(图20e)的细胞的电流/电压迹线。
4.具体实施方式
4.1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所使用的，以下术语具有以下赋予它们的含义。
“月桂烯”(同义词，“β-月桂烯”)是7-甲基-3-亚甲基辛-1,6-二烯。
“品系a混合物”是指次大麻二酚(cbdv)、大麻色原烯(cbc)、大麻二酚(cbd)、大麻二酚酸(cbda)、大麻萜酚(cbg)、大麻萜酚酸(cbga)、大麻酚(cbn)、alpha-没药醇(α-没药醇)，alpha-蛇麻烯(α-蛇麻烯)、alpha-蒎烯(α-蒎烯)、beta-石竹烯(β-石竹烯)、月桂烯、(+)-beta-蒎烯(β-蒎烯)、莰烯、柠檬烯，芳樟醇和橙花叔醇的混合物。参见表1和图15。该混合物的组成基于目前在美国内华达州作为药物使用的大麻(cannabissativa)品种的实际化学特征。品系化学特征数据以％质量和mg/g丰度表示，并将这些量转化为暴露于培养的细胞的混合物中所含的量。通过有意省略thc和thca，以及省略某些不稳定或不溶性成分，可以改变品系a混合物中的实际化学特征。
“萜烯混合物”是指仅包含品系a混合物的萜烯的混合物-alpha-没药醇(α-没药醇)、alpha-蛇麻烯(α-蛇麻烯)、alpha-蒎烯(α-蒎烯)、β-石竹烯(β-石竹烯)、月桂烯、(+)-beta-蒎烯(β-蒎烯)、莰烯、柠檬烯、芳樟醇和橙花叔醇。
“选定的萜烯”是指橙花叔醇。
“大麻素混合物”是指仅含有品系a混合物的大麻素的混合物-次大麻二酚(cbdv)、大麻色原烯(cbc)、大麻二酚(cbd)、大麻二酚酸(cbda)、大麻萜酚(cbg)、大麻萜酚酸(cbga)、和大麻酚(cbn)。
“选定的大麻素”是指大麻萜酚酸(cbga)、大麻二酚(cbd次大麻二酚(cbdv)、大麻色原烯、大麻二酚酸或大麻萜酚(cbg)。
“药物活性成分”(同义词，活性药物成分)是指打算用于制造药物产品，并且当用于生产药物时，成为药物产品中的活性成分的任何物质或物质混合物。此类物质旨在在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中提供药理活性或其他直接作用，或影响身体的结构和功能。此类物质或物质混合物最好是根据《联邦食品、药品和化妆品法》501(a)(2)(b)部分，按照动态药品生产管理规范(cgmp)的规定生产。
如果药物活性成分含有少于0.3％(w/w)的δ-9四氢大麻酚，则该药物活性成分“基本上不含thc”。如果药物组合物包含少于0.3％(w/v)的δ-9四氢大麻酚，则该药物组合物“基本上不含thc”。
“大麻(cannabissativa)提取物”是通过流体和/或气体提取，例如通过用co2的超临界流体提取(sfe)从大麻植物材料中获得的组合物。大麻提取物通常含有月桂烯、选定的大麻素、选定的萜烯，以及其他萜烯、植物大麻素和次生代谢产物。例如，大麻提取物可包括萜品烯、石竹烯、香叶醇、愈创木醇、异胡薄荷醇(isopulegoll)、罗勒烯、伞花烃、桉油精和萜品油烯中的一种或多种。
“疼痛紊乱”包括引起疼痛作为其症状之一的各种疾病-包括但不限于由于化学疗法或放射而与以下相关的疼痛紊乱：劳损(strain)，扭伤，关节炎或其他关节疼痛，挫伤，腰痛，纤维肌痛，子宫内膜异位，手术后疼痛，糖尿病神经病变，三叉神经痛，疱疹后神经痛，丛集性头痛，牛皮癣，肠易激综合症，慢性间质性膀胱炎，外阴痛，外伤，肌骨失常，带状疱疹，镰状细胞病，心脏病，癌症，中风或口腔溃疡。
本文中使用的术语“治疗(treatment，treating)”等通常是指获得所需的药理和/或生理作用。就完全或部分预防疾病、病情或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或对于疾病或病情的部分或完全治愈和/或归因于疾病或病情诸如症状的不良作用而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人的疾病或病情的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病或病情在可能易患该疾病或病情但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病或病情(例如，阻止其发展)；或(c)缓解疾病或病情(例如，导致疾病或病情消退，从而改善一种或多种症状)。根据本领域已知的标准方法和技术，可以容易地评估任何病情的改善。通过该方法治疗的受试者群体包括患有不良病情或疾病的受试者，以及处于患该病情或疾病的风险中的受试者。
术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”是指产生期望效果所施用的剂量或量。确切的剂量或量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如lloyd(2012)theart,scienceandtechnologyofpharmaceuticalcompounding，第四版)。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为可以将预防视为治疗。
术语“足够量”是指足以产生期望效果的量。
术语“改善”是指在疾病状态例如免疫紊乱的治疗中的任何治疗有益结果，包括预防、减轻其严重性或进展，缓解或治愈该疾病状态。
4.2.其他解释约定
本文中描述的范围应被理解为该范围内所有值的简写形式，包括所描述的端点。例如，范围1到50应该理解为包括来自下组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36，37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。
除非另有说明，否则提及具有一个或多个立体中心的化合物是指其每种立体异构体以及立体异构体的所有组合。
4.3.实验结果概述
大麻(cannabis)已经使用了数千年，以提供镇痛作用并治疗各种类型的疼痛。我们试图确定大麻是否至少部分通过trpv1受体发挥抗伤害感受作用，如果是，则确定药用大麻提取物中的数百种化合物中的哪一种起作用。
如以下实施例部分中更充分描述的，基于目前在美国内华达州作为药物使用的大麻(cannabissativa)品种的实际化学特征，我们制备了大麻素和萜烯的复杂混合物，即品系a混合物。品系化学特征数据表示为％质量和mg/g丰度，并将这些量转换为混合物中所含的量。通过有意省略thc和thca(以消除精神活性成分)以及省略某些不稳定或不溶性成分，修改了在品系a混合物中的实际的化学特征。我们还制备了包含品系a混合物中的化合物子集的复杂混合物：cbmix，大麻素混合物和萜烯混合物。参见表1。
为了创建trpv-1激动剂活性的体外测定，我们用赋予四环素诱导的trpv1在细胞上表达的表达载体转染了hek细胞，并使用了细胞内钙水平的标准荧光报告基因(fluo-4乙酰氧基甲酯)(“fluo-4”)。图1说明了trpv1的诱导型表达赋予hek细胞辣椒素敏感的钙通量响应，从而确立实验系统清楚地报告trpv1特异性钙通量。
我们在同一测定中测试了品系a混合物，发现大麻素和萜烯的大麻衍生混合物(品系a混合物)引起大量钙流入trpv1转染的hek细胞(图2a)。我们通过比较与未转染的野生型hek细胞平行获得的信号证实，用完整的品系a混合物观察到的钙通量取决于trpv1受体的存在(图5a)。
使用子混合物，我们确定了品系a混合物中的萜烯对观察到的效果有显著贡献(图2c)。由品系a混合物中存在的大麻素引起更适度的流入(图2b)。使用萜烯混合物和大麻素混合物观察到的信号取决于trpv1受体的存在(图5b、图5c)。
然后我们测试了品系a混合物中存在的各种萜烯，发现各种萜烯通过trpv1对钙通量具有差异的贡献(图3a至图3l)。月桂烯贡献了显著的激动剂活性(图3c)，但不构成信号的100％(图4)。当单独测试时，观察到橙花叔醇具有更适度的激动剂活性(图3i)。月桂烯诱导的钙的流入是剂量依赖性的，并且完全或部分地依赖于trpv1受体的表达(图6)。我们使用trpv1抑制剂辣椒平进一步证实了对trpv1的依赖性；图7说明了辣椒平抑制了月桂烯诱导的钙流入响应。
我们证明了在不存在细胞外钙的情况下(通过构建补充有1mmegta的名义上无钙的细胞外环境来实现)，高浓度月桂烯可以诱导从内部储存物的trpv1依赖性钙的释放(图8)。
我们将月桂烯与辣椒素的急性激动剂效力进行了比较，发现需要更高浓度的月桂烯来诱导与辣椒素相同的钙流入(图14a)。数据表明，月桂烯是有效的trpv1激动剂，其作用与辣椒素相似，但效力较低。与辣椒素一样，月桂烯在暴露24小时后也会引起脱敏。
我们进行了相似的实验以确定品系a混合物中各种大麻素的贡献，并发现大麻素通过trpv1对钙通量具有差异的贡献(图9a-9g)。这些大麻素中，当在测定中单独测试时，大麻萜酚酸(cbga)、大麻二酚(cbd)、次大麻二酚(cbdv)、大麻色原烯和大麻二酚酸最有效。
为了探索品系a混合物中的萜烯和大麻素的复杂混合物提供比单独的月桂烯更高的信号的机制，我们测试了大麻样“随行”是否可能起阻断多药耐药蛋白介导的生物活性配体月桂烯的输出的作用。在仅媒介物(“veh”)、已知mrp抑制剂氯喹(“氯喹”)的存在下，和在“cbmix”(除月桂烯以外的品系a混合物中所有大麻素和萜烯的混合物)的存在下，通过流式细胞仪评估荧光标志物cfda的多药耐药蛋白(mrp)介导的外排率。如图10所示的数据表明，如果用作主要治疗化合物的辅助剂，则多种大麻素和/或萜烯的共同施加将倾向于延缓治疗化合物从细胞中的流出，从而增加每单位剂量的主要治疗化合物的比活性。
为了评估月桂烯和橙花叔醇(我们最初的大麻品系a混合物中具有显著trpv1激动剂作用的两种萜烯)的更广泛的治疗潜力，我们使用专有的计算机模拟预测方法，称为gb科学网络药理学平台(“npp”)。
图11示出了治疗靶标数据库富集分析倾向于在疼痛和心血管领域的发展中优先考虑月桂烯而非橙花叔醇。此外，月桂烯对为天然大麻设定的预测疾病靶标有重大贡献。图12示出，预测各种离子通道靶标用于由月桂烯进行的直接或间接调节，而图13示出了预测较有限的一组离子通道靶标或cns活性靶标用于由橙花叔醇进行的直接或间接调节。
图16a显示了使用gb科学的npp对月桂烯进行靶标分析和疾病预测的网络。该网络中存在多个trp通道，表明月桂烯的功效可能会超出trpv1，延伸至其他伤害性神经元，其中主要的疼痛传导通道是不同的trp受体。
4.4.药物组合物
因此，在第一方面，提供了药物组合物。该组合物包含月桂烯和药学上可接受的载体或稀释剂。该组合物任选地包含至少一种大麻素和/或除月桂烯之外的至少一种萜烯。该组合物包含不超过20种不同种类的大麻素和萜烯化合物，并且在典型的实施方案中基本上不含thc。
在各个实施方案中，该药物组合物包含不超过19种不同种类、18种不同种类、17种不同种类、16种不同种类、15种不同种类、14种不同种类、13种不同种类、12种不同种类、11种不同种类、或不超过10种不同种类的大麻素和萜烯化合物。在某些实施方案中，该药物组合物包含不超过9种不同种类、不超过8种不同种类、不超过7种不同种类、不超过6种不同种类、或不超过5种不同种类的大麻素和萜烯化合物。在特定的实施方案中，该药物组合物包含不超过4种不同种类、不超过3种不同种类或不超过2种不同种类的大麻素和萜烯化合物。在一个选择的实施方案中，该药物组合物包含不超过1种的大麻素和萜烯化合物，该种类为月桂烯。
在各种实施方案中，该药物组合物包含至少2种不同种类、至少3种不同种类、至少4种不同种类、至少5种不同种类、至少6种不同种类、至少7种不同种类、至少8种不同种类、至少9种不同种类或至少10种不同种类的大麻素和萜烯化合物，每种情况下包含不超过20种不同种类。在一些实施方案中，该药物组合物包含至少11种不同种类、至少12种不同种类、至少13种不同种类、至少14种不同种类或至少15种不同种类的大麻素和萜烯化合物，在每种情况下包含不超过20种不同种类。
在一些实施方案中，该药物组合物包含20种不同种类、19种不同种类、18种不同种类、17种不同种类、16种不同种类、15种不同种类、14种不同种类、13种不同种类、12种不同种类、11种不同种类或10种不同种类的大麻素和萜烯化合物。在各种实施方案中，该药物组合物包含9、8、7、6、5、4、3或2种不同种类的大麻素和萜烯化合物。
在各种实施方案中，月桂烯的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少10％(w/w)。在一些实施方案中，月桂烯的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少15％(w/w)、至少20％(w/w)、至少25％(w/w)、至少30％(w/w)、至少35％(w/w)、至少40％(w/w)、至少45％(w/w)或至少50％(w/w)。在某些实施方案中，月桂烯的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)或至少90％(w/w)。在特定的实施方案中，月桂烯的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少95％(w/w)。
在各种实施方案中，月桂烯以0.025％(w/v)至5％(w/v)的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，月桂烯以0.025％(w/v)至2.5％(w/v)的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，月桂烯以0.025％(w/v)至1％(w/v)的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，月桂烯以2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)或10％(w/v)的浓度存在于药物组合物中。
在包含至少两种不同种类的大麻素和萜烯化合物的一些实施方案中，除月桂烯以外的化合物中的至少一种是选定的大麻素。在包含至少两种不同种类的大麻素和萜烯化合物的某些实施方案中，除月桂烯以外的所有化合物都是选定的大麻素。
在各种实施方案中，该药物组合物包含大麻萜酚酸(cbga)。在一些实施方案中，cbga的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少10％(w/w)。在一些实施方案中，cbga的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少11％(w/w)、12％(w/w)、13％(w/w)、14％(w/w)或15％(w/w)。在一些实施方案中，cbga的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少20％(w/w)、21％(w/w)、22％(w/w)、23％(w/w)、24％(w/w)或25％(w/w)。
在各种实施方案中，该药物组合物包含大麻二酚(cbd)。在一些实施方案中，cbd的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少2.5％(w/w)。在一些实施方案中，cbd的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少3％(w/w)、3.5％(w/w)、4％(w/w)、4.5％(w/w)或5％(w/w)。在某些实施方案中，cbd的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少7.5％(w/w)或10％(w/w)。
在各种实施方案中，该药物组合物包含次大麻二酚(cbdv)。在一些实施方案中，cbdv的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少5％(w/w)。在一些实施方案中，cbdv的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少7.5％(w/w)、10％(w/w)或15％(w/w)。
在各种实施方式中，该药物组合物包含大麻色原烯。在一些实施方案中，大麻色原烯的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少1％(w/w)。在一些实施方案中，大麻色原烯的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少1.5％(w/w)、至少2％(w/w)或至少2.5％(w/w)。在一些实施方案中，大麻色原烯的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少5％(w/w)、7.5％(w/w)或10％(w/w)。
在各种实施方案中，该药物组合物包含大麻二酚酸(cbda)。在一些实施方案中，cbda的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少2.5％(w/w)。在一些实施方案中，cbda的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少5％(w/w)、7.5％(w/w)或10％(w/w)。
在各种实施方案中，该组合物包含大麻萜酚(cbg)。在一些实施方案中，cbg的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少2.5％(w/w)。在一些实施方案中，cbg的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯总含量的至少5％(w/w)。
在包含至少两种不同种类的大麻素和萜烯化合物的一些实施方案中，除月桂烯以外的化合物中的至少一种是选定的萜烯。在包含至少两种不同种类的大麻素和萜烯化合物的某些实施方案中，除月桂烯以外的所有化合物均为选定的萜烯。
在各种实施方案中，该药物组合物包含橙花叔醇。在一些实施方案中，橙花叔醇的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯总含量的至少2％(w/w)。在一些实施方案中，橙花叔醇的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯总含量的至少2.5％(w/w)、3％(w/w)、3.5％(w/w)、4％(w/w)、4.5％(w/w)或5％(w/w)。在特定的实施方案中，橙花叔醇的存在量为药物组合物中大麻素和萜烯的总含量的至少7.5％(w/w)或10％(w/w)。
在典型的实施方案中，除月桂烯以外的大麻素和萜烯化合物以有效增加月桂烯依赖性trpv1钙通量的量存在。
4.4.1.δ-9四氢大麻酚(thc)含量
在典型的实施方案中，药物组合物完全或基本上不含δ-9四氢大麻酚(thc)，因此缺乏精神活性作用，这提供了某些调节和其他生理优势。
在某些实施方案中，药物组合物并非基本上不含δ-9thc。在这些实施方案的某些中，药物组合物包含1至10重量％(wt％)的thc。在特定的实施方案中，药物组合物包含2至9wt％的thc、3至8wt％的thc、4至7wt％的thc。在某些实施方案中，药物组合物包含1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％或10wt％的thc。
4.4.2.其他组分
在一些实施方案中，月桂烯、任选的大麻素和除月桂烯以外的任选的萜烯共同构成药物组合物中小于100重量％(wt％)的活性药物成分。
在各种这样的实施方案中，月桂烯、任选的大麻素和除月桂烯以外的任选的萜烯共同构成至少75wt％但小于100wt％的药物活性成分。在特定的实施方案中，月桂烯、任选的大麻素和除月桂烯以外的任选的萜烯共同构成至少80wt％、至少85wt％、至少90wt％、至少91wt％、至少92wt％、至少93wt％、至少94wt％、或至少95wt％，但小于100wt％的活性成分。在特定的实施方案中，月桂烯、任选的大麻素和除月桂烯以外的任选的萜烯共同构成至少96wt％、至少97wt％、至少98wt％或至少99wt％，但小于100wt％的活性成分。
在其中月桂烯、任选的大麻素和除月桂烯以外的任选的萜烯共同构成小于100％(wt％)的药物活性成分的实施方案中，活性成分还包含除月桂烯、任选的大麻素和除月桂烯以外的任选的萜烯之外的化合物。在典型的此类实施方案中，活性成分中的所有其他化合物可从大麻(cannabissativa)中提取。在特定的实施方案中，活性成分中的所有其他化合物存在于由大麻制成的提取物中。
在一些实施方案中，月桂烯、任选的大麻素和除月桂烯以外的任选的萜烯共同构成小于100％(w/v)的药物活性成分。
4.4.3.制剂
药物组合物可以是适于向人类或非人类动物施用的任何形式，包括液体、油、乳剂、凝胶、胶体、气雾剂或固体，并且可以被配制用于通过适用于人类药物或兽药的任何施用途径进行施用，包括肠内和肠胃外施用途径。
4.4.3.1.适于通过吸入施用的药理组合物
在各种实施方案中，该药物组合物被配制成用于通过吸入施用。
在某些实施方案中，该药物组合物被配制用于通过蒸发器施用。在某些实施方案中，该药物组合物被配制用于通过喷雾器施用。在特定实施方案中，喷雾器是喷射喷雾器或超声喷雾器。在某些实施方案中，该药物组合物被配制用于通过雾化器施用。在某些实施方案中，该药物组合物被配制用于通过干粉吸入器施用。
在一些实施方案中，提供了本文所述的药物组合物的单位剂型，其适合于通过蒸发器、喷雾器、雾化器或干粉吸入器施用药物组合物。在一些实施方案中，剂型是小瓶、安瓿，任选地刻痕以允许使用者打开。
在各种实施方案中，该药物组合物是水溶液，并且可以作为鼻喷雾剂或肺喷雾剂施用。在美国专利no.4,511,069中公开了用于分配液体作为鼻喷雾剂的优选系统。可以通过将根据本发明的组合物溶于水中以产生水溶液，并使溶液无菌来方便地制备这种制剂。制剂可以存在于多剂量容器中，例如在美国专利no.4,511,069中公开的密封分配系统中。其他合适的鼻喷雾剂递送系统已经在以下文献中描述过：transdermalsystemicmedication，y.w.chien编，elsevier出版社，纽约，1985年；m.naef等developmentandpharmacokineticcharacterizationofpulmonalandintravenousdelta-9-tetrahydrocannabinol(thc)inhumans,j.pharm.sci.93,1176-84(2004)；和美国专利号4,778,810、6,080,762、7,052,678和8,277,781(每篇文献均通过引用并入本文)。另外的气雾剂递送形式可以包括例如压缩空气喷雾器、喷射喷雾器、超声喷雾器和压电喷雾器，其递送溶解或悬浮在药物溶剂例如水、乙醇或其混合物中的生物活性剂。
在某些实施方案中，粘膜制剂以干粉制剂的形式施用，例如，其包含合适粒度或在合适粒度范围内的干燥的、通常冻干形式的生物活性剂，用于鼻内递送。适于鼻或肺部通道内沉积的最小粒径通常为约0.5微米质量中位当量空气动力学直径(mmead)，通常为约1微米mmead，更通常为约2微米mmead。适合于鼻通道内沉积的最大粒径经常为约10微米mmead，通常为约8微米mmead，更通常为约4微米mmead。这些尺寸范围内的鼻内可吸入粉末可通过多种常规技术来生产，例如喷射研磨、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界流体冷凝等。这些合适的mmead的干粉可以通过常规的干粉吸入器(dpi)施用于患者，该吸入器依赖患者的呼吸，经肺或鼻吸入，将粉末分散成雾化量。或者，可以通过使用外部电源将粉末分散成雾化量的空气辅助装置(例如活塞泵)来施用干粉。
4.4.3.2.适用于口服/经颊/舌下施用的药理组合物
在各种实施方案中，药物组合物被配制成用于口服、经颊或舌下施用。
用于口服、经颊或舌下施用的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂，或作为在水性或非水性液体中的溶液剂或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳液，或作为酏剂或糖浆，或作为糖果锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口水等，每种都包含预定量的主题多肽治疗剂作为活性成分。除活性化合物外，悬浮液还可以包含悬浮剂，诸如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶及其混合物。
在用于口服、经颊或舌下施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，一种或多种治疗剂可与一种或多种药学上可接受的载体混合，诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙，和/或以下中的任何一种：(1)填料或填充剂，诸如淀粉、乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)润湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)湿润剂，诸如，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及它们的混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填料，该胶囊使用诸如乳糖或牛奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分外，液体剂型还可以含有：本领域常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇，油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)，甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、加香剂和防腐剂。
4.4.3.3.适于注射的药理组合物
在某些实施方案中，药物组合物被配制用于通过注射施用。
对于静脉内、肌内或皮下注射或在患处注射，活性成分将为肠胃外可接受的水溶液形式，其无热原且具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等张赋形剂诸如氯化钠注射液、ringer注射液、乳酸化ringer注射液来制备合适的溶液。如果需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
在各种实施方案中，药物组合物以单位剂型提供。单位剂型是小瓶、安瓿、瓶或预装注射器。在一些实施方案中，单位剂型包含0.01mg、0.1mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、25mg、50mg、75mg或100mg的大麻素组合物。在一些实施方案中，单位剂型包含125mg、150mg、175mg或200mg的大麻素组合物。在一些实施方案中，单位剂型包含250mg的大麻素组合物。
在典型的实施方案中，单位剂型的药物组合物为液体形式。在各种实施方案中，单位剂型包含0.1ml至50ml的药物组合物。在一些实施方案中，单位剂型包含1ml、2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、25ml或50ml的药物组合物。
在特定的实施方案中，单位剂型是含有1ml浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的含月桂烯的混合物的小瓶。在一些实施方案中，单位剂型是含有2ml浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的含月桂烯的混合物的小瓶。
在一些实施方案中，单位剂型的药物组合物为适于溶解的固体形式，例如冻干剂。
适用于皮下、皮内或肌内施用的单位剂型实施方案包括预装载的注射器、自动注射器和自动注射笔，每个均含有预定量的上述药物组合物。
在各种实施方案中，单位剂型是预装载的注射器，包括注射器和预定量的药物组合物。在某些预装载的注射器实施方案中，该注射器适于皮下施用。在某些实施方案中，该注射器适合于自我施用。在特定实施方案中，预装载的注射器是一次性注射器。
在各种实施方案中，预装载的注射器包含约0.1ml至约0.5ml的药物组合物。在某些实施方案中，该注射器包含约0.5ml的药物组合物。在特定的实施方案中，该注射器包含约1.0ml的药物组合物。在特定的实施方案中，该注射器包含约2.0ml的药物组合物。
在某些实施方案中，单位剂型是自动注射笔。自动注射笔包括含有本文所述药物组合物的自动注射笔。在一些实施方案中，自动注射笔递送预定体积的药物组合物。在其他实施方案中，自动注射笔被配置成递送由使用者设置的一定量的药物组合物。
在各种实施方案中，自动注射笔包含约0.1ml至约5.0ml的药物组合物。在特定的实施方案中，自动注射笔包含约0.5ml的药物组合物。在特定的实施方案中，自动注射笔包含约1.0ml的药物组合物。在其他实施方案中，自动注射笔包含约5.0ml的药物组合物。
4.4.3.4.适用于局部施用的药理组合物
在各种实施方式中，药物制剂被配制用于局部施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。常规药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必需的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可能有用。合适的局部制剂包括其中本发明特征的含月桂烯的复杂混合物与局部递送剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。合适的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)dope、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine)dmpc、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine))，带负电荷(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg)和阳离子(例如，二油酰四甲基氨基丙基dotap和二油酰磷脂酰乙醇胺dotma)。本发明特征的含月桂烯的混合物可以被包封在脂质体内或可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体。或者，含月桂烯的混合物可以与脂质，特别是与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸酯、二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或c1-10烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯ipm)、甘油单酯、甘油二酯或它们药学上可接受的盐。
4.5.制备活性成分的方法
在一些实施方案中，通过将化学纯的月桂烯、任选地一种或多种选定的大麻素和任选地选定的萜烯混合至期望的最终浓度来制备药物活性成分。月桂烯、选定的大麻素和选定的萜烯中的每一种均可独立地通过全合成或中间体的合成修饰而化学合成，从组成混合物(诸如大麻提取物)中纯化，或者如以下所述的实施例中所述，商业购买。
在其他实施方案中，通过将月桂烯、任选的选定的大麻素和任选的选定的萜烯中的一种或多种调节至预定的所需最终浓度，由起始组成的混合物制备药物活性成分。在典型的实施方案中，起始组成的混合物是大麻提取物。在当前优选的实施方案中，起始组成的混合物是大麻提取物，并且将月桂烯、选定的大麻素和选定的萜烯中的一种或多种加入到该混合物中以获得预定的所需最终浓度。
通常，在这样的实施方案中，该方法进一步包括更早的步骤：确定起始组成的混合物中每种所需的月桂烯、任选的选定的大麻素和任选的选定的萜烯的浓度。
在这些实施方案的某些中，该方法还包括制备大麻提取物的更早的步骤。制备大麻提取物的方法描述于美国专利号6,403,126、8,895,078和9,066,910；doorenbosetal.,cultivation,extraction,andanalysisofcannabissatival.,annalsofthenewyorkacademyofsciences,191,3-14(1971)；fairbairnandliebmann,theextractionandestimationofthecannabinoidsincannabissatival.anditsproducts,journalofpharmacyandpharmacology,25,150-155(1973)；oroszlanandverzar-petri,separation,quantitationandisolationofcannabinoidsfromcannabissatival.byoverpressuredlayerchromatography,journalofchromatographya,388,217-224(1987)，其公开内容通过引入全文并入本文。在特定的实施方案中，选择提取方法以提供具有最接近活性成分的预定组成的一定含量的月桂烯、任选的选定的大麻素和任选的选定的萜烯的提取物。
在一些实施方案中，该方法还包括第一步，即选择大麻品系以进行后续开发作为治疗剂或用于治疗的提取化合物的来源。
在某些实施方案中，所选择的品系在植株的整体或其可提取部分中具有最接近活性成分的预定组成的典型含量的月桂烯、任选的选定的大麻素和任选的选定的萜烯。在某些实施方案中，所选择的品系是能够提供最接近活性成分的预定组成的提取物的品系。在特定的实施方案中，所选择的品系在植株、其可提取部分或其提取物中具有最接近期望的月桂烯、选择的大麻素和选择的萜烯的预定重量比的典型含量。在特定的实施方案中，所选择的品系在植株、其可提取部分或其提取物中具有典型含量，该典型含量需要调节最少数量的所需月桂烯、选择的大麻素和选择的萜烯的浓度。在特定的实施方案中，选择的品系在植株、其可提取部分或其提取物中具有典型含量，该典型含量要求对所需的月桂烯、选定的大麻素和选定的萜烯的浓度进行最便宜的调整。
4.6.通过方法得到的产品
在典型的实施方案中，药物活性成分通过上文第4.5节中描述的方法之一制备。
在其中药物活性成分由起始组成的混合物通过将月桂烯、任选的选定的大麻素和任选的选定的萜烯中的任何一种或多种调节至预定的期望最终浓度而制备的实施方案中，活性成分中除月桂烯、选定的大麻素和选定的萜烯以外的所有化合物都存在于起始组成的混合物中。在起始组成的混合物是大麻提取物的实施方案中，活性成分中除月桂烯、选定的大麻素和选定的萜烯以外的所有活性成分都存在于大麻提取物中。
4.7.一般剂量范围
可以任选地采用体内和/或体外测定来帮助鉴定使用的最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和病情的严重性，并且应根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线外推有效剂量。
4.8.单位剂型
药物组合物可以方便地以单位剂型存在。
单位剂型通常会适于药物组合物的一种或多种特定的施用途径。
在各种实施方案中，单位剂型适于通过吸入施用。在这些实施方案的某些中，单位剂型适于通过蒸发器施用。在这些实施方案的某些中，单位剂型适于通过喷雾器施用。在这些实施方案的某些中，单位剂型适于通过雾化器施用。
在各种实施方案中，单位剂型适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。
一些实施方案中，单位剂型适合于静脉内、肌内或皮下施用。
在一些实施方案中，单位剂型适于鞘内或脑室内施用。
在一些实施方案中，药物组合物被配制用于局部施用。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常会是产生治疗作用的化合物的量。
4.9.治疗方法
4.9.1.在哺乳动物受试者的细胞中实现trpv1脱敏的方法
我们已经证明本文所述的含月桂烯的组合物对trpv1具有急性激动作用和长期脱敏作用。因此，这些组合物可以通过急性激活trpv1、通过长期应用使trpv1脱敏或两者而具有通过trpv1介导的治疗作用。此外，我们鉴定了月桂烯与选定的大麻素和/或选定的萜烯的特定组合，这些组合对trpv1发挥了显著的加和作用或协同作用。
相应地，提出了用于在哺乳动物受试者的细胞中实现trpv1脱敏的方法，该方法包括通过施用途径，以一定量向受试者施用本文所述的含月桂烯的药物组合物，并持续足以在受试者体内的细胞中引起trpv1脱敏的时间。
在各种实施方案中，药物组合物被局部施用。
在各种实施方案中，药物组合物被全身施用。在一些实施方案中，药物组合物被口服、经颊施用或舌下施用。
在一些实施方案中，药物组合物被肠胃外施用。在某些实施方案中，药物组合物被静脉内施用。在一些实施方案中，药物组合物被皮下施用。在一些实施方案中，药物组合物通过吸入施用。
这些方法特别针对哺乳动物，更特别是人类的治疗和预防性治疗。
实际施用的量以及施用的速率和时间表将取决于所治疗疾病的性质和严重性。治疗处方，例如剂量等的决定，在全科医生和其他医学专业人员的责任内，通常要考虑要治疗的疾病、个体患者的病情、施用途径、要治疗的部位以及从业者知道的其他因素。上面提到的技术和协议的示例可以在remington'spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.(编),1980中找到。
可以任选地采用体内和/或体外测定法来帮助鉴定最佳使用剂量范围以及施用途径和时间。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和病情的严重性，并且应根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量和施用方法可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线中外推。
在一些实施方案中，月桂烯以每剂量小于1g、小于500mg、小于100mg、小于10mg的量施用。
在本文所述的治疗方法中，含月桂烯的药物组合物可单独施用或与与含月桂烯的组合物同时或依次施用的其他治疗组合施用。
4.9.2.治疗疼痛的方法
在一些实施方案中，要进行trpv1脱敏的细胞是伤害感受器，并且该方法包括通过施用途径以一定量向受试者施用本文所述的含月桂烯的药物组合物，并持续足以在受试者的伤害感受器中引起trpv1脱敏的时间。
在一些实施方案中，伤害感受器是外周伤害感受器。在这些实施方案的某些中，药物组合物被局部施用。在一些实施方案中，痛觉神经元是内脏的。在这些实施方案的某些中，药物组合物被全身施用。
如下面实施例8中所述，我们使用gb科学网络药理学平台进行的计算机分析表明，月桂烯的治疗功效可能会超出trpv1并延伸至其他伤害性神经元，其中主要的疼痛传导通道是不同的trp。
相应地，在相关方面，提供了用于治疗哺乳动物受试者中的疼痛的方法。该方法包括通过施用途径以一定量向受试者施用本文所述的含月桂烯的药物组合物，并持续足以减轻疼痛的时间。
在某些实施方案中，疼痛是神经性疼痛。在特定的实施方案中，神经性疼痛是糖尿病性周围神经性疼痛。在特定的实施方案中，疼痛是疱疹后神经痛。在特定的实施方案中，疼痛是三叉神经痛。
在一些实施方案中，受试者患有与以下相关或由以下引起的疼痛：劳损，扭伤，关节炎或其他关节疼痛，挫伤，腰痛，纤维肌痛，子宫内膜异位，手术，偏头痛，丛集性头痛，牛皮癣，肠易激综合征，慢性间质性膀胱炎，外阴痛，外伤，肌骨失常，带状疱疹，镰状细胞病，心脏病，癌症，中风或口腔溃疡或因化学疗法或放射线引起的溃疡形成。
在一些实施方案中，药物组合物每天施用至少一次，持续至少3天。在一些实施方案中，药物组合物每天施用至少一次，持续至少5天。在一些实施方案中，药物组合物每天施用至少一次，持续至少7天。在一些实施方案中，药物组合物每天施用至少一次，持续超过7天。
在各种实施方案中，通过施用途径以一定剂量施用药物组合物，并按照足以在伤害感受器上维持月桂烯的有效水平至少3天、至少5天或至少7天的时间表。
4.9.3.治疗心脏肥厚的方法
在另一方面，提供在哺乳动物受试者中治疗心脏肥厚的方法。该方法包括向受试者施用抗肥厚有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
在典型的实施方案中，药物组合物全身施用。
在一些实施方案中，药物组合物经静脉内施用。在一些实施方案中，药物组合物经皮下施用。在一些实施方案中，药物组合物通过吸入施用。在一些实施方案中，药物组合物经口服施用。
4.9.4.心脏肥厚的预防性治疗方法
在另一方面，提供在哺乳动物受试者中预防性治疗心脏肥厚的方法。该方法包括向处于心脏肥后的风险的受试者施用抗肥厚有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
4.9.5.治疗膀胱过度活动症的方法
在另一方面，提供在哺乳动物受试者中治疗膀胱过度活动症的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
在典型的实施方案中，药物组合物被全身施用。
4.9.6.治疗难治性慢性咳嗽的方法
在另一方面，提供了治疗难治性慢性咳嗽的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的含月桂烯的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物被全身施用。
在一些实施方案中，药物组合物通过吸入施用。
4.9.7.治疗具有trpv1病因学的疾病的方法
在另一方面，用本文所述的含月桂烯的药物组合物治疗的疾病或紊乱包括与trpv1功能异常有关的疾病。这些疾病可能与trpv1的异常激活、抑制或失调有关。在一些实施方案中，所述疾病与编码trpv1的基因的异常表达或突变有关。
在一些实施方案中，用本文所述的含月桂烯的药物组合物治疗的疾病是与内源性trpv1激动剂的异常合成有关的疾病。
4.10.实施例
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。
4.10.1.实施例1：包含萜烯、大麻素以及萜烯和大麻素两者的混合物
我们基于目前在美国内华达州作为药物使用的大麻品种的实际化学特征，制备了大麻素和萜烯的复杂混合物，即品系a混合物。品系化学特征数据表达为质量％和mg/g丰度，并将这些量转换为混合物中所含的量。通过故意省去thc和thca以及省去某些不稳定或不溶性成分，可以改变品系a混合物的实际化学特征。我们还制备了包含品系a混合物中化合物子集的复杂混合物：cbmix，大麻素混合物和萜烯混合物。
通过混合下表1中指定的各个组分来制备所有混合物。该表提供每种混合物中包含的各个组分的重量百分比(比率，％)。还提供在下述实验中应用于细胞培养的每种成分的最终浓度(浓度，μg/ml)。
各种组分分别来自不同的供应商，例如tokyochemicalindustry(东京化学工业公司)的橙花叔醇(#n0454)，tokyochemicalindustry的芳樟醇(#l0048)，sigmaaldrich的α-蒎烯(#p45680)，mpbiomedicals的柠檬烯(#155234)，ultrscientific的植醇(#flms-035)，sigmaaldrich的次大麻二酚(#c-140)，sigmaaldrich的大麻色原烯(#c-143)，sigmaaldrich的大麻二酚(#c-045)，sigmaaldrich的大麻萜酚(#c-141)和sigmaaldrich的大麻酚(#c-046)。mpbiomedical制造的月桂烯获自vwr，产品#m0235。按照上面表1所指定的混合每种组分。
4.10.2.实施例2：用于测试trpv1介导的钙响应的细胞培养系统
用pcdna6tr(invitrogen，ca)质粒(编码四环素敏感的trex阻遏蛋白)稳定转染hek293细胞系，并保持在在37℃的5％湿润co2气氛中的dmem+10％胎牛血清(在55℃下灭活1小时)+2mm谷氨酰胺中。通过在10μg/ml弹力蛋白(sigma，stlouis，mo)中连续培养来维持trex293细胞上的选择压力。
为了产生具有trpv1诱导型表达的trexhek293细胞，将亲本细胞在pcdna4to载体中用大鼠trpv1cdna电穿孔，并通过在400μg/ml吉欧霉素(invitrogen，ca)存在下的有限稀释来选择克隆细胞系。在37℃使用1μg/ml四环素诱导trpv1表达16小时。使用抗flag蛋白质印迹筛选稳定系的诱导型蛋白表达，并确认诱导型表达。电生理学测量进一步证实了这些诱导细胞中trpv1的存在和i/v曲线“签名”。此外，图1中提供的辣椒素特异性钙通量还证实了trpv1在细胞中的表达和特异性响应，因为在没有编码trpv1的构建体的hek野生型细胞中未检测到钙通量。
在细胞培养系统中通过钙测定法测试了trpv1介导的钙响应。洗涤细胞，并在以下组成(以mm为单位)的标准改良ringer溶液中，在37℃下用0.2μmfluo-4乙酰氧基甲基酯(“fluo-4”)孵育30分钟：nacl145，kcl2.8，cscl10，cacl210，mgcl22，葡萄糖10，hepes·naoh10，ph7.4，330mosm。将细胞以50000个细胞/孔转移至96孔板，并按指示进行刺激。使用flexstation3(moleculardevices，sunnydale，美国)采集钙信号。使用
4.10.3.实施例3：响应于品系a混合物、大麻素混合物或萜烯混合物的trpv1介导的钙流入
测试了响应于如上所述的品系a混合物、大麻素混合物和萜烯混合物的trpv1介导的钙流入。将每种混合物施加至细胞培养基以使细胞暴露于表1中所提供的各种组分的最终浓度(“浓度μg/ml”)。例如，使用品系a混合物将细胞暴露于5.6μg/ml的次大麻二酚(cbdv)、8.75μg/ml的月桂烯等。
图2a至图2c提供了测量为fluo-4相对荧光单位(fluo-4rfu)随时间(秒)变化的钙通量数据。如图2a至图2c所示，观察到响应于施加品系a混合物(图2a)和萜烯混合物(图2c)的显著的钙通量，但是响应于施加大麻素混合物(图2b)的钙通量则较小。在不存在刺激(“ns”)或响应于施加媒介物(“veh”)的情况下，未检测到钙通量(图2a至图2c)。
当没有trpv1构建体的野生型hek细胞在相同的刺激条件下出现时，未观察到钙通量(图5a至图5c)。这些数据证明，响应于品系a混合物、大麻素混合物或萜烯混合物的钙流入是trpv1特异性的并由trpv1介导。
4.10.4.实施例4：响应于各萜烯的trpv1介导的钙流入
因为在实施例3中鉴定萜烯混合物对品系a混合物的trpv1激动作用起主要作用(参见图2a至图2c)，所以测试了响应于萜烯混合物的各组分的trpv1介导的钙流入。将每种组分施加到细胞培养基中，同时监测荧光信号。随时间测量的各萜烯化合物的荧光信号示于图3b至图3l中。
检测到响应于某些但不是全部的萜烯化合物的显著的钙流入。特别地，检测到响应于月桂烯(图3d)和橙花叔醇(图3i)的显著的钙通量。
当在单独的月桂烯和萜烯混合物之间比较trpv1激动作用时，发现月桂烯显著促进trpv1介导的钙响应，但没有占钙流入信号的100％。如图4所示，萜烯混合物(实线)比单独的月桂烯(虚线)具有更显著的作用。这表明当与月桂烯一起施加时，某些萜烯(包括橙花叔醇)可能对trpv1具有加和作用或协同作用。
4.10.5.实施例5：通过月桂烯激活trpv1
在各种条件下进一步测试了月桂烯对trpv1的激动作用。首先，测试了响应于不同浓度的月桂烯(3.5μg/ml，1.75μg/ml，0.875μg/ml和0.43μg/ml)的trpv1介导的钙通量。如图6a至图6d所示，钙对月桂烯的响应是剂量依赖性的，最大的通量响应于3.5μg/ml的月桂烯，最小的通量响应于0.43μg/ml的月桂烯。在野生型hek细胞培养物中的钙通量要小得多(图6a至图6d中的虚线)，表明月桂烯通过trpv1通道诱导钙通量。
通过在用3.5μg/ml月桂烯激活的细胞中施加trpv1抑制剂10μm辣椒平，进一步证实了月桂烯对trpv1的激动作用。如图7a所示，由月桂烯引起的钙通量对于辣椒平的响应减少。如图7b所示，响应于pbs(作为对照)的钙通量没有改变。数据表明，月桂烯通过激活trpv1诱导钙通量。
还在不含钙的培养基条件下测试了月桂烯对trpv1的激活。在这些条件下，低浓度的月桂烯(0.43μg/ml，0.875μg/ml和1.75μg/ml)不会引起钙介导的荧光增加(参见图8b、图8c、图8d)，而高浓度的月桂烯(3.5μg/ml)诱导这种增加(图8a)。这表明月桂烯主要在低浓度时诱导钙流从细胞外缓冲液流出，但在高浓度时可以诱导钙从细胞内贮库流入胞质液中。细胞外和细胞内通量都依赖于trpv1，因为在没有trpv1的野生型hek细胞中未观察到钙流入或仅有最小的钙流入(图8a至图8d中的虚线)。
为了证实并进一步研究月桂烯对trpv1的激活，在过表达大鼠trpv1的单个hek293细胞中通过膜片钳实验评估了通道电流。hek293细胞保存在含有以下的钠基细胞外ringer溶液中：140mmnacl，1mmcacl2，2mmmgcl2，2.8mmkcl，11mm葡萄糖和10mmhepes-naoh，ph7.2和渗透压300mosmol。用含有140mmcs-谷氨酸、8mmnacl、1mmmgcl2、3mmmgatp和10mmhepes-csoh的细胞内贴片移液管溶液灌注细胞的胞质液。用4mmca和10mmbapta将标准内部ca2+浓度缓冲至180nm。使用提供webmaxc的计算器调整游离无缓冲ca的水平(http://www.stanford.edu/～cpatton/webmaxcs.htm)。将最终溶液的ph调节至ph7.2，并在300mosmol下测量渗透压。
通过向细胞外溶液中添加5μm、10μm或150μm月桂烯来激活trpv1通道。1μm辣椒素用作trpv1激活的阳性对照。使用smartsquirt递送系统(auto-matescientific，旧金山)进行快速的细胞外溶液应用和交换。该系统包括在电子阀和epc-9放大器(heka，lambrecht，德国)之间的valvelinkttl接口。这种配置允许通过patchmaster软件(heka，lambrecht，德国)对可编程解决方案进行更改。
在21至25℃下以全细胞配置进行膜片钳实验。膜片移液管的电阻为2至3mω。使用控制epc-9放大器的patchmaster软件获取数据。在500ms的时段内，以0.5hz的速率从0mv的保持电位传递跨越-100至100mv的电压范围的50ms的电压斜升。校正了10mv液接电位的电压。电流以2.9khz滤波并以100μs间隔数字化。在每个电压斜升之前确定并校正电容电流。通过测量在-80mv和+80mv的电压下的电流幅度，从各个斜升电流记录中提取给定电位的电流发展。数据使用fitmaster(heka，lambrecht，德国)和igorpro(wavemetrics，lakeoswego，美国)进行分析。在适用的情况下，平均数据的统计误差以平均值±s.e.m给出。
如图19a至图19c所示，月桂烯在单个细胞中诱导剂量依赖性响应。显示了随时间的内向和外向电流的发展。每个数据点(dp)对应大约1秒。与通过施加1μm辣椒素诱导4至10na电流(未显示)相比，5μm(图19a)、10μm(图19b)和150μm(图19c)月桂烯诱导0.5至2.2na电流。月桂烯剂量的增加导致向内整流的非选择性阳离子电流，该电流以取决于激活电流幅度(图19a至图19c)和钙流入(数据未显示)的方式失活。
图20a示出了与图19a相同的实验，但在施加月桂烯后加入辣椒素。在含有1mmca的细胞外ringer液中平衡过表达大鼠trpv1的hek293细胞。在数据点(dp)60处将细胞外缓冲液更换为含有5μm月桂烯的缓冲液。在dp120处，将月桂烯溶液更换为含有1μm辣椒素的细胞外缓冲液。在每个dp处测量内向和外向电流(na)。图20a示出了6个独立实验的平均内向和外向电流。5μm月桂烯随时间诱导大约0.5na的内向电流，而1μm辣椒素则诱导大约9na的内向电流。月桂烯和辣椒素也都以比内向电流低的幅度诱导外向电流。图20b示出了月桂烯诱导的电流的放大图。
接下来，分析了月桂烯诱导的电流和辣椒素诱导的电流与实验电压之间的关系。在数据点1、59、119和179(图20a，箭头1至4iv)处执行电压斜升，并在添加月桂烯和辣椒素之前和之后评估iv关系(图20c至图20e)。图20c示出了在存在ringer溶液的情况下细胞的侵入电流(图20a中的“1iv”)和早期电流发展(图20a的“2iv”)。图20d示出了月桂烯诱导的trpv1激活(图20a的“3iv”)。图20e示出了辣椒素诱导的trpv1激活(图20a的“4iv”)。
辣椒素是已知可选择性地增加trpv1通道的ca2+离子渗透性的trpv1激动剂。通道的渗透性能先前已在两种状态下进行了记录。该非选择性阳离子通道(nscc)的状态1相对于钠对钙的选择性很小或没有。状态2(扩张或过渡状态)表示一种已达到的状态，在该状态中，孔隙性能已更改为渗透大的阳离子(例如nmdg)并相应地支持钙和钠的大通量。从状态1到状态2的过渡的特征在于iv曲线具有明显的线性化，并且具有比状态1更大的内向电流。图19和图20示出了月桂烯是trpv1的强激活剂，产生na电流。与辣椒素相比，月桂烯主要在状态1中激活通道。月桂烯诱导的和辣椒素诱导的trpv1激活性能之间的差异表明，与常规配体辣椒素相反，可以基于以下因素合理地操纵trpv1激活的幅度、选择性和因此的生理结果：trpv1介导的对月桂烯的响应的不同电生理特性。
4.10.6.实施例6：品系a混合物的非月桂烯成分对trpv1的作用
由于月桂烯单独不能解释品系a混合物的所有trpv1激动作用，因此进一步研究了每种大麻素和cbmix(即不包括月桂烯的品系a混合物)对trpv1的作用，以了解品系a混合物的剩余的trpv1激动作用。
首先，将每种大麻素应用于细胞培养基中，同时监测荧光信号。图9a至图9g示出了大麻素通过trpv1差异地促进钙通量。检测到响应于某些(但不是全部)大麻素化合物的适度的钙响应。尤其是，检测到响应于次大麻二酚(cbdv)、大麻色原烯(cbc)、大麻二酚(cbd)、大麻二酚酸(cbda)和大麻萜酚酸(cbga)的钙通量。这种钙响应在没有trpv1的细胞中只有极少或不存在，表明钙响应由trpv1介导。
已经观察到：(i)月桂烯显著地促进了trpv1介导的钙响应，但是没有占萜烯混合物的钙流入信号的100％(图4)；和(ii)萜烯混合物反过来有助于trpv1介导的钙响应，但不占品系a混合物的钙流入信号的100％(图2a至图2c)，我们测试了不包括月桂烯的品系a混合物(“cbmix”)的大麻素和萜烯的混合物是否影响多药耐药蛋白(mrp)介导的月桂烯(生物活性配体)的输出。如图10所示，cbmix的应用显著抑制了mrp介导的荧光标志物cfda的输出。不希望受到理论的束缚，这表明cbmix中的萜烯和大麻素的混合物可以通过阻断mrp介导的月桂烯输出来增强月桂烯的trpv1激动作用。例如，cbmix可以延迟月桂烯从细胞流出并增加每单位剂量月桂烯的比活性。
4.10.7.实施例7：月桂烯对trpv1的脱敏作用
比较了各种浓度的月桂烯和辣椒素的trpv1激动作用。具体地，分别计算月桂烯和辣椒素的钙响应曲线的曲线下面积(auc)，并绘制在图14a中的相应浓度上。需要更高浓度的月桂烯来诱导与辣椒素相同的钙流入。例如，当根据钙响应曲线的20nm至300nm之间的auc确定钙流入的程度时，约200nm的月桂烯和约30nm的辣椒素诱导钙流入至类似的程度。
还比较了月桂烯和辣椒素对trpv1的长期作用。如图14b所示，在暴露于每种化合物24小时后，月桂烯和辣椒素均引起trpv1的脱敏。例如，当月桂烯被首次引入到表达trpv1的细胞中时，月桂烯诱导钙通量以产生auc为66(20nm至300nm)的响应曲线。然而，在细胞用月桂烯孵育24小时后，月桂烯诱导auc为32的钙响应。因此，用月桂烯预孵育可将稍后的钙响应抑制52％。同样，当辣椒素被首次引入表达trpv1的细胞中时，辣椒素诱导钙流入，从而产生auc为124的响应曲线。在细胞用辣椒素孵育24小时后，辣椒素诱导auc为38的钙响应。因此，用辣椒素预孵育将稍后的钙响应抑制69％。
将月桂烯和辣椒素对trpv1的长期脱敏作用与作为对照化合物的离子霉素的长期作用进行比较。与月桂烯或辣椒素一样，离子霉素的最初应用会诱导钙流入，从而产生auc为128的响应曲线。然而，离子霉素的长期脱敏作用小于月桂烯或辣椒素。如图14b所示，用500nm离子霉素的预孵育分别使稍后响应于月桂烯或辣椒素的钙流入减少仅27％或38％。
数据表明，月桂烯是有效的trpv1激动剂，其以与辣椒素相似的方式起作用。月桂烯在短时间暴露后可诱导trpv1介导的钙流入，长时间暴露后引起trpv1脱敏。这表明月桂烯可以用作有效的trpv1激动剂，治疗与trpv1相关的各种疾病，辣椒素目前用于治疗上述疾病。月桂烯可代替辣椒素作为药物活性成分用于各种适应症。
4.10.8.实施例8：网络药理平台
为了评估我们原始的大麻品系a混合物中具有显著trpv1激动剂作用的月桂烯和橙花叔醇对其他trp通道是否有作用，我们开发了一种计算机模拟预测方法，称为gb科学网络药理平台。
节点和边缘数据从http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/结果页面源中提取。数据包含源信息和靶标信息以及用于在网站上生成cytoscape网络图的组分配。节点和边缘文本文件作为逗号分隔文件(csv)被加载到r统计分析程序中。
清除了文件中多余的标签和特殊字符，然后使用dplyr库将其排列到具有明确定义的变量列和观察行的节点和边缘数据帧中。节点数据按照batman分配被重新分配组名称，并使用dplyr库按字母顺序进行排序。边缘数据帧用于使用网络库生成定向网络数据对象。网络对象具有添加到其的两个变量：(i)来自节点数据帧的已排序的组分配，和(ii)从边缘列表计算并使用sna库分配给每个节点的freeman度属性。网络图表通过来自ggnetwork和ggrepel库的图形解释器绘制，这些解释器从网络对象绘制图形，并使用格式化参数设置样式。
图16a示出了月桂烯的靶标分析和疾病预测网络。该网络中存在多个trp通道表明，月桂烯的功效可能会超出trpv1，延伸到其他伤害感受性神经元，其中主要的疼痛传导通道是不同的trp。图16b示出了橙花叔醇的靶标分析和疾病预测网络。网络中存在多个trp通道表明，橙花叔醇的功效并未显著增加未指明月桂烯的trp通道。
图11示出了治疗靶标数据库(td)富集分析倾向于优先考虑月桂烯而不是橙花叔醇用于疼痛和心血管适应症的发展。此外，月桂烯显著有助于为天然大麻设置的预测疾病靶标。
图12示出了预测各种离子通道靶标用于通过月桂烯的直接或间接调节。
通过引用的合并
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件通过引用整体结合于此，以用于所有目的，其程度与好像每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独指示为出于所有目的通过引用并入相同。
等同物
尽管已经示出和描述了各种具体实施方案，但是以上说明不是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以做出各种改变。通过阅读本说明书，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。
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