本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗肿瘤作用的中药提取物的方法。
背景技术：
丁癸草，中药材名，为豆科植物丁癸草的全草。夏季采收，功能主治为：清热，解毒，去瘀，治感冒，高热抽搐，腹泻，黄疸，痢疾，小儿疳积，喉痛，目赤，疔疮肿毒，乳腺炎。
目前，现有文献对丁癸草中具有抗肿瘤作用的有效成分的研究报道并不多。而丁癸草中含有的化学成分众多，哪些有效部位具有抗肿瘤作用需要研发人员进一步研究开发；此外，由于肿瘤的种类也是十分众多的，丁癸草中的有效部位是否对所有肿瘤都有效，还是对部分肿瘤有效，这仍需研发人员通过大量的实验进行研究攻关。因此，以我国传统的中药材丁癸草为原料，开发出抗肿瘤药物对于肿瘤的治疗具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术对丁癸草中抗肿瘤有效部位的开发不足，提供一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗肿瘤作用的中药提取物的方法。由该方法制备得到的癸草有效部位具有抗肺癌以及鼻咽癌的作用。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗肿瘤作用的中药提取物的方法，包含如下步骤：
(1)取中药材丁癸草，用醇提取，浓缩提取液去除溶剂得丁癸草醇提取物；
(2)将丁癸草醇提取物加水混悬，然后依次用氯仿、乙酸乙酯分别萃取1～3次，取乙酸乙酯萃取部位，浓缩去除乙酸乙酯溶剂，得乙酸乙酯萃取物；
(3)将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离，得所述的中药提取物；
其中，步骤(3)中高速逆流色谱法的具体方法为：采用的溶剂为由正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水组成；其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水的体积比为1～3:3～4:2～3:1～2；高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为700～1000rpm；固定相保留值为：60％～80％，流动相的流速为1～2ml/min；分离温度为15～30℃；紫外检测波长为220～254nm；进样后收集25～33min的洗脱部位，即得所述的中药提取物。
最优选地，所述的正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水的体积比为2:3.5:2.5:1.5。
最优选地，高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为855rpm；固定相保留值为：76％，流动相的流速为1.5ml/min；分离温度为25℃；紫外检测波长为235nm。
优选地，步骤(1)中所述的提取为加热回流提取。
最优选地，步骤(1)中所述的用醇提取是指用体积分数为90～100％的乙醇水溶液。
最优选地，步骤(1)中所述的用醇提取是指用体积分数为95％的乙醇水溶液。
优选地，所述的加热回流提取次数为1～3次，每次的提取时间为0.5～1.5h；其中中药材丁癸草与乙醇水溶液的用量比为1g：12～18ml。
最优选地，所述的加热回流提取次数为1次，每次的提取时间为1h；其中中药材丁癸草与乙醇水溶液的用量比为1g：15ml。
优选地，步骤(2)中丁癸草醇提取物与水的用量比为1g：15～30ml；每次萃取过程中氯仿和乙酸乙酯的体积用量与水的体积用量比为1:0.5～1.5。
最优选地，步骤(2)中丁癸草醇提取物与水的用量比为1g：20ml；每次萃取过程中氯仿和乙酸乙酯的体积用量与水的体积用量比为1:1。
优选地，所述的肿瘤为肺癌或鼻咽癌。
本发明还提供一种由上述方法制备得到的中药提取物。
上述中药提取物在制备抗癌药物中的应用。
优选地，所述的抗癌药物为抗肺癌或鼻咽癌药物。
有益效果：本发明以中药材丁癸草为原料，提供了一种全新的抗肿瘤中药提取物的制备方法；该方法采用了中药现代化技术，首次利用高速逆流色谱技术从中药材丁癸草中制备出了具有抗肺癌或鼻咽癌的中药提取物；经实施例实验证明，所述的中药提取物具有抗肺癌或鼻咽癌作用，其中对鼻咽癌的抗癌作用最显著。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1中药提取物的制备
取中药材丁癸草，用体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取1次，提取时间为1h；浓缩提取液去除溶剂得丁癸草醇提取物；其中中药材丁癸草与乙醇水溶液的用量比为1g：15ml；
(2)将丁癸草醇提取物加水混悬，然后依次用氯仿、乙酸乙酯分别萃取2次，取2次萃取得到的乙酸乙酯萃取部位合并，浓缩去除乙酸乙酯溶剂，得乙酸乙酯萃取物；其中丁癸草醇提取物与水的用量比为1g：20ml；每次萃取过程中氯仿和乙酸乙酯的体积用量与水的体积用量比为1:1；
(3)将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离，得所述的中药提取物；
其中，高速逆流色谱法的具体操作为：
(3.1)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水按体积比为2:3.5:2.5:1.5混合，混合后充分振摇混匀后静置分层得上、下相溶液，而后将上、下相分开并超声脱气30min后，取上相溶液作为流动相，下相溶液为固定相，开启进样泵将固定相在设备的最大流速下泵入并充满逆流色谱柱，然后开启高速逆流色谱主机和检测器、色谱工作站，在转速855rpm，流速1.5ml/min的条件下泵入流动相；
(3.2)取乙酸乙酯萃取物溶于下相溶液中得样品溶液，然后装入进样试管中；其中乙酸乙酯萃取物与下相溶液的用量比为2mg:1ml；
(3.3)把进样滤头放入试管中，以1.5ml/min的流速把样品溶液泵进逆流色谱管道，样品溶液进完后继续以1.5ml/min的流速泵进流动相，进样后收集25～33min的洗脱部位，即得所述的中药提取物；
其中高速逆流色谱主机顺时针转动，固定相保留值为76％，检测波长为235nm；分离温度为25℃。
对比例1中药提取物的制备
取中药材丁癸草，用体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取1次，提取时间为1h；浓缩提取液去除溶剂得丁癸草醇提取物；其中中药材丁癸草与乙醇水溶液的用量比为1g：15ml；
(2)将丁癸草醇提取物加水混悬，然后依次用氯仿、乙酸乙酯分别萃取2次，取2次萃取得到的乙酸乙酯萃取部位合并，浓缩去除乙酸乙酯溶剂，得乙酸乙酯萃取物；其中丁癸草醇提取物与水的用量比为1g：20ml；每次萃取过程中氯仿和乙酸乙酯的体积用量与水的体积用量比为1:1；
(3)将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离，得所述的中药提取物；
其中，高速逆流色谱法的具体操作为：
(3.1)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水按体积比为1:1.5:1:1.5混合，混合后充分振摇混匀后静置分层得上、下相溶液，而后将上、下相分开并超声脱气30min后，取上相溶液作为流动相，下相溶液为固定相，开启进样泵将固定相在设备的最大流速下泵入并充满逆流色谱柱，然后开启高速逆流色谱主机和检测器、色谱工作站，在转速855rpm，流速1.5ml/min的条件下泵入流动相；
(3.2)取乙酸乙酯萃取物溶于下相溶液中得样品溶液，然后装入进样试管中；其中乙酸乙酯萃取物与下相溶液的用量比为2mg:1ml；
(3.3)把进样滤头放入试管中，以1.5ml/min的流速把样品溶液泵进逆流色谱管道，样品溶液进完后继续以1.5ml/min的流速泵进流动相，进样后收集25～33min的洗脱部位，即得所述的中药提取物；
其中高速逆流色谱主机顺时针转动，固定相保留值为76％，检测波长为235nm；分离温度为25℃。
对比例1与实施例1的不同之处在于，高速逆流色谱法中的溶剂中各成分的配比不同，其余步骤和条件参数均相同。对比例1的中各溶剂的配比为：正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水的体积比为1:1.5:1:1.5。而实施例1中正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水的体积比为2:3.5:2.5:1.5。
对比例2中药提取物的制备
取中药材丁癸草，用体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取1次，提取时间为1h；浓缩提取液去除溶剂得丁癸草醇提取物；其中中药材丁癸草与乙醇水溶液的用量比为1g：15ml；
(2)将丁癸草醇提取物加水混悬，然后依次用氯仿、乙酸乙酯分别萃取2次，取2次萃取得到的乙酸乙酯萃取部位合并，浓缩去除乙酸乙酯溶剂，得乙酸乙酯萃取物；其中丁癸草醇提取物与水的用量比为1g：20ml；每次萃取过程中氯仿和乙酸乙酯的体积用量与水的体积用量比为1:1；
(3)将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离，得所述的中药提取物；
其中，高速逆流色谱法的具体操作为：
(3.1)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇以及水按体积比为2:3.5:2.5:1.5混合，混合后充分振摇混匀后静置分层得上、下相溶液，而后将上、下相分开并超声脱气30min后，取上相溶液作为流动相，下相溶液为固定相，开启进样泵将固定相在设备的最大流速下泵入并充满逆流色谱柱，然后开启高速逆流色谱主机和检测器、色谱工作站，在转速855rpm，流速1.5ml/min的条件下泵入流动相；
(3.2)取乙酸乙酯萃取物溶于下相溶液中得样品溶液，然后装入进样试管中；其中乙酸乙酯萃取物与下相溶液的用量比为2mg:1ml；
(3.3)把进样滤头放入试管中，以1.5ml/min的流速把样品溶液泵进逆流色谱管道，样品溶液进完后继续以1.5ml/min的流速泵进流动相，进样后收集15～20min的洗脱部位，即得所述的中药提取物；
其中高速逆流色谱主机顺时针转动，固定相保留值为76％，检测波长为235nm；分离温度为25℃。
对比例2与实施例1的不同之处在于，高速逆流色谱法中进样后收集的洗脱部位不同，其余步骤和条件参数均相同。对比例2的中进样后收集15～20min的洗脱部位；而实施例1的中进样后收集25～33min的洗脱部位。
实验例：中药提取物抗肿瘤活性测试
取人鼻咽癌细胞cne1、人肺癌细胞a549置于培养基(rpmi1640培养基)中培养，癌细胞以10×103每孔加入96孔板中，在37℃含5％co2的培养箱中培养24小时后贴壁后吸去原来的培养基。然后空白组再加入含10％胎牛血清的rpmi1640培养基；实验组分别加入含有0.01～100μg/ml待测药物的rpmi1640培养基；继续培养48h后，再加入浓度5mg/ml的mtt，继续培养4h，吸去上清液，加入100μldmso，暗处放置10min，利用酶标仪(sunrise公司)在570nm下测定吸光值，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设6个重复孔。细胞存活率(％)＝δod药物处理组/δod空白组×100。再根据剂量效应曲线计算细胞半抑制浓度(ic50)，实验结果见表1，其中ic50值越小说明其抗肿瘤效果越好。其中实验组1加入的待测药物为实施例1制备得到的中药提取物；实验组2加入的待测药物为对比例1制备得到的中药提取物；实验组3加入的待测药物为对比例2制备得到的中药提取物。
表1.中药提取物抗肿瘤活性测试结果表
从表1数据中可以看出，在本发明所述的高速逆流色谱法的具体条件下制备得到的丁癸草中药提取物具有抗鼻咽癌以及肺癌的作用；其中对鼻咽癌的抗癌作用最为显著，远远优于肺癌。
此外，通过对比例1和实施例1的数据可以看出，对比例1制备得到的丁癸草中药提取物抗鼻咽癌和肺癌作用大幅降低，这说明在高速逆流色谱法中的溶剂中各成分的配比是影响丁癸草中药提取物中抗癌有效成分的富集的关键因素；而在实施例1所述的溶剂配比下能够富集到大量的抗癌成分，尤其是抗鼻咽癌成分。通过对比例2和实施例1的数据可以看出，对比例2制备得到的丁癸草中药提取物并不具备抗癌作用，这说明高速逆流色谱法中洗脱部位对有效部位起决定性作用，而在本发明在实施例1所述的进样后收集25～33min的洗脱部位富集了大量的抗癌成分，尤其是抗鼻咽癌成分；在其他洗脱部位并不能富集抗癌成分。