包含天然混合提取物的用于预防或治疗肥胖症的组合物的制作方法

[0001]
本发明涉及包含桂枝(cinnamomi twigs)的混合提取物的用于预防或治疗肥胖症的组合物，且更具体地，涉及包含桂枝和牡丹根皮(moutan root bark)的混合提取物的用于预防或治疗肥胖症的药物组合物、包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物的用于预防或减轻(改善，)肥胖症的保健功能食品组合物和饲料组合物、以及用于预防或治疗肥胖症的方法，其包括向个体给予药物组合物。


背景技术：

[0002]
随着现代社会各种技术的发展，人类享受着富裕和舒适的生活条件。结果，体育活动减少了，且因此卡路里的消耗变得少于卡路里的摄入。因此，疾病(如超重和肥胖)在全世界不断增加。据世界卫生组织(who)，目前全世界约有16亿人肥胖或超重，且预计肥胖人口还将持续增加。在韩国同样由于西方化的饮食和体育活动的缺乏，肥胖人口有迅速增加的趋势。据报道，2013年韩国成年男性肥胖症率为37.6％，且成年女性肥胖症率为28.0％，并且预计今后这些数字还会增加。由于肥胖症可能增加诸如心血管疾病、高脂血症、肝功能下降、糖尿病、内分泌失调、肺功能障碍和各种癌症的并发症的发生率，who(在2000年)已将肥胖症列为主要的健康问题，而非简单的美容问题。
[0003]
肥胖症是由能量摄入和能量消耗之间的不平衡导致的，并且在世界范围内已经对通过抑制脂肪酶(将剩余能量存储在脂肪细胞中以增加脂肪细胞的数量和大小的酶)来预防或治疗肥胖症的方法进行了广泛的研究。
[0004]
作为用于肥胖症的治疗剂的代表性实例，克塞利科
tm
(xenical
tm
)(奥利斯泰)是胰脂酶抑制剂，其具有抑制大约30％的饮食脂肪吸收的优异功效，且作为用于长期给予的药物，其安全性已被批准(fda，美国)。虽然克塞利科
tm
是世界上最畅销的药物产品，但在临床试验(长期给予2年)中，其效果并不优于仅通过饮食治疗肥胖症的实验组的效果，并且确认了诸如面瘫、胃肠障碍、超敏反应、胆汁分泌受阻、和脂溶性维生素吸收抑制的副作用。特别地，已经证明了腹泻、便秘、消化不良等导致的日常生活中的严重不适。由于确认了心血管副作用，诺美婷
tm
(reductil
tm
)(西布曲明(sibutramine))已经退出市场。已经观察到，在服用诺美婷
tm
的人群中发生心血管问题的数量相比对照组高16％。由于精神病方面的副作用(如抑郁症)，欧盟(eu)撤销了阿康普利亚(acomplia
tm
)(rimonabat(利莫那班))的批准。已报道，康塔芙(contrave
tm
)(纳曲酮/丁氨苯丙酮)可能影响自杀冲动和自杀倾向。
[0005]
如上所述，目前市场上的用于肥胖症的治疗剂存在严重的问题，且因此迫切需要开发具有改进的功效且无副作用的治疗剂。作为克服这些问题的方法，利用天然物质的治疗剂(其安全性已经得到证实)开发备受关注。已经对使用天然物质的用于肥胖症的治疗剂和用于预防或减轻肥胖症的保健功能食品进行了广泛的研究。
[0006]
同时，桂枝是桂皮树(或肉桂树)的幼枝，桂皮树是樟科中樟属(genuscinnamomum)的高大常绿乔木，并具有辛辣和甜味以及温性，影响心、肺、和膀胱。已知桂枝健胃、抑制中风、具有止痛和强心的作用、扩张皮肤血管、刺激汗
腺发汗导致解热作用、并具有抗病毒作用。桂枝也用于治疗寒战、发烧、头痛、身体疼痛、排汗不足、和心悸。桂枝为长圆柱形，带有许多分枝，且长度为30cm至70cm，以及粗部直径为0.3cm至1cm。表面有红棕色或棕色的垂直脊线，并具有细褶皱和小块形式的叶和枝的痕迹。桂枝具有坚硬、易碎、且易切割的性质，主产于中国的广西和广东省，且在越南、斯里兰卡和印度也有栽培。作为桂枝的药理实验结果，已经揭示其排汗、解热、止痛、强心、抗过敏、和抗病毒作用。
[0007]
牡丹根皮因其寒性，被用作东方医学治疗血液外渗的消炎促凝剂。已知其对下腹部器官的血管系统中的炎症、因淤血引起的疼痛、发热、化脓、出血等的药用作用(特别地，对于月经不调、子宫和附件中的炎症、淤血和牵引痛的抗炎、收缩(镇痛，)、解痉)，以及牡丹根皮还应用于治疗痔疮和阑尾炎。


技术实现要素：

[0008]
[技术问题]
[0009]
因此，本发明人已经确认，桂枝和牡丹根皮的混合提取物可以经由抑制脂肪吸收来治疗超重和肥胖症，并且该混合提取物没有常规治疗剂导致的腹泻的副作用，从而完成本发明。
[0010]
[技术方案]
[0011]
本发明的目的是提供用于预防或治疗肥胖症的药物组合物，其包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0012]
本发明的另一目的是提供桂枝和牡丹根皮的混合提取物用于预防或治疗肥胖症的用途。
[0013]
本发明的另一目的是提供用于预防或减轻肥胖症的保健功能食品组合物，其包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0014]
本发明的另一目的是提供用于预防或减轻肥胖症的饲料组合物，其包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0015]
本发明的另一目的是提供预防或治疗肥胖症的方法，其包括向个体给予桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0016]
[技术效果]
[0017]
本发明的桂枝和牡丹根皮的混合提取物可抑制与肥胖症密切相关的体内脂肪吸收和脂肪细胞的大小增加，抑制或治疗相关因子(如胆固醇和甘油三酯(中性脂肪，收和脂肪细胞的大小增加，抑制或治疗相关因子(如胆固醇和甘油三酯(中性脂肪，))的异常增加，和抑制腹泻(其是常规治疗剂的严重副作用)。因此，混合提取物可广泛用于预防或治疗肥胖症的药物组合物的开发。
附图说明
[0018]
图1是示例桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)、牡丹根皮提取物、桂枝提取物在脂肪细胞系(3t3l1)中对脂肪细胞分化抑制作用的图表(
**
p<0.01，与对照比较、
##
p<0.01，与运载体比较、
#
p<0.05，与运载体比较)。
[0019]
图2是示例桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)的体内脂肪吸收抑制作用的图表
(均值
±
平均标准误差。
*
p<0.05，与对照比较、
#
p<0.05，与油乳剂比较)。
[0020]
图3是示例在高脂肪饮食喂养小鼠中桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)对体重变化的图表(nor：正常脂肪饮食喂养组，hfd：高脂肪饮食喂养组，cmo1-0.1％：hfd加0.1％cmo1(w/w；70mg/kg/天)，cmo1-0.25％：hfd加0.25％cmo1(w/w；190mg/kg/天)，克塞利科-0.1％：hfd加0.1％克塞利科(w/w；210mg/kg/天)(均值
±
平均标准误差。
*
p<0.05，与hfd组比较)。
[0021]
图4是示例桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)对高脂肪饮食喂养小鼠中每日食物摄入量的影响的图表(nor：正常脂肪饮食喂养组，hfd：高脂肪饮食喂养组，cmo1-0.1％：hfd加0.1％cmo1(w/w；70mg/kg/天)，cmo1-0.25％：hfd加0.25％cmo1(w/w；190mg/kg/天)，克塞利科-0.1％：hfd加0.1％克塞利科(w/w；210mg/kg/天))。
[0022]
图5是示例桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)对高脂肪饮食喂养小鼠中体脂重量的影响的图表(nor：正常脂肪饮食喂养组，hfd：体脂重量(body fat weight)，cmo1-0.1％：hfd加0.1％cmo1(w/w；70mg/kg/天)，cmo1-0.25％：hfd加0.25％cmo1(w/w；190mg/kg/天)，克塞利科-0.1％：hfd加0.1％克塞利科(w/w；210mg/kg/天)。均值
±
平均标准误差，
*
p<0.05，与nor组比较、
#
p<0.05，与hfd组比较)。
[0023]
图6显示用苏木精和伊红染色的脂肪细胞的石蜡切片，其示例白色脂肪组织的形态学和脂肪细胞的大小(nor：正常脂肪饮食喂养组，hfd：高脂肪饮食喂养组，cmo1-0.1％：hfd加0.1％cmo1(w/w；70mg/kg/天)，cmo1-0.25％：hfd加0.25％cmo1(w/w；190mg/kg/天)，克塞利科-0.1％：hfd加0.1％克塞利科(w/w；210mg/kg/天)。均值
±
平均标准误差，
*
p<0.05，与nor组比较、
#
p<0.05，与hfd组比较)。
[0024]
图7显示了示例桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)对血液中脂质含量的影响的图表(nor：正常脂肪饮食喂养组。hfd：高脂肪饮食喂养组，cmo1-0.1％：hfd加0.1％cmo1(w/w；70mg/kg/天)，cmo1-0.25％：hfd加0.25％cmo1(w/w；190mg/kg/天)，克塞利科-0.1％：hfd加0.1％克塞利科(w/w；210mg/kg/天)。均值
±
平均标准误差；
*
p<0.05，与nor组比较、
#
p<0.05，与hfd组比较)。
[0025]
图8显示了桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)对高脂肪饮食喂养的小鼠中脂肪肝的影响。在肝细胞中，脂肪通过油红o染色鉴定(hfd：高脂肪饮食喂养组，cmo1-0.1％：hfd加0.1％cmo1(w/w；70mg/kg/天)，cmo1-0.25％：hfd加0.25％cmo1(w/w；190mg/kg/天)，克塞利科-0.1％：hfd加0.1％克塞利科(w/w；210mg/kg/天)。均值
±
平均标准误差，
*
p<0.05，与nor组比较、
#
p<0.05，与hfd组比较)。
[0026]
图9是用于验证腹泻是否存在的图，腹泻是克塞利科
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的严重副作用。
具体实施方式
[0027]
作为开发用于有效治疗肥胖症的治疗剂的集中努力的结果，本发明人发现了桂枝的混合提取物，具体地，桂枝和牡丹根皮的混合提取物，对肥胖症具有治疗作用。具体地，确认了桂枝和牡丹根皮的混合提取物显著地抑制体内脂肪吸收(表明对肥胖症的预防或治疗作用)，并且没有常规治疗剂的副作用。
[0028]
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了用于预防或治疗肥胖症的药物组合物，其包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0029]
此外，本发明的另一方面提供了桂枝和牡丹根皮的混合提取物用于预防或治疗肥胖症的用途。
[0030]
如本文所用，术语“桂枝”是桂皮树(或肉桂树)的幼枝，桂皮树是樟属的高大常绿乔木，并具有辛辣和甜味以及温性，影响心、肺、和膀胱。已知桂枝健胃、抑制中风、具有止痛和强心的作用、扩张皮肤血管、刺激汗腺发汗导致解热作用、和抗病毒作用。桂枝也用于治疗寒战、发烧、头痛、身体疼痛、排汗不足、和心悸。桂枝为长圆柱形，带有许多分枝，且长度为30cm至70cm，并且粗部直径为0.3cm至1cm。表面有红棕色或棕色的垂直脊线，并具有细褶皱和小块形式的叶和枝的痕迹。桂枝具有坚硬、易碎、且易切割的性质，主产于中国的广西和广东省，且在越南、斯里兰卡和印度也有栽培。对于桂枝的药理实验结果表明，已经揭示其排汗、解热、止痛、强心、抗过敏、和抗病毒作用。
[0031]
如本文所用，术语“牡丹根皮”是重要的本草，其很久以前就开始被使用，并且因其寒性被用作东方医学治疗血液外渗的消炎促凝剂。已知其对下腹部器官的血管系统的炎症、因淤血引起的疼痛、发热、化脓、出血等的药用作用(特别地，用于月经不调、子宫和附件中的炎症、淤血和牵引痛的抗炎、收缩、解痉)，以及牡丹根皮还应用于治疗痔疮和阑尾炎。
[0032]
桂枝和牡丹根皮可在野外采集、养殖、或商业购买，但不限于此。
[0033]
如本文所用，术语“提取物”是指使用至少一种溶剂获得的物质，且用于制备提取物的溶剂的实例可包括水、c1至c4醇、优选地，甲醇、乙醇、丁醇，以及它们的任何混合溶剂，但不限于此。作为提取方法，可以使用高温减压提取、热水提取、回流提取、水热提取、浸渍提取、室温提取、回流冷却提取、超声提取、或蒸汽提取，但不限于此。
[0034]“混合提取物”可以通过分别提取桂枝和牡丹根皮，然后混合提取物来制备，或者也可以通过混合桂枝和牡丹根皮，然后提取来制备。
[0035]
桂枝和牡丹根皮可以以1:1至1:10的重量比混合，特别地以1:1、1:2、1:4、1:8、2:1、4:1、或8:1的重量比混合，但不限于此。
[0036]
如本文所用，术语“肥胖症”是指身体中脂肪组织过多的健康状况。当一个人的体表指数(通过将一个人的体重(kg)除以他/她的身高的平方(m2)得到的值)为25或更高时，此人被定义为是肥胖的。当能量摄入量超过能量消耗量的情况持续很长时间时，由能量失衡导致肥胖，并且从血浆引入到脂肪细胞中的脂肪酸和葡萄糖被酯化并主要以甘油三酯的形式积累。
[0037]
如本文所用，术语“预防”是指通过给予包含根据本发明的桂枝和牡丹根皮的混合提取物的组合物而导致肥胖症的抑制或延迟的任何行为。
[0038]
如本文所用，术语“治疗”是指通过给予包含根据本发明的桂枝和牡丹根皮的混合提取物的组合物而导致肥胖症状的改善或有益改变的任何行为。
[0039]
如本文所用，术语“药物组合物”是指为预防或治疗疾病的目的而制备的组合物，并且可以根据本领域中常用的方法以各种形式配制。例如，药物组合物可以被配制成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、或糖浆剂，且也可以被配制成外用制剂、栓剂、和无菌注射溶液。具体地，药物组合物可以被配制成适于给予到眼睛的制剂，例如滴眼剂、乳膏、软膏剂、凝胶剂、或洗剂。
[0040]
本发明的组合物可以被配制成用于预防或治疗肥胖症的药物组合物，其包含通常用于制备药物组合物的任何载体、赋形剂、或稀释剂。载体可以包括非天然存在的载体。
[0041]
在本发明中，包含于药物组合物中的载体、赋形剂、和稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、褐藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、和矿物油。
[0042]
对于制剂，可以使用典型使用的稀释剂或赋形剂，如填料、增稠剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、或类似物。口服给予的固体制剂可包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、和类似物。这样的固体制剂可以通过与至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、或明胶)混合来制备。除了单纯的赋形剂以外，还可使用润滑剂(如硬脂酸镁或滑石)。用于口服给予的液体制剂可以是混悬剂、用于内服的制剂、乳剂、糖浆剂、或类似物，并且除了本领域中常用的简单稀释剂(如水或液体石蜡)之外，还可以包括各种赋形剂(如湿润剂、增甜剂、芳香剂、和保存剂)。用于肠外给予的制剂可包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂、和类似物。非水溶剂和混悬剂可以是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯)、或类似物。栓剂的基质可以包括维特普索(witepsol)、聚乙二醇吐温61、可可脂、甘油三月桂酸酯甘油明胶、或类似物。
[0043]
本发明药物组合物的剂量可由本领域普通技术人员根据使用目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别、或病史、或用作有效成分的物质的类型来确定。例如，本发明的药物组合物可以以每个成人约0.1ng至约1000mg/kg，具体地，约1ng至约1000mg/kg的量给予，并且给予频率可以是但不特别限于每天一次或每天多次分次服用。然而，本发明的范围不以任何方式受该剂量的限制。
[0044]
在本发明的实施方式中，当给予了桂枝和牡丹根皮的混合提取物时，确认了与给予了桂枝提取物或牡丹根皮提取物中的任一种时相比，脂肪细胞分化抑制效果提高(图1)、甘油三酯总量显著减少(图2)、体重增加被显著抑制(图3)、腹部脂肪和脂肪重量的变化受到抑制、以及脂肪堆积导致的脂肪细胞肥大被抑制(图4至图6)。此外，当给予了桂枝和牡丹根皮的混合提取物时，确认了总胆固醇、甘油三酯、和ldl胆固醇、和游离脂肪酸的浓度显著减少(图7)，增加的肝重量和肝细胞中的脂质面积显著降低，并且肝组织中甘油三酯的量显著减少(图8)。
[0045]
特别地，虽然对照药物克塞利科
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具有严重腹泻的副作用，但在向小鼠给予桂枝和牡丹根皮的混合提取物期间，体毛正常并且没有观察到频繁腹泻，表明了克服克塞利科
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的严重副作用的效果(图9)。
[0046]
本发明的另一方面提供了用于预防或减轻肥胖症的保健功能食品组合物，其包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0047]
此外，本发明的另一方面提供了用于预防或减轻肥胖症的食物组合物，其包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0048]
如本文所用，术语“桂枝”、“牡丹根皮”、“混合”、“提取物”、“肥胖症”和“预防”如上文所定义。
[0049]
本发明的保健功能食品组合物或食品组合物进一步可以包括饮食学可接受的载体。
[0050]
如本文所用，术语“减轻”是指由于组合物的给予而使肥胖症好转或有益地改变的任何行为。
[0051]
此外，减轻还可能意味着通过减少和弱化目前可用的治疗剂的副作用，让肥胖者过上平常的生活。
[0052]
添加了包括本发明的桂枝混合提取物的组合物的食品的实例没有特别的限制，可以是例如各种饮料、口香糖、茶、维生素复合物、和膳食补充剂。食品组合物进一步可以包含不抑制对肥胖症的治疗效果的任何其它成分，且其类型不受特别限制。例如，食品组合物与其它食品一样，可进一步包括各种本草提取物、饮食学上可接受的食品辅助添加剂、或天然碳水化合物。
[0053]
食品辅助添加剂可以是用于制备每种剂型的食品组合物的添加剂，并且可以由本领域普通技术人员适当地选择。例如，可包括各种营养素、维生素、矿物质、香料(如合成和天然香料)、着色剂和填料、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、在苏打中使用的碳酸化剂，但不限于此。
[0054]
被包括在食品中的提取物的量没有特别的限制，但是基于食品组合物的总重量，可以在0.01wt％至100wt％，优选地1wt％至80wt％的范围内。
[0055]
当食品是饮料时，基于100ml的食品，提取物可以以1g至30g，优选地3g至20g的量被包含在其中。此外，组合物可进一步包括通常用于食品组合物中的能够改善气味、味道、外观等的附加成分。例如，组合物可以包括维生素a、维生素c、维生素d、维生素e、维生素b1、维生素b2、维生素b6或维生素b12、烟酸、生物素、叶酸、泛酸、或类似物)。此外，组合物可以包括诸如锌(zn)、铁(fe)、钙(ca)、铬(cr)、镁(mg)、锰(mn)、或铜(cu)的矿物质。此外，组合物可包括氨基酸(如赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、或缬氨酸)。此外，食品添加剂(如防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢乙酸钠、或类似物)、消毒剂(漂白粉、高效漂白粉、次氯酸钠、或类似物)、抗氧化剂(丁基羟基苯甲醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、或类似物)、着色剂(焦油色、或类似物)、显色剂(亚硝酸钠)、漂白剂(亚硫酸钠)、调味剂(谷氨酸一钠(msg)、或类似物)、增甜剂(甘素、甜蜜素糖精、钠、或类似物)、香料(香兰素、内酯、或类似物)、溶胀剂(明矾、d-酒石酸氢钾、或类似物)、强化剂、乳化剂、增稠剂(胶粘剂)、成膜剂、胶基剂消泡剂、溶剂、和改良剂)可以被添加到其中。添加剂可根据食品种类选择并以适当的量使用。
[0056]
本发明的保健功能食品组合物可以使用本领域中常用的方法制备。在其制备时，可以向其中加入本领域中常用的物质和成分。保健功能食品组合物可以被不受限制地制备成任何被认为是保健功能食品组合物的剂型。本发明的保健功能食品组合物可以被制备成各种剂型，并且与一般药物相比具有的优点在于，因为该食品组合物基于食品原料，所以不存在长期摄入药物时可能出现的副作用。此外，本发明的保健功能食品组合物具有高便携性，使得其可以作为促进对肥胖症的预防或减轻效果的补充剂被摄取。
[0057]
本发明的另一方面提供用于预防或减轻肥胖症的饲料组合物，其包含桂枝和牡丹根皮的混合提取物。
[0058]
如本文所用，术语“桂枝”、“牡丹根皮”、“混合”、“提取物”、“肥胖症”、和“预防”如上文所定义。
[0059]
饲料组合物进一步可包括饲料学上可接受的载体。
[0060]
添加了包括本发明的桂枝混合提取物的组合物的饲料的实例没有特别限制，可以是例如各种饮料、口香糖、茶、维生素复合物、和膳食补充剂。饲料组合物可以进一步包括不
抑制对肥胖症的治疗效果的任何其它成分，且其类型不受特别限制。例如，饲料组合物与其它饲料一样，可进一步包括各种本草提取物、食品、饲料学上可接受的饲料辅助添加剂、或天然碳水化合物。
[0061]
饲料辅助添加剂可以是用于制备每种剂型的食品组合物的添加剂，并且可以由本领域普通技术人员适当地选择。例如，可包括各种营养素、维生素、矿物质、香料(如合成和天然香料)、着色剂和填料、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、在苏打中使用的碳酸化剂，但不限于此。
[0062]
就这一点而言，包含于饲料中的提取物的量没有特别的限制，但是基于饲料组合物的总重量，可以在0.01wt％至100wt％，优选地1wt％至80wt％的范围内。
[0063]
本发明的另一方面提供了预防或治疗肥胖症的方法，其包括向患有肥胖症或有发展成肥胖症的风险的个体给予药物组合物。
[0064]
如本文所用，术语“桂枝”、“牡丹根皮”、“混合”、“提取物”、“肥胖症”、和“治疗”如上文所定义。
[0065]
如本文所用，术语“个体”是指患有肥胖症的哺乳动物，如大鼠和家畜。
[0066]
组合物可以以药学上有效量以单剂量或多剂量给予。
[0067]
本发明用于预防或治疗肥胖症的药物组合物的给予可以经由任何常规给予途径进行给予，以将组合物递送至目标组织。
[0068]
本发明的药物组合物可以根据期望的目的经由以下给予途径给予，如滴眼剂给予、腹腔内给予、静脉内给予、肌肉内给予、皮下给予、皮内给予、透皮贴剂给予、口服给予、鼻内给予、肺内给予、和直肠给予，具体地，经由口服给予，但不限于此。
[0069]
实施例
[0070]
实施例1.桂枝和牡丹根皮的混合提取物的制备
[0071]
桂枝和牡丹根皮被用于以下实施例，并保存在韩国韩医学研究院(korea institute of oriental medicine)糖尿病并发症研究小组的冷室中。
[0072]
1-1.桂枝和牡丹根皮(1:1)的提取物(cmo1)的制备
[0073]
通过将12g桂枝和12g牡丹根皮以1:1的比例混合，将混合物(共24g)加入到144ml的50％乙醇中，并在约50℃下回流，重复提取所得物两次持续约3小时，制备了桂枝和牡丹根皮的提取物(cmo1)。
[0074]
1-2.桂枝和牡丹根皮(1:1)的水热提取物(cmo1-1)的制备
[0075]
通过将90g桂枝和90g牡丹根皮以1:1的比例混合，将混合物(共180g)加入到1080ml纯净水中，并在本草煎煮机中在水热条件下提取所得物持续约2小时，制备了桂枝和牡丹根皮的水热提取物(cmo1-1)。
[0076]
1-3.桂枝和牡丹根皮(1:2)的提取物(cmo2)的制备
[0077]
以与实施例1-1中相同的方式制备了桂枝和牡丹根皮的提取物(cmo2)，不同之处在于将10g桂枝和20g牡丹根皮以1:2的比例混合，将混合物(共30g)加入到180ml的50％乙醇中，并在约50℃下回流，重复提取所得物两次持续约3小时。
[0078]
1-4.桂枝和牡丹根皮(1:2)的水热提取物(cmo2-1)的制备
[0079]
以与实施例1-2中相同的方式制备了桂枝和牡丹根皮的水热提取物(cmo2-1)，不同之处在于将60g桂枝和120g牡丹根皮以1:1的比例混合，将混合物(共180g)加入到1080ml
的纯净水中，并将在本草煎煮机中在水热条件下提取所得物持续约2小时。
[0080]
1-5.桂枝和牡丹根皮(1:4)的提取物(cmo3)的制备
[0081]
以与实施例1-1中相同的方式制备了桂枝和牡丹根皮的提取物(cmo3)，不同之处在于将6g桂枝和24g牡丹根皮以1:4的比例混合，将混合物(共30g)加入到180ml的50％乙醇中，并在约50℃下回流，重复提取所得物两次持续约3小时。
[0082]
1-6.桂枝和牡丹根皮(1:4)的水热提取物(cmo3-1)的制备
[0083]
以与实施例1-2中相同的方式制备了桂枝和牡丹根皮的水热提取物(cmo3-1)，不同之处在于将36g桂枝和144g牡丹根皮以1:4的比例混合，将混合物(共180g)加入到1080ml的纯净水中，并在本草煎煮机中在水热条件下提取所得物持续约2小时。
[0084]
1-7.桂枝和牡丹根皮(1:8)的提取物(cmo4)的制备
[0085]
以与实施例1-1中相同的方式制备了桂枝和牡丹根皮的提取物(cmo4)，不同之处在于将3.5g桂枝和28g牡丹根皮以1:8的比例混合，将混合物(共31.5g)加入到190ml的50％乙醇中，并在约50℃下回流，重复提取所得物两次持续约3小时。
[0086]
1-8.桂枝和牡丹根皮(1:8)的水热提取物(cmo4-1)的制备
[0087]
以与实施例1-2中相同的方式制备了桂枝和牡丹根皮的水热提取物(cmo4-1)，不同之处在于将20g桂枝和160g牡丹根皮以1:8的比例混合，将混合物(共180g)加入到1080ml的纯净水中，并在本草煎煮机中在水热条件下提取所得物持续约2小时。
[0088]
实施例2.细胞系中桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)、牡丹根皮提取物、和桂枝提取物的脂肪细胞分化抑制作用的比较
[0089]
2-1.cmo1、牡丹根皮提取物、和桂枝提取物的脂肪细胞分化抑制作用的比较
[0090]
将从3t3-l1分化的脂肪细胞在96孔板中培养了4天。用ibmx、胰岛素、和地塞米松的混合溶液(阴性对照)、桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1 10)、牡丹根皮提取物(牡丹根皮5)、和桂枝提取物(桂枝5)分别处理了培养的脂肪细胞(第0天)。3天后，更换了胰岛素溶液(第3天)。此后，在每2至3天更换胰岛素溶液的同时，继续培养至第14天。
[0091]
为了测量脂肪细胞的分化程度，使用了脂肪生成测定试剂盒(adipogenesis assay kit)(cayman chemical，ann arbor，mi，美国)。将细胞固定并用油红o溶液染色约20分钟，然后用提取溶液洗脱了油红o，随后测量在492nm处的吸光度。
[0092]
2-2.实验结果
[0093]
结果，虽然在阴性对照中脂肪细胞分化被促进了4倍，但在用桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)处理的实验组中，脂肪细胞分化与阴性对照相比降低了56％，表现出优异的抑制效果。然而在单独用牡丹根皮提取物和单独用桂枝提取物——其是桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1)的成分——处理的实验组中，脂肪细胞分化分别降低了41％和10％。即，通过给予cmo1获得的脂肪细胞分化抑制效果，与通过单独给予桂枝获得的脂肪细胞分化抑制效果相比增强了46％，并且与通过单独给予牡丹根皮获得的脂肪细胞分化抑制效果相比增强了15％。因此，可以确认与单独给予桂枝或牡丹根皮相比，通过给予桂枝和牡丹根皮的混合提取物获得优异的协同效应(图1)。
[0094]
实施例3.体内脂质载荷试验(in vivo lipid loading test)
[0095]
进行了下面的实验以分析实验动物抑制体内脂肪吸收的能力。
[0096]
3-1.实验方法
[0097]
将6周龄雄性sprague dawley(sd)大鼠(dbl，eumseong，韩国)驯化了一周并禁食16小时。将6ml的玉米油(sigma，mo，美国)、80mg的胆酸(sigma，mo，美国)、2mg的胆固醇油酸酯(sigma，mo，美国)、和6ml无菌盐水(jw choongwae pharm，韩国)混合并超声处理以制备脂质乳液。随后，将作为试验药物的桂枝和牡丹根皮的混合提取物(cmo1，100mg/kg)，和作为阳性对照的克塞利科
tm
(奥利斯泰，10mg/kg)混合。以5ml/kg的体积口服给予药物，阴性对照用等量的无菌生理盐水给予，且阳性对照用不包含该药物的等量的脂质乳液给予。在给予试验药物之前和之后的30、60、120、和180分钟，从尾静脉收集了血液并以5000rpm离心10分钟以分离血浆，并且利用tg测定试剂盒(asan pharm，韩国)分析了血液中三酰甘油酯(tg)的浓度。
[0098]
通过应用人体等效剂量换算因子(human equivalent dose conversion factor)6.2计算出克塞利科
tm
的给予浓度是约12mg/kg，该换算因子是基于大鼠的体表面积，从用于体重为60kg的成年人的120mg的给予浓度转换而来。在这项试验中，向大鼠给予了10mg/kg的克塞利科
tm
。
[0099]
3-2.实验结果
[0100]
如图2中所示，与阴性对照组相比，在油乳剂给予组中，吸收到血中的甘油三酯的浓度直到2小时呈增加趋势，而此后略有降低。然而，在cmo1混合物给予组(250mg/kg)中，脂质吸收被延迟，从而抑制血液中甘油三酯的增加。3小时血液中甘油三酯总量(tg auc)的分析结果也显示，在给予高浓度cmo1的混合物给予组中甘油三酯总量的增加被显著抑制。通过该试验，确认了cmo1混合物经由肠道中的脂质吸收抑制机制抑制了血液中甘油三酯的增加。
[0101]
实施例4：在由高脂肪饮食诱导的肥胖症模型中通过重复给予8周的抗肥胖症效果
[0102]
4-1.实验方法
[0103]
(1)实验动物的饲养和实验设计
[0104]
在被驯化一周后使用了6周龄雄性c57bl/6小鼠(orient bio)。喂养了高脂肪饮食以诱发肥胖症。d12451(卡路里组成：45％的脂肪、35％的碳水化合物、和20％的蛋白质，research diets，inc.)被用作高脂肪饮食，且purina啮齿动物食物(purina rodent chow)被用作正常饮食。允许小鼠自由获取饲料和饮用水。以0.1％(w/w)和0.25％(w/w)的重量比将cmo1混合物与d12541饲料一起给予。克塞利科
tm
(奥利斯泰，sigma，mo，美国)作为对照药物，以0.1％(w/w)的重量比与d12541饲料一起给予。基于平均日饲料摄入量计算的cmo1混合物的日剂量在0.1％的情况下为70mg/kg/天，而在0.25％的情况下为190mg/kg/天，且克塞利科
tm
的日剂量为210mg/kg/天。每周测量了体重和饲料摄入量，并且8周后在尸体解剖中切除了器官并称重，然后保存在-80℃下。
[0105]
(2)血液生化分析
[0106]
在尸体解剖中，在深麻醉下剖腹术后，从腹部静脉采集了血液。根据分析条件将血液储存在低温冰箱中，并在开始实验前立即解冻。使用自动血液生化分析仪(hitachi，日本)分析了总胆固醇、甘油三酯、hdl胆固醇、和ldl胆固醇的水平。
[0107]
(3)脂肪细胞的形态学大小变化的测量
[0108]
为了分析脂肪堆积导致的脂肪细胞和肝细胞的大小变化，用10％中性福尔马林(neutralized formalin)(microme，美国)固定器官24小时，经由一般的组织处理过程包埋
到石蜡块中，然后切片成4μm薄片。将切片水合并用苏木精和伊红(h&e)染色。使用光学显微镜(bx51，olympus，日本)观察了染色组织以测量细胞的大小。
[0109]
(4)油红o染色
[0110]
在尸体解剖中，收集肝组织，固定在包含20％蔗糖的bouin's溶液中，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，干燥，并固定在作为恒冷切片包埋介质的光学切割温度化合物(optical cutting temperature compound)(finetek，ca，美国)中以制备恒冷切片块，并使用组织切片机进行切片。肝组织切片通过自由浮动法(free floating method)用油红o染色，并使用光学显微镜观察以获得其图像。
[0111]
(5)统计分析
[0112]
每个实验的所有测量值被表示为均值
±
标准误差。采用graphpad prism程序5.0版本(graphpad，ca，美国)，采用方差分析和作为事后分析的tukey多重比较检验，进行了统计学分析，以测量显著差异。p值小于0.05被认为统计上显著的。
[0113]
4-2.实验结果
[0114]
(1)体重的变化
[0115]
测量8周体重变化的结果，与正常饮食喂养组相比，高脂肪饮食喂养组的体重在1周后持续增加，并且与高脂肪饮食喂养组相比，cmo1给予组(0.25％)的体重增加在4周后被显著抑制。
[0116]
(2)饲料摄入量的变化
[0117]
在cmo1给予组中，8周饲料摄入量没有观察到变化(图4)。
[0118]
(3)腹部脂肪和脂肪重量的变化
[0119]
虽然在高脂肪饮食喂养组中，附睾脂肪、肾周脂肪、和皮下脂肪的重量增加3到4倍的同时，但在cmo1给予组(0.25％)中，重量的增加被显著抑制(图5)。
[0120]
(4)脂肪细胞的大小
[0121]
虽然在高脂肪饮食喂养组中，脂肪细胞的大小增加了1.6倍或更多，但在cmo1给予组(0.25％)中，由于脂肪堆积而引起的脂肪细胞肥大被显著抑制(图6)。
[0122]
(5)血液中脂质含量的变化
[0123]
虽然与正常饮食喂养组相比，总胆固醇、甘油三酯、ldl脂蛋白胆固醇、和游离脂肪酸(ffa)在高脂肪饮食喂养组中的浓度显著增加，但在cmo1给予组(0.25％)中的浓度显著降低(图7)。
[0124]
(6)脂肪肝的变化
[0125]
在高脂肪饮食喂养组中，显著量的脂肪堆积在肝组织中，并且基于油红o染色分析，肝细胞中的脂质面积增加。然而，在cmo1给予组(0.25％)中，肝细胞中的增加的肝重量和脂肪面积显著减低。此外，肝组织中甘油三酯(tg)的量也显著减少(图8)。
[0126]
(7)有无克塞利科
tm
的严重副作用腹泻的验证
[0127]
在cmo1给予组中，没有观察到腹泻(其是克塞利科
tm
的严重副作用)。给予期间观察了各组的体毛。虽然克塞利科
tm
给予组具有油性和块状的体毛，就好像由于腹泻全身都被油覆盖了一样，但其它组的体毛都是正常的。在尸体解剖中，麻醉后当小鼠被侧卧和仰卧时，识别出相同的症状。此外，作为比较排泄物的结果，虽然克塞利科
tm
给予组显示出非常软的排泄物，但其它组显示出具有正常硬度的排泄物。验证了混合提取物克服了赛尼克
tm
的严重
副作用(如脂溶性维生素吸收抑制、胃肠障碍、和频繁腹泻等)(图9)。
[0128]
基于这些结果，确认了桂枝和牡丹根皮的混合提取物对肥胖症具有相当优异的预防或治疗效果，特别地通过克服常规药物(如克塞利科
tm
)的严重副作用而作为安全的治疗剂。
[0129]
在上述描述中，省略了对本发明的技术领域或其相关领域中具有普通知识的本领域技术人员显而易见的细节的描述，并且可以在不改变本发明的技术概念和必要特征的情况下进行各种改变和修改。因此，本领域技术人员将认识到，可以以不同于本申请中具体讨论的方式来实施本发明。