一种防治糖尿病的组合物制备方法与流程

本发明属于药物制备技术领域，涉及一种药品具有保健功能性食品及其制备方法，特别是一种防治糖尿病的组合物制备方法，制备的组合物用于对自身免疫性糖尿病的预防并具有明显的治疗功效。

背景技术：

目前，在天然植物中，有许多具有药食同源功能。红小豆，又名赤小豆，有行血补血、健脾去湿、利水消肿之效。红小豆的营养成分包括：豆蛋白、淀粉、糖类和多种微量元素如钙、铁、镁以及膳食纤维等。红小豆含有较多的三萜皂甙(triterpenoidsaponin)，它能阻止过氧化脂质的产生、抑制脂肪吸收并促进其分解，具有良好的润肠通便、降血压、降血脂、调节血糖等作用。红小豆被广泛应用于预防和治疗糖尿病的食物中，例如中国专利2015103105847公布的一种预防和治疗糖尿病的辅助功能食品，其包含花生、黑芝麻、红小豆、紫米粉、糜子粉、燕麦粉、莜麦粉、牛蒡粉、榛子粉、苦瓜、啤酒酵母、苦杏仁以及sod冻干粉和小分子团水，该功能食品营养丰富，可作为糖尿病人果腹食品，但是该专利未公开其功能食品对糖尿病的预防效果。

黄秋葵(abelmoschusmoschatu)别名咖啡黄葵、羊角菜、羊角豆等，国外又名okra，是锦葵科秋葵属一年生草本植物。黄秋葵主要以荚嫩果供食用，其果实营养丰富，富含蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，是一种营养保健蔬菜。黄秋葵鲜荚果中含有一种由蛋白和多糖类物质组成的食用胶。它含有18种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸和其他谷物的限制性氨基酸—赖氨酸，还含有粘性的糖蛋白，一种由胶原蛋白和粘多糖类物质组成的多糖、蛋白质混合物，可增强机体的抵抗力，促进胆固醇物质的排泄。另外还含有一种果胶类多糖物质，是由半乳聚糖、阿拉伯聚糖与果胶组成的混合物。果胶类多糖是一种可溶性纤维，它能促进机体内有机物质的排泄，减少毒素在体内的积累，降低胆固醇的含量。秋葵的籽中维生素c和维生素a的含量很高，比果荚中高出很多，这两种维生素属于强效的抗氧化性物质，能辅助清除体内的自由基。秋葵籽还可以降低葡萄糖的吸收，还具有降血脂、抗氧化等效用，具有很好的开发应用价值。中国专利201810531173.4公开了一种糖尿病人饮用的黄秋葵茶及其制备方法，该黄秋葵茶以黄秋葵花、黄秋葵种皮、荷叶、蒲公英和甜叶菊为原料，虽然适于糖尿病患者饮用，起到抑制血糖升高的作用，但并未公开该黄秋葵茶的具体功能效果，仅可作为解决糖尿病患者对饮用甜品的需求。

海带(kelp)是一种具有药食双重价值的重要褐藻资源，是我国海水养殖的重要品种。目前，我国海带养殖面积和总产量均居世界首位。海带含糖类、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素及多种微量元素，是一种良好的天然保健食品。褐藻糖胶(fucoidan)又名岩藻聚糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸酯，是褐藻类植物(如海带)中所特有的多糖成分。它是一种特殊的多糖，在它的分子链末端，含有天然的硫酸基。正是由于天然硫酸基的存在，褐藻糖胶才能表现出优良、明显的生理活性。研究表明，褐藻糖胶具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗血栓、抗病毒、调节免疫活性、降血脂等多种生理活性，加之褐藻资源非常丰富，因而成为研究的热点。中国专利201010218084.8公开的褐藻多糖硫酸酯在制备预防和治疗糖尿病血管类疾病药物中的应用，采用低分子量褐藻多糖硫酸酯对ⅰ型糖尿病模型大鼠在体动物实验以及离体组织试验和蛋白水平进行研究，表明褐藻多糖硫酸酯对糖尿病血管并发症具有一定治疗作用，但未公开褐藻多糖硫酸酯对糖尿病本身的的预防功效；中国专利201310187507.8公开的褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的应用，表明低分子量褐藻多糖硫酸酯能通过增强心肌收缩功能和减轻心脏纤维化来对糖尿病心肌病病情产生有利的影响，但并未报道褐藻多糖硫酸酯对糖尿病本身的防治效果。

在现有技术中尚未发现将红小豆、黄秋葵等天然植物与褐藻糖胶混合组成组合物用于防治糖尿病的报导，研究开发一种能够预防自身免疫性糖尿病的组合物很有市场价值和社会意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种防治糖尿病的组合物的制备工艺，先将天然植物成分进行加工处理，再按照组份进行混合配制后，加工制成药物组合物，用于防治自身免疫性糖尿病。

为了实现上述目的，本发明涉及的防治糖尿病的组合物制备方法，其组合物原料成分包括红小豆粉、秋葵籽粉和褐藻糖胶，各原料成分的重量比例为红小豆粉∶秋葵籽粉：褐藻糖胶＝8～12∶3～7：3～7；具体制备工艺过程为：

(1)红小豆粉制备：

将红小豆挑捡并清洗擦干水份，再控温33℃～50℃下烘干后；放进锅中小火慢炒20分钟至酥脆并呈暗红色，并有豆香味；将炒熟的红小豆低温超微粉碎并过200目筛网，自然晾凉后装入密封容器中备用；

(2)秋葵籽粉制备：

选择新鲜并洗净的秋葵果，控温33℃～50℃下烘干或自然晾晒干；捏碎或轻轻压砸开秋葵果，去果皮，取秋葵籽，再将秋葵籽低温超微粉碎成200目粉末备用；

(3)褐藻糖胶制备：

海带预处理：取市售干海带洗净，控温75℃烘干，然后磨碎过50目筛网得海带粉末；再取海带粉末10份，加入50份ph值为5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入海带粉重量0.5％的由纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶按重量比例为25∶10∶10∶1∶5组成的复合酶，控温50℃酶解3小时；酶解结束后，再控温90℃灭酶10min；然后再离心去沉淀，将上清液旋蒸浓缩，再加入无水乙醇至体系中乙醇体积分数为30％，再经静置和离心，收集上清液备用；离心后的沉淀用体积分数为30％的乙醇水溶液洗涤两次，并将两次所得洗涤液合并到上述备用的上清液中，再旋蒸浓缩，加入无水乙醇至体系中乙醇体积分数为70％，静置18小时，收集沉淀物备用；再对沉淀物进行葡聚糖凝胶柱层析纯化：sephadexg-100在0.1mol/lnacl洗脱液中溶胀平衡，湿法装柱(2.6cm×56cm)；洗脱液平衡，上样，按10ml/h的流速，每20min收集一管，硫酸-苯酚法监测至无糖检出为止；收集液冷冻干燥，即为褐藻糖胶；用苯酚-硫酸法测定其总糖含量；采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，褐藻糖胶含量＝(总糖含量-还原糖含量)×0.9×100％＝72.4％；硫酸钡比浊法测定硫酸根含量为23.6％；

(4)组合物制备：

按重量比例为红小豆粉∶秋葵籽粉：褐藻糖胶＝8～12∶3～7∶3～7；其中，褐藻糖胶的纯度为90％(褐藻糖胶含量+硫酸根含量)以上，称取步骤(1)、(2)和(3)制备的原料，混合并搅拌均匀后得组合物产品；用于对自身免疫性糖尿病的预防和治疗，由于红小豆和秋葵籽混合于褐藻糖胶中在服用后由于体内温度和成分的变化，能促进其加快吸收利用，提高疗效20％以上。

本发明与现有技术相比，其采用的褐藻糖胶具有较强的免疫调节能力，而秋葵籽的抗氧化活性也比较突出，二者联合使用对自身免疫性糖尿病会具有较好的预防效果；另外秋葵籽和褐藻糖胶属于寒凉物质，而红小豆性温，具有滋补功效，作用既可以互补，又可以增加组合物的口感，该制剂配方合理，功效协同增效，生产安全、生产周期短、均属于食源性物质，对机体应用无任何毒副作用，应用环境友好。

附图说明：

图1为本发明涉及的组合物改善糖耐量并降低糖尿病发病率曲线图(a：行糖耐量试验；b：不同周龄血糖变化)。

图2为本发明涉及的组合物对nod小鼠脾脏细胞因子水平的影响柱状图。

图3为本发明涉及的组合物对nod小鼠tregs的影响分析图(a：流式细胞仪检测脾脏cd4+cd25+foxp3+tregs；b：westernblot检测脾脏foxp3的表达)。

图4为本发明涉及的组合物对nod小鼠dc表型的影响分析图。

图5为本发明涉及的组合物对nod小鼠胰腺细胞凋亡与自噬的影响分析图(a：透射电镜观察nod小鼠胰腺细胞超微结构；b：tunel检测胰腺细胞凋亡；c：westernblot检测胰腺细胞自噬相关因子表达水平)。

图6为本发明涉及的组合物对nod小鼠肠道微生物的beta多样性比较分析图(a：细菌otu的venn图；b：基于otu丰度的pca分析；c：anosim分析图；d：beta多样性热图；a2：nod对照组c2：实验组)。

图7为本发明涉及的组合物对nod小鼠肠道菌群分布情况影响分析图(a：各组样品菌门水平分布；b：各组样品菌科水平分布；c：各组样品菌属水平分布；a2：nod对照组c2：实验组)。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进行详细说明。

实施例1：

本实施例涉及的防治糖尿病的组合物原料成分包括红小豆粉、秋葵籽粉和褐藻糖胶，其制备工艺过程为：

(1)红小豆粉制备：

将红小豆挑捡并清洗擦干水份，再控温33℃～50℃下烘干后；放进锅中小火慢炒20分钟至酥脆并呈暗红色，并有豆香味；将炒熟的红小豆低温超微粉碎并过200目筛网，自然晾凉后装入密封容器中备用；

(2)秋葵籽粉制备：

选择新鲜并洗净的秋葵果，控温33℃～50℃下烘干或自然晾晒干；捏碎或轻轻压砸开秋葵果，去果皮，取秋葵籽，再将秋葵籽低温超微粉碎成200目粉末备用；

(3)褐藻糖胶制备：

海带预处理：取市售干海带洗净，控温75℃烘干，然后磨碎过50目筛网得海带粉末；再取海带粉末10份，加入50份ph值为5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入海带粉重量0.5％的由纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶按重量比例为25∶10∶10∶1∶5组成的复合酶，控温50℃酶解3小时；酶解结束后，控温90℃灭酶10min；再离心去沉淀，将上清液旋蒸浓缩，再加入无水乙醇至体系中乙醇体积分数为30％，再经静置和离心，收集上清液备用；离心后的沉淀用体积分数为30％的乙醇水溶液洗涤两次，并将两次所得洗涤液合并到上述备用的上清液中，再旋蒸浓缩，加入无水乙醇至体系中乙醇体积分数为70％，静置18小时，收集沉淀物；再对沉淀物进行葡聚糖凝胶柱层析纯化：sephadexg-100在0.1mol/lnacl洗脱液中溶胀平衡，湿法装柱(2.6cm×56cm)；洗脱液平衡，上样，按10ml/h的流速，每20min收集一管，硫酸-苯酚法监测至无糖检出为止；收集液冷冻干燥，即为褐藻糖胶；用苯酚-硫酸法测定其总糖含量；采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，褐藻糖胶含量＝(总糖含量-还原糖含量)×0.9×100％＝72.4％；硫酸钡比浊法测定硫酸根含量为23.6％；

(4)组合物制备：

按重量比例为红小豆粉∶秋葵籽粉：褐藻糖胶＝10∶5∶5；其中，褐藻糖胶的纯度为90％(褐藻糖胶含量+硫酸根含量)以上，称取步骤(1)、(2)和(3)制备的原料，混合并搅拌均匀后得组合物产品；用于对自身免疫性糖尿病的预防和治疗，由于红小豆和秋葵籽在混合于褐藻糖胶中能促进其吸收利用，提高疗效20％以上；如果配合其他药物服用，可有效提升药物功效，具体服用方法和用量应视病人情况而确定。

实施例2：

本实施例涉及使用实施例1制备的组合物改善糖耐量并降低糖尿病发病率的实验案例。

(1)实验模型：

本实验选取6周龄雌性非肥胖糖尿病(non-obesediabetic，nod)鼠20只，随机分为对照组(20只)、实验组(20只)，于7周龄开始，实验组给与600mg/kg.bw每天灌胃给组合物；对照组同法给予等容积生理盐水。给组合物时程为5周；停止干预后，对照组与实验组继续饲养至24-26周龄；

(2)实验方法及结果分析：

对12周龄小鼠夜间禁食8h后，腹腔注射2g/kg葡萄糖(200mg/ml葡萄糖溶液)；于注射前(0h)，注射后0.5h，1h，2h和3h分别由尾静脉采血，测定血糖水平。从13周龄开始，每周2次检测血糖直至动物26周龄；具体实验结果如图1(其中a为行糖耐量实验结果，b为不同周龄血糖变化实验结果)所示；

由图1a可以看出，与nod对照组相比，实验组小鼠葡萄糖负荷后30和60min能显著降低血糖水平(p<0.05，具有统计学意义)，提示糖耐量较对照组显著改善；

由图1b可以看出，观察的每组12只动物中，对照组有10只发生了糖尿病(发病率83.3％)；实验组6只发病(发病率50％)，提示组合物能够阻止nod鼠糖尿病的发展。

实施例3：

本实施例涉及使用实施例1制备的组合物对nod小鼠脾脏细胞因子水平的影响的实验和分析；

(1)实验模型

本实验选取6周龄雌性非肥胖糖尿病(non-obesediabetic，nod)鼠20只，随机分为对照组(10只)、实验组(10只)，于7周龄开始，实验组给与600mg/kg.bw每天灌胃给组合物；对照组同法给予等容积生理盐水，给组合物时程为5周；

(2)实验方法及结果分析：

采用elisa实验检测血清胰岛素、lps含量，以及脾脏细胞因子白介素(interleukin,il)-1、il-2、il-6、il-10、干扰素(interferon,ifn)-γ及转化生长因子(transforminggrowthfactor,tgf)-β水平，严格按照试剂盒说明书操作；具体结果如图2所示；

由图2可以看出,实验组12周龄nod鼠脾脏th1型细胞因子il-1、il-2、il-6和ifn-γ水平较对照组下降(p<0.05，具有统计学意义)；而th2型抗炎细胞因子il-4、il-10和tgf-β的水平明显升高(p<0.05，具有统计学意义)，提示组合物能够下调th1介导的自身免疫反应，并诱导具有免疫抑制效应的th2偏向细胞因子反应；

t1dm为一种典型th1介导的自身免疫性疾病，提高th2型细胞因子(如il-10、tgf-β)，而同时降低th1型细胞因子(如il-2、ifn-γ)生成的干预方式是防治t1dm的理想手段。

实施例4：

本实施例涉及使用实施例1制备的组合物刺激nod小鼠cd4+cd25+foxp3+tregs分化实验与分析；

(1)实验模型：

实验模型同实施例3；

(2)实验方法及结果分析：

cd4+cd25+foxp3+treg具有免疫调节效应，能够对抗自身免疫性糖尿病的发展；组合物干预5周后，以流式细胞仪测定nod鼠脾脏cd4+t细胞中cd4+cd25+foxp3+tregs所占比例；

①制备的脾细胞悬液：无菌条件下迅速取出脾脏，取部分脾组织制备脾淋巴细胞。将脾组织放入约含有5ml不含血清rpmi-1640培养基的培养皿内，用无菌针芯轻捻脾脏，制成单个细胞悬液；经100目尼龙筛网过滤，收集网下细胞悬液于离心管中；用pbs(0.1％nan3)洗涤细胞三次，1000rpm离心5min，调整细胞浓度为10⁶/ml细胞；

②记录实验分组，每组取200μl的悬浮细胞分别加入流式标记抗体fitc-cd4和pe-cy5-cd25，混匀，4℃避光反应30min；用flowcytometrystainingbuffer洗涤细胞两次后，加入fixation/permeabilization4℃避光反应30min，用flowcytometrystainingbuffer洗涤细胞两次，加入anti-mousefoxp3pe，4℃避光反应30min。用permeabilizationbuffer洗涤细胞两次后流式细胞仪上机检测，cd4设门，以foxp3为横坐标，以cd25为纵坐标；具体实验结果如图3(其中a为流式细胞仪检测脾脏cd4+cd25+foxp3+tregs分化程度图，b为westernblot检测脾脏foxp3的表达图)所示；

由图3a可以看出，对照组cd4+cd25+foxp3+tregs分化程度较低，而实验组脾淋巴细胞中cd4+cd25+foxp3+treg分化明显增加(p<0.05，具有统计学意义)，提示组合物干预具有诱导免疫耐受的作用；

由图3b可以看出，foxp3对treg的分化及功能极为重要。foxp3表达缺失会产生炎症细胞而参与t1dm的发病。与对照组相比，组合物干预可上调脾脏foxp3水平(p<0.01，具有统计学意义)；

以上结果提示，组合物可体内诱导cd4+cd25+foxp3+t细胞的分化而促进免疫耐受的形成。

实施例5：

本实施例涉及使用实施例1制备的组合物对nod小鼠dc表型的影响的分析；

(1)实验模型：

实验模型同实施例3；

(2)实验方法及结果分析：

采用流式细胞技术分析dc表面mhc-ii和共刺激分子cd86表达状态；取每只12周龄nod小鼠的股骨和胫骨，洗净并分离骨髓，100目尼龙筛网过滤去除杂质，pbs清洗后得骨髓细胞悬液。台盼蓝计数，调整细胞浓度约为2x106/ml；各取2ml细胞悬液于6孔培养板中，在加入rmgm-csf(20ng/ml)及rmil-4(10ng/ml)细胞因子后置于37℃，5％co2培养箱中培养；培养两天后弃去未贴壁细胞，加入等浓度细胞因子的rpmi-1640完全培养基，隔日半量换液；每天用倒置显微镜观察各组细胞的形态、生长情况以及集落的数量和大小；

第7天开始收集细胞，以流式细胞术测定dc表型；于200μl1×106/ml细胞悬液中分别加入fitc标记的小鼠cd11c抗体、pe标记的小鼠cd86抗体、pe-cy5标记的小鼠mhc-ⅱ抗体，4℃避光孵育30min，pbs清洗两次，重悬于400μlpbs溶液中，于流式细胞仪上检测dc的表型，cd11c设门，以cd86为横坐标，以mhcclassⅱ为纵坐标；具体实验结果如图4所示；

cd11c为dc标志性marker；由图4可以看出，实验组12周龄nod鼠cd11c+dcs表面mhcii和共刺激分子cd86表达较对照组显著下降(p<0.05，具有统计学意义)；提示组合物可抑制dc表面mhcii和cd86表达，维持dc的未成熟状态，在nod鼠体内诱导免疫耐受。

实施例6：

本实施例涉及实施例1制备的组合物对nod小鼠胰腺细胞凋亡与自噬的影响分析；

(1)实验模型：

实验模型同实施例3；

(2)实验方法及结果分析：

采用碧云天一步法tunel细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)检测胰腺组织细胞凋亡，步骤参照试剂盒说明书进行；留取小鼠胰腺组织经4％多聚甲醛固定细胞30分钟，pbs洗涤2次，每次10分钟，加入含0.5％tritonx-100的pbs，室温孵育5分钟。加50μltunel检测液，37℃避光孵育60分钟，pbs洗涤3次后用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察；激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)；具体实验结果如图5(其中a为透射电镜观察nod小鼠胰腺细胞超微结构；b为tunel检测胰腺细胞凋亡；c为westernblot检测胰腺细胞自噬相关因子表达水平)所示；

由图5a可以看到，组合物干预后自噬体和自噬溶酶体的数量明显增多；

由图5b可以看到，tunel结果显示组合物干预后胰腺细胞凋亡减少，自噬还可以发挥抗凋亡作用，可能机制是自噬形成的自噬体吞噬胞质内受损的线粒体，并限制促凋亡因子的扩散程度，从而帮助细胞对凋亡的逃逸；

线粒体自噬这一特异性选择过程受机体的精密调节，其中ampk是其主要的正向调控因子；ampk可通过抑制mtor1诱导自噬，促进转录因子eb(tfeb)去磷酸化入核，刺激下游自噬相关基因beclin1等的表达，介导自噬，还可以促进脂质外排、抑制炎性因子释放；

由图5c可以看出，western检测结果显示自噬过程特征蛋白微管相关蛋白1轻链3(mierotubule-associatedprotein1lightchain3，mapl-lc3)的表达出现改变，组合物干预增加了胰腺细胞lc3bⅱ的表达，lc3bⅱ/lc3bⅰ蛋白比值升高，激活自噬水平，其机制与上调ampk磷酸化(p<0.05，具有统计学意义)，抑制mtor1活性(p<0.01，具有统计学意义)，增加tfeb活性(p<0.05，具有统计学意义)，上调beclin1的表达(p<0.05，具有统计学意义)有关。

实施例7：

本实施例涉及实施例1制备的组合物对nod小鼠肠道菌群结构的影响分析；

(1)实验模型：

实验模型同实施例3；

(2)实验方法及结果分析：

称取500mg粪便样品，采用细菌基因组dna提取试剂盒获得肠道菌群基因组dna，利用thermonanodrop2000紫外微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳对样品基因组dna进行质检；以质检合格的各样品基因组dna为模板，对其16srdnav3～v4区域进行pcr扩增；使用的通用引物为f341，r806，在通用引物5’端加上适合hiseq2500pe250测序的index序列及接头序列，最终获得425bp左右扩增片段；pcr产物采用2％琼脂糖凝胶电泳及axyprepdna凝胶回收试剂盒切胶回收，并进行文库质检和定量；采用illuminahiseqpe250测序平台；对pcr产物进行16s测序分析。使用usearch、qiime、pandaseq、r语言等多种软件对测序结果进行系统的肠道菌群结构分子生态学分析；

肠道菌群在调节宿主代谢、免疫和炎症上发挥了关键作用；肠道菌群失调与各种疾病相关，包括肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、高血压等。已有的报导显示，肠道微生物群与人类以及非肥胖型糖尿病(nod)小鼠的自身免疫性1型糖尿病的发病机制有关；因此我们采用illuminamiseq高通量测序技术对nod小鼠肠道菌群16srdnav3-v4区进行序列测定，具体实验结果如图6(其中a为细菌otu的venn图，b为基于otu丰度的pca分析，c为anosim分析图，d为beta多样性热图)所示；

由图6a显示结果可知，nod小鼠对照组和实验组中共有otu数目为351，特有otu数目分别为57和75；由图6b显示结果可知，两组小鼠的微生物组成存在差异。由图6c及6d显示结果可知，两组小鼠的肠道菌群组成差异显著(r＝0.369，p＝0.001，具有统计学意义)，在otu水平下，对照组和实验组小鼠肠道菌群结构存在显著差异；

本实验从各otu中挑选丰度最高的一条序列，作为该otu代表序列，将该代表序列与已知物种的16s数据库进行比对，从而对每个otu进行物种归类注释，根据物种注释结果，分别在门、纲、目、科、属分类水平形成各样品物种相对丰度柱状图，以便直观查看各样品在不同分类水平上相对丰度较高的物种和比例，具体实验结果如图7(其中a为各组样品菌门水平分布；b为各组样品菌科水平分布；c为各组样品菌属水平分布，a2为nod对照组c2为实验组)所示；

由图7a显示结果可知，两组小鼠样品最优势菌门均为拟杆菌门(bacteroidetes)和厚壁菌门(firmicutes)，其中实验组拟杆菌门丰度较nod对照组(63.97％)显著减少，为51.37％，另外组合物干预组疣微菌门(verrucomicrobia)丰度明显升高(8.41％)，而对照组只有0.18％；

由图7b显示结果可知，在菌科水平，与nod对照组比较，组合物干预后拟杆菌科(bacteroidaceae)和普雷沃氏菌科(prevotellaceae)的丰度明显下降，分别为22.64％和4.00％，而乳杆菌科(lactobacillaceae)的丰度显著增加，达到22.80％，对照组仅为16.00％；

由图7c显示结果可知，两组小鼠肠道菌群菌属分布发生明显改变；nod对照组以bacteroides菌属为最优势菌属(46.84％)，但是实验组bacteroides的丰度下调(32.09％)，而以lactobacillus为优势菌属(32.82％)；值得一提的是在组合物干预组出现了akkermansia的明显富集，达到12.69％，对照组仅为0.37％。除此之外，组合物干预还增加了clostridiumxlva和anaerofustis菌属的丰度，降低了alloprevotella、enterorhabdus、mucispirillum菌属的丰度；

肠道菌群中的拟杆菌bacteroides是支链氨基酸的主要生产者，而血清中支链氨基酸的升高会导致胰岛素抵抗的加强；有研究认为乳杆菌属可诱导分泌il-10，通过调节性t细胞预防t1dm的发生；干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)可改变树突状细胞的形状，使dc对il-10更敏感，产生免疫耐受而延缓t1dm的发生；akkermansia菌属是糖尿病患者和前驱糖尿病显著减少的菌群，给高脂肪饮食的小鼠喂食活的akk菌可以逆转胰岛素抵抗等代谢紊乱；在实施例中，组合物干预后nod小鼠的拟杆菌属bacteroides的丰度下调，而lactobacillus菌属和akkermansia菌属出现明显富集，说明组合物可以通过调节肠道菌群延缓t1dm的发生；该组合物中的原料互相协同作用，可以提高对糖尿病的治疗效果，其有效率大于20％，其预防效果大于95％有明显改进。