本发明属于疫苗制备
技术领域：
：，涉及一种带状疱疹病毒疫苗。
背景技术：
：：带状疱疹是由水痘-带状疱疹病毒引起的急性感染性皮肤病。儿童被感染后，发生水痘。由于病毒具有亲神经性，感染后可长期潜伏于脊髓神经后根神经节的神经元内。老年人当抵抗力低下或劳累、感染、感冒时，病毒可再次生长繁殖，并沿神经纤维移至皮肤，使受侵犯的神经和皮肤产生强烈的炎症。根据美国疾控中心的统计，在美国每3个人中就有将近1人会在他们的一生中发生带状疱疹。每年估计有100万例带状疱疹。特殊人群，患带状疱疹的风险更大。这包括那些保持免疫功能低下的人，如白血病和淋巴瘤等癌症，以及人类免疫缺陷病毒(hiv)，并接受免疫抑制药物，如器官移植后给予的类固醇和药物。大多数发展带状疱疹的人一生中只有一次发作。然而，有些人会反复发病。带状疱疹的发病率和严重程度随年龄增长而增高，50岁以后明显升高，这与老年人细胞免疫功能下降有关。据估计，85岁以上老年人约有一半发生过至少一次带状疱疹。现有的关于带状疱疹疾病负担的流行病学数据均来自高收入地区。在加拿大、以色列、日本、中国台湾和美国开展的研究显示，年龄调整的总人群带状疱疹发病率为3.4～5.0％，65岁以上人群则为8～11％。在欧洲27个国家开展的一项研究发现，带状疱疹发病率在不同国家自2.0～4.6％不等，但未显示出明显的地域差异。最近几年的数据显示，年轻的成人发病率也逐渐升高。美国长期以来用减毒的疫苗预防老年带状疱疹(zostervax)。该疫苗和预防水痘的疫苗是同一个毒株，即oka株。该疫苗用于60岁以上的人群，其保护性平均约50％左右。其保护性与年龄有关，年龄越大，保护性越低。zostavax对50-59岁、60岁以上人群患带状疱疹的保护率分别为69.8％、51％，且保护率随年龄升高而降低，在80岁以上人群中仅有18％，弱毒疫苗的另一个局限性是不能用于免疫系统有缺陷的人群，而该人群是最需要保护的。2017年亚单位疫苗(shringrix)开始在各国应用。shingrix是一种由水痘-带状疱疹病毒表面糖蛋白ge(cho细胞表达)，辅以as01b佐剂(主要成分为mpl、qs21的脂质体佐剂)制备的重组亚单位疫苗，肌肉注射，两针次免疫。shingrix对50岁以上、70岁以上人群患带状疱疹的保护率分别为97.2％、89.8％，受年龄影响不明显，在80岁以上人群中仍有89.1％保护率。但是亚单位疫苗的副反应比较强。由于多数人携带带状疱疹病毒，病毒潜伏在神经元内。带状疱疹疫苗的保护机制是通过诱导t细胞免疫反应，抑制病毒在神经元内激活时通过神经扩散到皮肤。尽管疫苗的主要保护机制是t细胞，抗体也有一定的保护作用。主要证据是用铝佐剂配制的灭活的病毒疫苗也有50％的保护效果，铝佐剂配制的疫苗一般不诱导t细胞反应。中国的带状疱疹发病率非常高，目前没有预防带状疱疹的疫苗。患者主要是用干扰素、中草药等药物治疗。人用疫苗常用的氢氧化铝和磷酸铝佐剂只能增强抗体反应，不能够诱导预防带状疱疹所必须的t细胞免疫，所以不适用于开发带状疱疹疫苗。开发安全有效的带状疱疹疫苗的障碍是缺少安全并有效激活t细胞免疫和中和抗体的新型佐剂。专利申请号为201611119488的发明专利公开一种水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白的制备方法，涉及水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e胞外区蛋白的重组载体、用该载体制备的转化体、利用转化体生产的蛋白，以及此蛋白在水痘疫苗、带状疱疹疫苗及含有此成分的多价疫苗、联合疫苗等相关疫苗研发和相应抗原、抗体检测等领域的应用。该发明利用基因工程技术，将vzv-ge胞外区核酸序列克隆并连接到原核表达载体pet-21b上，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌bl21(de3)中，得到转化体；将转化体诱导表达得到目的蛋白。该发明中的表达系统可以对vzv-ge胞外区抗原蛋白高效表达，所表达的vzv-ge胞外区蛋白抗原具有良好的免疫原性，可用于相应疫苗的研发和抗原抗体检测领域。但是该专利(201611119488)的缺点是所产生的蛋白没有糖基化，抗原的表位可能不真实。是否能够用于开发疫苗有待验证。同时，上述专利不涉及开发有效的疫苗所必需的佐剂技术。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种带状疱疹病毒疫苗，含有抗原的制备，佐剂的筛选。本发明的疫苗能够诱导很强的抗体反应和t细胞反应，能够达到最佳的保护效果，副作用小。本发明提供了如下的技术方案：一种带状疱疹病毒疫苗，由水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e或其片段与复合佐剂配制而成。优选的是，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e具体为带状疱疹病毒糖蛋白e。上述任一方案优选的是，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e具体为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e，氨基酸序列如seqidno.1。上述任一方案优选的是，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的片段包括带状疱疹病毒糖蛋白e囊膜外的片段ge-1和/或糖蛋白e的囊膜外的片段与囊膜内片段的融合蛋白ge-2。上述任一方案优选的是，由带状疱疹病毒糖蛋白e囊膜外的片段和囊膜内的氨基酸片段的融合蛋白ge-2制成。上述任一方案优选的是，所述带状疱疹病毒糖蛋白e囊膜外的片段的氨基酸序列为seqidno.2或与之相似度在95％以上的氨基酸序列。上述任一方案优选的是，所述带状疱疹病毒糖蛋白e囊膜外的片段和囊膜内的氨基酸片段的融合蛋白ge-2的氨基酸序列为seqidno.3或与之相似度在95％以上的氨基酸序列。上述任一方案优选的是，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的片段用真核表达系统表达，蛋白的糖基化与病毒表面的糖基化的程度和类型相同。上述任一方案优选的是，所述复合佐剂包括载体和诱导细胞免疫的分子佐剂。上述任一方案优选的是，所述复合佐剂含有一个纳米的载体和至少一个诱导细胞免疫的分子佐剂。上述任一方案优选的是，所述载体为纳米乳剂、脂质体、铝盐佐剂中的任意一种。载体为纳米载体。纳米载体制备方法为本领域公知常识。上述任一方案优选的是，所述铝盐佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙中的任意一种。上述任一方案优选的是，所述纳米乳剂为水包油的乳剂。上述任一方案优选的是，纳米乳剂包括mf59、stableemulsion、as04、af03或类似的产品中的任意一种。上述任一方案优选的是，脂质体是由胆固醇、卵磷脂和神经酰胺等制得的脂质体(空心)，具有单层或双分子层结构囊氏膜，直径25-1000nm。上述任一方案优选的是，所述诱导细胞免疫的分子佐剂为tlr3ligand、toll-7/8受体的激动剂或toll-likereceptor激动剂中的任意一种。上述任一方案优选的是，所述toll-likereceptor激动剂为tlr4、tlr5、tlr9中的任意一种。上述任一方案优选的是，所述复合佐剂为吸附了tlr3ligand的氢氧化铝、含tlr-7/8的激动剂的纳米乳剂、含tlr-7/8的激动剂的纳米乳剂中的任意一种。上述任一方案优选的是，氢氧化铝用量为0.1-1毫克，氢氧化铝吸附的tlr3ligand(tlr3l)的量为10-1000微克。上述任一方案优选的是，氢氧化铝吸附的tlr3ligand(tlr3l)的用量为100-500微克。上述任一方案优选的是，所述ge-1或ge-2的用量为10-200微克。上述任一方案优选的是，所述ge-1或ge-2的用量为10-100微克。上述任一方案优选的是，tlr7/8激动剂的用量为0.1-30微克。上述任一方案优选的是，tlr7/8激动剂的用量为1-10微克。一种带状疱疹病毒疫苗的制备方法，由水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e或其片段与复合佐剂配制而成，具体包括以下步骤：(1)制备复合佐剂；(2)将糖蛋白e或其片段与复合佐剂混合，混匀配制成疫苗。优选的是，复合佐剂采用tlr3ligand吸附到氢氧化铝上或者采用toll-7/8受体的激动剂与纳米乳剂或脂质体配伍制备而成。上述任一方案优选的是，糖蛋白e的片段包括带状疱疹病毒糖蛋白e囊膜外的片段ge-1和/或糖蛋白e的囊膜外的片段与囊膜内片段的融合蛋白ge-2。上述任一方案优选的是，糖蛋白e的氨基酸序列如seqidno.1。上述任一方案优选的是，毒糖蛋白e囊膜外的片段的氨基酸序列为seqidno.2或与之相似度在95％以上的氨基酸序列。上述任一方案优选的是，糖蛋白e囊膜外的片段和囊膜内的氨基酸片段的融合蛋白ge-2的氨基酸序列为seqidno.3或与之相似度在95％以上的氨基酸序列。上述任一方案优选的是，糖蛋白e为带状疱疹病毒糖蛋白e。上述任一方案优选的是，糖蛋白e为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e。优选的是，复合佐剂含有一个纳米的载体和至少一个诱导细胞免疫的分子佐剂。上述任一方案优选的是，水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的片段用真核表达系统表达，蛋白的糖基化与病毒表面的糖基化的程度和类型相同。糖蛋白e用真核细胞表达(chinesehamsterovarycell,orchocell)；依据现有重链序列设计引物，进行pcr扩增，以hindiii/ecori位点插入到pgenht1.0载体上游的多克隆位点(mcs)。载体上设计有1个mcs和cmv启动子。同时，该载体上含有谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)，启动子为sv40earlypromote。用质粒载体转染cho-k1sp细胞悬浮细胞。依据转染48h表达评估结果，确认开始构建表达目的基因的稳定细胞系。将转染后的细胞接种至24孔板，使用cellpool筛选培养基进行加压筛选。cellpool筛选完成后，收集所有cellpool的上清进行elsia检测表达水平。选择表达量高的cellpool进行单克隆筛选，单克隆筛选采用有限稀释法，并进行单克隆成像拍摄，确认单克隆源性，最终选择具有单克隆源性的10个克隆进行70代的传代稳定性试验。选高表达和稳定的一株(clone6)建库。cho高表达细胞克隆用无血清培养基培养从6-孔培养板，25毫升，和250毫升的摇瓶，逐渐扩大到2升的反应器。收集上清，并将其用0.22微米的膜过滤除去细胞碎片。然后通过q-sepharose柱子进行阴离子层析。收取含ge蛋白的洗脱液，经过含丁基的疏水层析和超滤换液获得纯化的糖蛋白。两个的蛋白经过分子筛纯化约95％纯度的蛋白质。由于蛋白是糖基化的，在sds-page胶上呈弥散性，分子量在60-70kd之间。诱导细胞免疫的分子佐剂为tlr3ligand、toll-7/8受体的激动剂或toll-likereceptor(tlr4，tlr5，tlr9等)激动剂为购买的成品。上述任一方案优选的是，所述复合佐剂包括载体和诱导细胞免疫的分子佐剂。上述任一方案优选的是，所述复合佐剂含有一个纳米的载体和至少一个诱导细胞免疫的分子佐剂。上述任一方案优选的是，所述载体为纳米乳剂、脂质体、铝盐佐剂中的任意一种。载体为纳米载体。纳米载体制备方法为本领域公知常识。上述任一方案优选的是，所述铝盐佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙中的任意一种。上述任一方案优选的是，所述纳米乳剂为水包油的乳剂。上述任一方案优选的是，纳米乳剂包括mf59、stableemulsion、as04、af03或类似的产品中的任意一种。上述任一方案优选的是，脂质体是由胆固醇、卵磷脂和神经酰胺等制得的脂质体(空心)，具有单层或双分子层结构囊氏膜，直径25-1000nm。上述任一方案优选的是，所述诱导细胞免疫的分子佐剂为tlr3ligand、toll-7/8受体的激动剂或toll-likereceptor激动剂中的任意一种。上述任一方案优选的是，所述toll-likereceptor激动剂为tlr4、tlr5、tlr9中的任意一种。上述任一方案优选的是，所述复合佐剂为吸附了tlr3ligand的氢氧化铝、含tlr-7/8的激动剂的纳米乳剂、含tlr-7/8的激动剂的纳米乳剂中的任意一种。上述任一方案优选的是，氢氧化铝用量为0.1-1毫克，氢氧化铝吸附的tlr3ligand(tlr3l)的量为10-1000微克。上述任一方案优选的是，氢氧化铝吸附的tlr3ligand(tlr3l)的用量为10-1000微克。上述任一方案优选的是，氢氧化铝吸附的tlr3ligand(tlr3l)的用量为100-500微克。上述任一方案优选的是，所述ge-1或ge-2的用量为10-200微克。上述任一方案优选的是，所述ge-1或ge-2的用量为10-100微克。上述任一方案优选的是，tlr7/8激动剂的用量为0.1-30微克。上述任一方案优选的是，tlr7/8激动剂的用量为1-10微克。一种包含由seqidno.1或seqidno.2或seqidno.3所示的氨基酸序列组成的抗原以及佐剂的组合物或疫苗在制备用于预防或改善带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛的药物中的应用。优选的是，适用于20岁以上的成人，尤其是50岁以上的人群。本发明中：病毒表面的糖蛋白e(ge)是带状疱疹病毒的一个重要的毒性因子，也是一个重要的疫苗成份。在病毒的扩散过程中，ge结合到宿主细胞的受体，使病毒侵入并迅速地扩散到邻近的细胞。ge蛋白是一个跨膜蛋白。囊膜外的多肽是目前国外上市疫苗(shringrix)的抗原成分。这个疫苗能够阻断病毒的从神经元扩散到皮肤等，但是并不能消除体内不复制的病毒。我们通过测试接种弱毒疫苗人的t细胞反应发现，确认了囊膜外的这段多肽上面有几个重要的t细胞位点。出乎我们意料的是，我们发现囊膜内的多肽片段也含有t细胞反映的重要位点。我们表达了囊膜外的多肽和与其融合的囊膜内的多肽，并证明了两个多肽在动物体内能够诱导高水平的t细胞反应。不同的国家和地区的人，mhc的差别会更大。含有囊膜内的多肽ge重组蛋白有可能会有更广泛的保护性。佐剂是开发有效的疫苗重要成分。在没有佐剂的情况下，亚单位抗原通常只诱导抗体反应和th2反应。常用的铝佐剂往往只能提高th2类反应，不能够诱导th1类反应。所以，成功的开发新型的亚单位老年带疱疫苗需要使用新型的佐剂来增强抗体反应和细胞免疫反应。上市的shingrix亚单位疫苗采用了as01b佐剂。主要成份为mpl、qs21的脂质体佐剂。在动物和人体实验中，能够诱导非常强的抗体和t细胞反应。其中的mpl成份被认为是诱导细胞免疫的核心成份。文献中有很多免疫佐剂成份能够诱导自己体内的细胞免疫反应。toll-likereceptor3ligand(tlr3l)受体激活物的化学成分是双链的核糖核酸，具体的tlr3激活物包括tlr3ligand，聚肌胞(与卡那霉素形成的聚合物)，tlr3ligandlc(与聚赖氨酸的聚合物)等。tlr3受体激活物能够结合到细胞内的受体tlr3，刺激抗原呈递细胞和抗原呈递功能，诱导t细胞反应。toll-likereceptor4(tlr4)受体激活物是去毒内毒素(monophosphoryl-lipida，简称mpl或者3dmpl是从沙门氏杆菌的细胞膜中提取并通过化学修饰去其毒性但不破坏其佐剂的作用。除了上述从微生物中提出的mpl，还有人工合成的分子，包括吡喃葡萄糖基脂a(glucopyranosyllipida),人工合成的脂蛋白a(synthetic-lipida).这些分子能够结合到抗原呈递细胞表面的tlr4受体，激活该细胞刺激诱导t细胞的产生。qs21是从南美洲的皂树中提取的皂苷物质，具有表面活性剂的活性，能在人体中诱导t细胞的反应。其具体工作机制并不明确。类似的分子包括从人参或者期茎叶中提取的皂苷分子。toll-likereceptor7ligand(tlr7l)受体激活物激活物包括雷西莫德(resiqimod),咪喹莫特(imiqimod),3m-052等。这些分子，能够结合到抗原呈递细胞表面的tlr7，激活其抗原呈递功能，诱导t细胞的反应。toll-likereceptor9ligand(tlr9l)是短链的cpg脱氧核糖核酸。其顺序有很多种与细胞内的tlr9受体结合以后，能够激活抗原呈递细胞，诱导t细胞的反应。在我们的实验中，我们发现tlr3ligand激活物,tlr7受体激活物，甚至qs-21单独使用也有很强免疫刺激效果，这些佐剂诱导的t细胞反应比mpl的效果更强。我们进一步证明，这些特异性的免疫佐剂与一个纳米的载体配伍的复合佐剂的免疫效果比免疫分子佐剂自身或者纳米载体佐剂单独使用的效果要好。纳米载体包括纳米铝盐，脂质体，水包油的纳米乳剂等。纳米载体能够吸附或结合分子佐剂，一方面可以把其传送到淋巴系统，甚至是细胞内，另一方面是避免分子佐剂扩散到血液中去，引起细胞因子释放所导致的副反应。铝盐佐剂包括氢氧化铝，磷酸铝以及磷酸钙，在疫苗中的应用非常广泛。脂质体是由磷脂，胆固醇等脂类的生物材料配制的疫苗和药物传递系统。纳米乳剂是由免疫刺激功能的各种油(例如角鲨烯，角鲨烷等)和表面活性剂配制而成。常用的纳米乳剂包括mf59,stableemulsion,as04,af03等。有益效果本发明的带状疱疹病毒疫苗能够诱导很强的抗体反应和t细胞反应，能够达到最佳的保护效果。传统的用铝盐佐剂配制的疫苗只能诱导抗体反应，不能诱导细胞免疫，对老年带状疱疹的保护效果非常有限。多数成人都携带水痘-带状疱疹病毒，在提抗力降低时，病毒被激活并扩散到皮肤的神经末端引起发炎、带疱和神经疼痛。由于病毒潜伏在细胞内，传统的用铝盐佐剂配制的疫苗所诱导的抗体没法渗透到细胞内，也就无法抑制,病毒的激活和扩散。本发明的疫苗能够诱导很强的细胞免疫反应。t细胞所产生的细胞因子(gamma-干扰素，il-2等)能够渗透进入病毒感染的细胞，有效的抑制病毒的激活与扩散。能够完全的预防带状疱疹的方式以及发病前后经常出现的皮肤疼痛。该疫苗所诱导中和抗体能够杀死暴露在细胞外或表面的病毒，防止病毒进一步感染其它正常的细胞。与传统的减毒疫苗或传统铝盐佐剂配制的疫苗相比，本发明的疫苗产品通过使用真核细胞表达的糖基化的蛋白e和新型的佐剂，能够大大的提高疫苗的有效性；能够高效预防带状疱疹的发生，有效率会远远高于传统的疫苗。能够预防带状疱疹发生时所引起的神经痛，另外疫苗的副作用较小。附图说明图1是纯化的ge-1和ge-2蛋白的sds-page图像；图2是重组ge蛋白体外刺激t细胞产生的γ-干扰素；图3是重组ge蛋白与不同佐剂配伍诱导的抗体滴度；图4是重组ge蛋白与不同佐剂配伍诱导的产生γ干扰素的t细胞；图5是重组ge蛋白与tlr3l和氢氧化铝的佐剂复合佐剂诱导的抗体和细胞反应；图6是重组ge蛋白与tlr3l和氢氧化铝的佐剂复合佐剂诱导的γ干扰素的t细胞反应；图7是不同剂量的重组ge蛋白与tlr3l和氢氧化铝的佐剂复合佐剂诱导的抗体反应；图8是重组ge蛋白与tlr7l和纳米乳剂复合佐剂诱导的抗体反应；图9是重组ge蛋白与tlr7l和纳米乳剂复合佐剂诱导的细胞反应；图10是重组ge蛋白与tlr3l和氢氧化铝的佐剂复合佐剂诱导的抗体反应。具体实施方式为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细地阐述。一种带状疱疹病毒疫苗，由水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e或其片段与复合佐剂配制而成。其中，复合佐剂含有一个纳米的载体和至少一个诱导细胞免疫的分子佐剂。(1)糖蛋白e，为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e，氨基酸序列如seqidno.1，其片段可以为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e的株囊膜外的多肽片段氨基酸序列如seqidno.2，其片段也可以为dumas株糖蛋白e的囊膜外的多肽与囊膜内片段的融合蛋白，氨基酸顺序seqidno.3。(2)糖蛋白e用真核细胞表达，并通过阴离子层析和疏水层析纯化。糖蛋白e用真核细胞表达(chinesehamsterovarycell,orchocell)；依据现有重链序列设计引物，进行pcr扩增，以hindiii/ecori位点插入到pgenht1.0载体上游的多克隆位点(mcs)。载体上设计有1个mcs和cmv启动子。同时，该载体上含有谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)，启动子为sv40earlypromote。用质粒载体转染cho-k1sp细胞悬浮细胞。依据转染48h表达评估结果，确认开始构建表达目的基因的稳定细胞系。将转染后的细胞接种至24孔板，使用cellpool筛选培养基进行加压筛选。cellpool筛选完成后，收集所有cellpool的上清进行elsia检测表达水平。选择表达量高的cellpool进行单克隆筛选，单克隆筛选采用有限稀释法，并进行单克隆成像拍摄，确认单克隆源性，最终选择具有单克隆源性的10个克隆进行70代的传代稳定性试验。选高表达和稳定的一株(clone6)建库。cho高表达细胞克隆用无血清培养基培养从6-孔培养板，25毫升，和250毫升的摇瓶，逐渐扩大到2升的反应器。收集上清，并将其用0.22微米的膜过滤除去细胞碎片。然后通过q-sepharose柱子进行阴离子层析。收取含ge蛋白的洗脱液，经过含丁基的疏水层析和超滤换液获得纯化的糖蛋白。两个的蛋白经过分子筛纯化约95％纯度的蛋白质。由于蛋白是糖基化的，在sds-page胶上呈弥散性，分子量在60-70kd之间。(3)载体可以为纳米乳剂、脂质体或铝盐佐剂。(4)诱导细胞免疫的分子佐剂为tlr3ligand、toll-7/8受体的激动剂或其它toll-likereceptor(tlr4，tlr5，tlr9等)激动剂。实施例子1：一种带状疱疹病毒疫苗，用水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的囊膜外的片段与吸附了tlr3ligand的氢氧化铝的复合佐剂配制的疫苗。(1)糖蛋白e的囊膜外的片段为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e的株囊膜外的多肽片段g-e1,氨基酸序列如seqidno.2。(2)ge-1用cho细胞表达并通过阴离子层析和疏水层析纯化(见实施9)。(3)ge-1的用量为10-200微克，最优为50微克。(4)铝的成份为氢氧化铝，其生产方法见参考文献1(参考文献：李德娟何巍张睿付琳娜赵丽剑王宇金立杰。氢氧化铝佐剂配制工艺的优化。中国生物制品学杂志2010年10月第23卷第10期，第1135-1137页。).其用量为0.1-1毫克，0.2-0.8毫克，最优为0.5毫克。(5)氢氧化铝吸附的tlr3ligand(tlr3l)由成都市海通药业有限公司提供。tlr3ligand的剂量为100-500微克，最优为300微克。具体疫苗的配制方法如下：配制疫苗时在无菌、a级净化的环境下操作，温度控制在20-24摄氏度。下列配制方法为配制1升疫苗的方法，可以等比例放大进行大规模生产。(1)将氢氧化铝佐剂用生理盐水稀释成毫升1毫克的铝浓度。将500毫升倒入一个两升的配液瓶中，并启动磁力搅拌。搅拌速度问每分钟150转。(2)将600毫克的tlr3ligand稀释至100毫升的生理盐水，然后以每分钟10毫升的速度加入到搅拌的铝佐剂容器。完成后继续搅拌1小时。(3)将100毫克的ge蛋白(ge-1或ge-2)用生理盐水稀释至100毫升，然后以每分钟10毫升的速度加入到含有铝佐剂-tlr3ligand的容器。完成后继续搅拌1小时。(4)加入300毫升的生理盐水，继续搅拌1个小时。(5)分装到1000-1300个西林瓶，每瓶0.7毫升(每剂0.5毫升)。(6)配制好的疫苗在2-8℃保存。实施例子2：一种带状疱疹病毒疫苗：用水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的囊膜外的片段(ge-1)与含tlr-7/8的激动剂的纳米乳剂的复合佐剂配制的疫苗。(1)糖蛋白e的囊膜外的片段为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e的株囊膜外的多肽片段g-e1,氨基酸序列如seqidno.2。(2)ge-1用cho细胞表达，并通过阴离子层析和疏水层析纯化(见实施9)。(3)ge-1的用量为10-200微克，最优为50微克。(4)纳米乳剂的为水包油的乳剂。其制备方法见参考文献2(garyott,ramachandranradhakrishnan,jia-hwafang,andmaninderhoratheadjuvantmf59:a10-yearperspective。methodsinmolecularmedicine,vol.42，page211-228:vaccineadjuvants:preparationmethodsandresearchprotocols。editedby:d.t.o’haganhumanapress,inc.,totowa,nj)，其成分为4-5％角鲨烯，0.5-1％tween80,和0.5-1％span85.纳米乳剂的用量为0.1-1毫升，0.2-0.5毫升，做好为0.25毫升。(5)tlr7激动剂的用量为0.1-30微克，tlr7激动剂由美国的3m公司提供。其用量为1-10微克，最优为3微克。具体疫苗的配制方法如下：配制在无菌，a级净化的环境下操作，温度控制在20-24摄氏度。下列配制方法为配制1升疫苗的方法。可以等比例放大进行大规模生产。(1)将45克的角鲨烯，4.5克的tween80,4.5克的收盘85，6毫克的tlr7ligand混合后，在于450毫升的10mm的柠檬酸盐缓冲液(ph6.5)混匀，用1000bar的压力对的微射流高压匀质的5遍，用0.22微米的膜过滤除菌。(2)将上述乳剂倒入一个无菌的2-升容器，用磁棒开始搅拌，速度为每分钟150转。(3)将100毫克的ge蛋白(ge-1或ge-2)用生理盐水稀释至500毫升，然后迅速地倒入到含有纳米乳剂的容器。继续搅拌1小时。(4)分装到1000-1300个西林瓶，每瓶0.7毫升(每剂0.5毫升)。(5)配制好的疫苗在2-8℃保存。实施例子3：一种带状疱疹病毒疫苗：用水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的囊膜外的片段与囊膜内的氨基酸片段的融合蛋白和吸附了tlr3ligand的氢氧化铝的复合佐剂配制的疫苗。(1)融合蛋白为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e的囊膜外的多肽与囊膜内片段的融合蛋白ge-2，氨基酸顺序如seqidno.3。(2)ge-2用cho细胞表达,并通过阴离子层析和疏水层析纯化(见实施9)。(3)ge-2的用量为10-200微克，最优为50微克。(4)铝的成份为氢氧化铝，用量为0.1-1毫克。(5)氢氧化铝吸附的tlr3ligand的量为10-1000微克，最好为100-300微克。具体疫苗的配制方法如下：配制疫苗时在无菌、a级净化的环境下操作，温度控制在20-24摄氏度。下列配制方法为配制1升疫苗的方法。可以等比例放大进行大规模生产。(1)将氢氧化铝佐剂用生理盐水稀释成毫升1毫克的铝浓度。将500毫升倒入一个两升的配液瓶中，并启动磁力搅拌。搅拌速度问每分钟150转。(2)将600毫克的tlr3ligand稀释至100毫升的生理盐水，然后以每分钟10毫升的速度加入到搅拌的铝佐剂容器。完成后继续搅拌1小时。(3)将100毫克的ge蛋白(ge-1或ge-2)用生理盐水稀释至100毫升，然后以每分钟10毫升的速度加入到含有铝佐剂-tlr3ligand的容器。完成后继续搅拌1小时。(4)加入300毫升的生理盐水，继续搅拌1个小时。(5)分装到1000-1300个西林瓶，每瓶0.7毫升(每剂0.5毫升)。(6)配制好的疫苗在2-8℃保存。实施例子4：一种带状疱疹病毒疫苗：用水痘-带状疱疹病毒糖蛋白e的囊膜外的片段与与囊膜内的氨基酸片段的融合蛋白和含tlr-7/8的激动剂的纳米乳剂的复合佐剂配制的疫苗。(1)融合蛋白为带状疱疹病毒dumas株糖蛋白e的囊膜外的多肽与囊膜内片段的融合蛋白ge-2，氨基酸顺序如seqidno.3。(2)ge-2用cho细胞表达。(3)ge-2的用量为10-200微克，最优为10-100微克。(4)纳米乳剂的为水包油的乳剂。(5)tlr7激动剂的用量为0.1-30微克，最优为1-10微克。具体疫苗的配制方法如下：配制疫苗时在无菌、a级净化的环境下操作，温度控制在20-24摄氏度。下列配制方法为配制1升疫苗的方法。可以等比例放大进行大规模生产。(1)将45克的角鲨烯，4.5克的tween80,4.5克的收盘85，6毫克的tlr7ligand混合后，在于450毫升的10mm的柠檬酸盐缓冲液(ph6.5)混匀，用1000bar的压力对的微射流高压匀质的5遍，用0.22微米的膜过滤除菌。(2)将上述乳剂倒入一个无菌的2-升容器，用磁棒开始搅拌，速度为每分钟150转。(3)将100毫克的ge蛋白(ge-1或ge-2)用生理盐水稀释至500毫升，然后迅速地倒入到含有纳米乳剂的容器。继续搅拌1小时。(4)分装到1000-1300个西林瓶，每瓶0.7毫升(每剂0.5毫升)。(5)配制好的疫苗在2-8℃保存。实施例子5：带状疱疹病毒抗原的筛选水痘－带状疱疹病毒是一个非常复杂的的病毒，共表达70多个不同的蛋白质，其中包括在跨囊膜的9种糖蛋白。这些糖蛋白和内部的蛋白都有可能作为抗原使用。通过对24个成年人接种弱毒带状疱症疫苗前后对71个不同的蛋白质的t细胞反应的比较，我们发现基因68蛋白是主要的t细胞反应的目标蛋白。具体实验方法和结果如下：首先把带状疱疹病毒oka株的71基因分别pcr放大，克隆到含t7启动子的pdonr207orpdonr221(invitrogen,grandisland,newyork)的质粒中，然后转克隆到含t7启动子的pdest载体中，用大肠杆菌表达试剂盒(ivttexpressway,invitrogen)分别表达了带his标签的蛋白质。通过对his标签抗体的点印记实验确认每个蛋白都有表达。用上述表达的每一个蛋白对24个患者疫苗接种前和接种后14天的分离的血液白细胞培养出的多克隆cd4细胞系进行体外培养和刺激24小时。然后收集培养液的上清，测定γ-干扰素的浓度。结果发现，所有的24个接种人对基因68表达的蛋白都有t细胞反应，另外部分人对基因9,18,40,67,59,12和62也有t细胞反应。该实验证明，基因68表达的蛋白含有重要的t细胞反应的位点，可以作为开发疫苗应用。实施例6：带状疱症病毒基因68表达的蛋白质的抗原位点鉴别对基因68合成了覆盖全氨基酸序列的部分重叠的13-肽或20-肽片段。用这些片段，我们对24个疫苗接种前和接种后14天的分离的血液白细胞培养出的多克隆cd4细胞系进行体外培养和刺激24小时，然后测定上清液中γ-干扰素的浓度。从而确定了得到了每个蛋白质的t细胞反应的位点。基因68表达的蛋白质为ge蛋白。结果证明主要的cd4t细胞的位点在氨基酸序列190-209和280-299。75％的疫苗接种者t细胞对这两个位点反应阳性。另外至少三分之一接种者t细胞反应的位点包括氨基酸序列46-65，154-173，199-219，334-353和415-434。另外，三分之一的接种者有针对病毒囊膜内的序列(577-596，588-607)有很强的t细胞反应。囊膜内的序列可能对开发疫苗有重要的价值。通过上述工作，我们找到了基因68所表达的蛋白质的重要的t细胞位点，如表1所示，确认有疫苗开发的潜力。表1带状疱症病毒含重要的t细胞反应的位点蛋白质。实施例7：分离和制备ge蛋白主要t细胞位点的t细胞克隆ge蛋白的两个主要t细胞位点是氨基酸顺序190-210(riygvrytetwsflpsltct)和氨基酸顺序280-299(eiepgvlkvlrtekqylgvy)。我们从接种的两个人的血液白细胞中克隆到了针对这两个位点的t细胞，并将其扩大培养。首先分别人工合成上述两个多肽的四连体并用allophycocyanin标记。用标记的四连体与分离到的接种者的血液白细胞进行反应。用流式细胞仪分离出allophycocyanin凝光色素标记的cd4阳性的细胞。把分离到的细胞放入96-孔细胞培养板中(每孔1个细胞)与经过γ射线照射的全血白细胞(每孔20万个细胞)以及植物血凝素(1.6微克/孔空)进行培养。并在第二天加入人的il-2(每毫升32u)。连续培养14天。每三天加入新鲜的培养基。培养结束，把生长的t细胞用上述20氨基酸的多肽和同一病人的全血白细胞共同培养，通过用细胞内细胞因子(γ-干扰素)染色确认阳性克隆。然后对阳性的t细胞克隆进行扩大培养。即用20万个阳性cd4t细胞为种子，加入500万个放射处理的lclb细胞株，2500万个放射处理的来自同一接种者的血液白细胞，和30ng/mlofokt3单克隆抗体在25ml的培养液2-3周，扩增阳性克隆的细胞数量。把得到的cd4阳性的针对上述ge蛋白位点的细胞再分装，在液氮中保存。这些保存的t细胞能够在体外受到ge蛋白或特异性的多肽刺激时产生γ-干扰素和il-2。上述工作共产生了5个t细胞克隆，如表2所示。五个克隆对应两个不同的hla表2针对ge蛋白重要的t细胞反应位点的t细胞克隆实施例8：表达的ge蛋白的稳定细胞株cho构建ge蛋白是一个糖基化的蛋白质，需要真核细胞表达才能得到结构更真实的蛋白质。因此我们构建了两个表达不同ge蛋白序列的chinesehamsterovarian(cho)细胞株。第一个细胞株表达不含信号肽的ge囊膜外的序列(氨基酸顺序31-538)。第二个cho细胞株表达ge蛋白序列囊膜外的序列(氨基酸顺序31-538)与囊膜内的序列(氨基酸顺序560-623)的融合蛋白。第二个cho细胞株表达的蛋白不含跨膜顺序(氨基酸顺序539-559)因为跨膜顺序的产物可溶性差，容易沉淀。细胞株的构建按照除常规的方法进行。依据现有重链序列设计引物，进行pcr扩增，以hindiii/ecori位点插入到pgenht1.0载体上游的多克隆位点(mcs)。载体上设计有1个mcs，和cmv启动子。同时，该载体上含有谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)，启动子为sv40earlypromote。用质粒载体转染cho-k1sp细胞悬浮细胞。依据转染48h表达评估结果，确认开始构建表达目的基因的稳定细胞系。将转染后的细胞接种至24孔板，使用cellpool筛选培养基进行加压筛选。cellpool筛选完成后，收集所有cellpool的上清进行elsia检测表达水平。选择表达量高的cellpool进行单克隆筛选，单克隆筛选采用有限稀释法，并进行单克隆成像拍摄，确认单克隆源性，最终选择具有单克隆源性的10个克隆进行70代的传代稳定性试验。选高表达和稳定的一株(clone6)建库。实施例子9：稳定cho细胞株的培养和纯化cho高表达细胞克隆用无血清培养基培养从6-孔培养板，25毫升，和250毫升的摇瓶，逐渐扩大到2升的反应器。收集上清，并将其用0.22微米的膜过滤除去细胞碎片。然后通过q-sepharose柱子进行阴离子层析。收取含ge蛋白的洗脱液，经过含丁基的疏水层析和超滤换液获得纯化的糖蛋白。两个的蛋白经过分子筛纯化约95％纯度的蛋白质。由于蛋白是糖基化的，在sds-page胶上呈弥散性，分子量在60-70kd之间。ge-1蛋白的分子量略小于ge-2蛋白，如图1所示。纯化的氨基酸顺序31-538的蛋白被命名为ge-1。纯化的氨基酸顺序31-538和氨基酸顺序560-623的融合蛋白被命名为ge-2。每升培养上清纯化的ge-1的产量为2.6克，ge-2的产量为1.8克。实施例10:ge-1和ge-2重组蛋白对t细胞克隆的体外激活反应用上述两个重组的ge蛋白，我们分别对5个ge不同的克隆的t细胞(见试验4)进行了体外刺激试验，证明重组蛋白的生物活性。将5万个克隆的t细胞在与同一hla型别的不同人的5万个γ-射线处理的血液白细胞进行培养18个小时。上清中γ-干扰素的量用elisa方法测量。如果用重组蛋白ge-1或ge-2(每毫升50纳克)刺激，每个t细胞株克隆都产生了大量的γ-干扰素(如图2所示)。没有重组蛋白的培养基对照没有产生任何γ-干扰素。说明表达的蛋白质具有生物活性，能够作为疫苗开发用。两个重组蛋白之间没用明显的差别。实施例11:ge重组蛋白的免疫原性和佐剂的筛选我们分别用重组的ge-1和ge-2蛋白与不同佐剂配伍免疫小鼠，测定其产生的抗体滴度和产生γ-干扰素的t细胞水平。该试验评估的佐剂包括tlr3的激活剂(tlr3ligand)，tlr7的激活剂(tlr7ligand),氢氧化铝，和纳米乳剂。每只小鼠免疫的疫苗含20微克的ge-1或ge-2蛋白，20微克的tlr3ligand，1微克的tlr7ligand，100微克的氢氧化铝(平均粒径50-160纳米)，或者0.2毫升的纳米乳剂(平均粒径100-160纳米)。用生理盐水(没加任何佐剂)作为对照。分别在第1天和第28天皮下免疫小鼠，第42天抽血检查抗体水平。同时收集脾脏检查t细胞反应。抗体的检测采取了elisa方法。用ge-1或ge-2蛋白包被酶标版，然后加入不同稀释度的血清，最后再用第二抗体检测和底物反应。大于没加血清的对照孔三倍的血清稀释度即使该血清的滴度。每组五只动物的平均滴度见图三。结果证明，tlr3ligand,3m-052,氢氧化铝，和纳米乳剂分别诱导了高滴度的血清抗体。ge-1和ge-2诱导的抗体滴度无明显差异。重组ge蛋白诱导的t细胞反应通过体外的脾脏细胞刺激后的细胞内γ-干扰素的细胞占比来确定。脾脏收集以后，制备单个白细胞。在96-孔的细胞培养板中，每孔加入10万个白细胞和1微克的重组蛋白ge-1或ge-2.对照孔加入培养基。在37度的细胞培养箱中培养1小时后，加入golgiplug(bdpharmingen)防止细胞内的细胞因子流出细胞，继续培养5个小时。收集的细胞用不同的荧光素标记的抗cd3和cd4分子的抗体染色。然后用细胞膜穿透液处理，在用荧光素标记的抗γ-干扰素的单抗进行染色。最后，把细胞用1％的甲醛固定后，用流式细胞仪检测γ-干扰素阳性的t细胞，并计算出占cd4阳性细胞总数的百分比。结果如图4所示。ge-1和ge-2用生理盐水免疫的小鼠，诱导出γ-干扰素阳性的t细胞比较少，低于0.2％，同样，氢氧化铝佐和纳米乳剂配制的疫苗诱导的γ-干扰素阳性的t细胞也比较少。用tlr3landtrl7l配伍的疫苗都分别诱导产生了大量的γ-干扰素阳性的t细胞，占比在1.5-2.5％之间。说明这两种佐剂是开发带状疱疹疫苗的有效的佐剂成份。本实验测试如果把tlr3l和氢氧化铝佐剂是否有协同作用以及吸附的tlr3l剂量对疫苗的免疫效果的影响。我们把不同剂量的tlr3l分别吸附到一定量的铝氢氧化铝的表面配成复合佐剂，然后再把ge-1或者ge-2吸附。这样配制的疫苗，每0.2毫升含有200微克的铝，10微克的抗原和1，10，100，或300微克的tlr3l.每组5只小鼠，分别在地1和28天每只小鼠皮下注射0.2毫升。用第42天用elisa检测血清中的ge-1和ge-2特异性抗体的滴度。如图5所示，结果证明tlr3l和氢氧化铝的佐剂有协同作用。复合佐剂的效果比每个佐剂单独使用的免疫效果要提高5倍。吸附到氢氧化铝表面上的tlr3l最佳剂量为10-300微克。复合佐剂对ge-1和ge-2的免疫增强作用相同。在第45天对收获的小鼠的脾脏进行了产生γ-干扰素的细胞占比分析。方法同实施例7。结果如图6所示，用10微克的tlr3l自身或吸附到200微克的氢氧化铝表面配伍的疫苗分别诱导了高水平的γ-干扰素阳性细胞。用氢氧化铝配伍的疫苗几乎没有诱导γ-干扰素阳性细胞。本试验说明tlr3l-氢氧化铝符合佐剂可以提高疫苗的效力实施例12:重组蛋白的剂量对与tlr3l-氢氧化铝复合佐剂配制的疫苗的免疫原性的影响用10微克的tlr3l和200微克的氢氧化铝配制的复合佐剂与不同剂量的ge-1或者ge-2蛋白吸附，然后按实施例7的方法免疫小鼠并测定血清抗体效价。如图7所示，结果表明10-200微克的e-1或者ge-2重组蛋白能够诱导很强的抗体反应实施例13：重组ge蛋白与tlr7l和纳米乳剂复合佐剂诱导的抗体和细胞反应本实验测试tlr7l和纳米乳剂是否有协同作用以及吸附的tlr7l剂量对疫苗的免疫效果的影响。我们把不同剂量的tlr7l与纳米乳剂配成复合佐剂，然后再与ge-1或者ge-2混合。这样配制的疫苗，每0.2毫升纳米乳剂含有10微克的抗原和0.01，0.5，2，或10微克的tlr7l.然后按实施例7的方法免疫小鼠，并检测抗体和细胞免疫反应。如图8所示，结果证明tlr7l和纳米乳剂有协同作用。tlr7l最佳剂量为0.5-10微克。复合佐剂对ge-1和ge-2的免疫增强作用相同。在第45天对收获的部分小鼠的脾脏进行了产生γ-干扰素的细胞占比分析。方法同实施例7。结果如图9所示。2微克的tlr7l自身或与纳米乳剂配伍的疫苗分别诱导了高水平的γ-干扰素阳性细胞。纳米乳剂配伍的疫苗几乎没有诱导γ-干扰素阳性细胞。实施例14:不同剂量的重组ge蛋白对与tlr7l-纳米乳剂复合佐剂配制的疫苗的免疫原性的影响我们用2微克的tlr7l和200微升的纳米乳剂配制的复合佐剂与不同剂量的ge-1或者ge-2蛋白吸附，然后按实施例7的方法免疫小鼠并测定血清抗体效价。如图10所示，结果表明10-200微克的e-1或者ge-2重组蛋白能够诱导很强的抗体反应。实施例15：ge重组蛋白疫苗诱导的的小鼠抗体能够中和vzv病毒我们分别用生理盐水，lr3l-氢氧化铝复合佐剂，或者lr7l-纳米乳剂复合佐剂与ge-1和ge-2配制疫苗并免疫小鼠.第二次免疫后14天的血清中的中和抗体效价用补体依赖性的中和试验测定。首先用首先用pbs-明胶-蔗糖(pgs)溶液稀释水痘病毒的oka株到每毫升3000个菌斑形成单位(pfu)，加入1：8稀释的豚鼠补体血清，并混合混合，然后与稀释的待检测的小鼠免疫血清等体积混合。在37度抚育1小时后铺平到人的二倍体细胞上。每孔含300个pfu。将感染的细胞在37的培养8天.中和抗体滴度是能够降低pfu50％的最高血清稀释倍数。结果表明，两个复合佐剂配制的疫苗分别有诱导了高滴度的中和抗体如表3所示。表3中和抗体滴度以上实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12