一种可显著提高附子单酯型生物碱的方法与流程

本发明属于药物炮制
技术领域：
，具体为一种可显著提高附子单酯型生物碱的方法。
背景技术：
：附子，又名乌头或附片，别名：草乌、盐乌头、鹅儿花、铁花、五毒。其不仅是川产道地中药材，还是我国重要的传统中药材，具有回阳救逆之功效，受到中医的高度重视，但其毒性也为临床顾忌。在《中国药典》中主要控制的指标是双酯型生物碱(新乌头碱、次乌头碱、乌头碱总量)和单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总量)的限度检查，双酯型生物碱是毒性成分，单酯型生物碱是有效成分。传统炮制通过高温蒸煮水解使毒性成分双酯型生物碱转化为单酯型生物碱，降低了有毒成分，一定程度上提高了有效成分。但有效成分单酯型生物碱的含量只能保证≥0.010％，其含量还是很低。且加工工艺技术水平低，加工周期长，质量难控制都是传统炮制附子的缺点。由于健康中国发展，附子的需求量不断增加，单从扩大种植量来满足需要大大提高了成本，若能稍微改动炮制工艺，应用纯种微生物炮制技术就能使有效成分能显著提高，更符合资源节约型社会的发展。技术实现要素：本发明的目的是针对传统炮制附子有效成分单酯型生物碱含量低，加工周期长，质量难控制的问题，一种可显著提高附子单酯型生物碱的方法。该方法中通过在炮制附子过程中，找到配合的一株菌种应用于附子炮制使有效成分含量增加，纯种微生物炮制相比于传统炮制质量控制方面大大提高。为了实现上述发明目的，本发明的具体技术方案为：一种可显著提高附子单酯型生物碱的方法，其包括以下步骤：1)将附子进行清洗，用胆巴浸泡，得胆附子；2)将步骤1)中得到的胆附子切片，使其厚度为4-6mm，然后将胆附子片用沸水进行煮制，使其煮透心；3)将步骤2)处理后的胆附子片用自来水进行漂洗，并使其温度降为常温；4)将降温后的胆附子片接着用水浸泡脱胆，至口尝微麻舌；5)将浸泡后的胆附子片进行常压蒸煮，至出现油面光泽，然后加入纯种微生物菌悬液(微生物菌悬液的添加量以淹没附子即可)进行发酵，发酵时间为24-72h，优选48h。微生物菌悬液的od值为1.2～1.4。发酵的温度为28-32℃，优选30℃。6)将发酵后的胆附子片洗净除菌后低温烘至全干，即得炮制后的胆附子片。低温烘干的温度为50-58℃。所述微生物菌悬液中的菌种为宛氏拟青霉，购买于四川省微生物资源平台菌种保藏中心，保藏编号为sicc3.839。所述微生物菌悬液中的菌种为黑曲霉，购买于四川省微生物资源平台菌种保藏中心，保藏编号为sicc3.643。本申请中，附子的炮制方法也可采用现有技术，见《中华人民共和国药典》(2015版)；不同的是增加了用微生物菌悬液发酵步骤，而微生物菌悬液的制备步骤也为现有技术。本发明的积极效果为：(一)将sicc3.839宛氏拟青霉加入生附子中进行炮制，使生附子片中有效成分单酯型生物碱提高了11.11％。(二)将sicc3.839宛氏拟青霉应用于附子炮制工艺，能显著提高附子有效成分单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总量)的含量，最高达47.7％。附图说明图1本发明所述可显著提高附子单酯型生物碱的方法的流程结构示意图。具体实施方式为了使本发明的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。本申请中所涉及的％如无特殊说明，均表示其质量百分含量，即wt％。实施例1：一种可显著提高附子单酯型生物碱的方法，包括以下步骤：1)将附子进行清洗，用胆巴浸泡，得胆附子；2)将步骤1)中得到的胆附子切片，使其厚度为5mm左右，然后将胆附子片用沸水进行煮制，使其煮透心；3)将经步骤2)处理后的胆附子片，用自来水进行漂洗，并使其温度降为常温；4)将降温后的胆附子片接着用水进行浸泡脱胆，至口尝微麻舌；5)将浸泡后的胆附子片进行常压蒸煮，至出现油面光泽，然后加入微生物菌悬液进行发酵，微生物菌悬液的添加量以淹没胆附子片为准；所述的菌种为宛氏拟青霉，购买于四川省微生物资源平台菌种保藏中心，保藏编号为sicc3.839，菌悬液od值在1.2，发酵时间为48h，发酵温度为30℃，发酵初始ph值为5.8(自然)。6)将蒸煮后的胆附子片低温烘至全干，即得炮制后的胆附子片。实施例2：一种可显著提高附子单酯型生物碱的方法，包括以下步骤：1)将附子进行清洗，用胆巴浸泡，得胆附子；2)将步骤1)中得到的胆附子切片，使其厚度为5mm左右，然后将胆附子片用沸水进行煮制，使其煮透心；3)将步骤2)处理后的胆附子片用自来水进行漂洗，并使其温度降为常温；4)将降温后的胆附子片接着用水浸泡脱胆，至口尝微麻舌；5)将浸泡后的胆附子片进行常压蒸煮，至出现油面光泽，然后加入微生物菌悬液进行发酵；所述微生物菌悬液中的菌种为黑曲霉，购买于四川省微生物资源平台菌种保藏中心，保藏编号为sicc3.643。菌悬液od值为1.3，发酵时间为48h，发酵温度为30℃，发酵初始ph值为5.8(自然)。6)将发酵后的胆附子片低温烘至全干，即得炮制后的胆附子片。试验1：目的：研究胆巴浸泡和微生物加入对生附子单双酯生物碱含量的影响。①生附子：生附子洗净切片烘干后，检测其双酯型和单酯型生物碱含量，为对照试验。②生附子蒸馏水浸泡：生附子洗净后切片，用(与炮制相同体积的)蒸馏水浸泡2天然后烘干，检测其双酯型和单酯型生物碱含量，研究蒸馏水加入后对生附子双、单酯生物碱含量的影响。3、生附子微生物浸泡：生附子洗净后切片，用筛选的纯种微生物菌悬液浸泡1天、2天、3天后烘干，检测双酯型和单酯型生物碱含量，研究不同菌株以及发酵天数对生附子单双酯生物碱含量的影响。4、胆附子：生附子洗净后用相同体积胆巴液浸泡2天和浸泡透心后制成胆附子(浸泡15天)，切片烘干，检测双酯型和单酯型生物碱含量，研究胆巴对生附子中单双酯生物碱含量的影响。实验结果如下表：胆巴主要起防腐功效，由上表可知，当浸泡时间与蒸馏水相同时，单双酯生物碱含量差别不大。当浸泡时间为15天时，单双酯生物碱扩散到溶液中使附子中的单双酯生物碱含量变低。宛氏拟青霉和黑曲霉炮制后与蒸馏水对比，这两种微生物对附子有毒成分双酯型生物碱有一定的降低，对有效成分单酯型生物碱有一定提高。其中宛氏拟青霉效果最好，双酯型生物碱降低3％，单酯型生物碱提高11.11％。对比例1：采用与实施例1同样的方法和步骤进行黑顺片的制备，仅将实施例1中采用的sicc3.839宛氏拟青霉替换为sicc2.1004异常毕赤酵母，检测黑顺片双酯型和单酯型生物碱含量。对比例2：采用与实施例1同样的方法和步骤进行黑顺片的制备，仅将实施例1中采用的sicc3.839宛氏拟青霉替换为sicc2.956盔状毕赤酵母，检测黑顺片双酯型和单酯型生物碱含量。对比例3：采用与实施例1同样的方法和步骤进行黑顺片的制备，仅将实施例1中采用的sicc3.839宛氏拟青霉替换为sicc1.714枯草芽孢杆菌，检测黑顺片双酯型和单酯型生物碱含量。对比例4：采用与实施例1同样的方法和步骤进行黑顺片的制备，仅将实施例1中采用的sicc3.839宛氏拟青霉替换为sicc1.950枯草芽孢杆菌，检测黑顺片双酯型和单酯型生物碱含量。对比例5:采用与实施例1同样的方法和步骤进行黑顺片的制备，仅将实施例1中采用的sicc3.839宛氏拟青霉替换为sicc3.388绿色木霉，检测黑顺片双酯型和单酯型生物碱含量。试验2：目的：研究筛选菌株的加入对附子炮制成黑顺片单双酯生物碱含量的影响。1、传统黑顺片：传统工艺炮制附子制黑顺片，检测黑顺片双酯型和单酯型生物碱含量，作为加入纯种微生物菌悬液进行发酵炮制工艺的对照。2、微生物炮制黑顺片：在传统炮制黑顺片基础上，蒸制后加入筛选的纯种微生物菌悬液发酵2天(其中，sicc3.839宛氏拟青霉发酵2天为实施例1中产品的检测数据，sicc3.643黑曲霉发酵2天为实施例2中产品的检测数据，而sicc2.1004异常毕赤酵母发酵2天为对比例1中产品的检测数据，sicc2.956盔状毕赤酵母发酵2天为对比例2中产品的检测数据，sicc1.714枯草芽孢杆菌发酵2天为对比例3中产品的检测数据，sicc1.950枯草芽孢杆菌发酵为对比例4中产品的检测数据，sicc3.388绿色木霉发酵2天为对比例5中产品的检测数据)，检测双酯型和单酯型生物碱含量，实验结果得出发酵2天时效果最好研究加入菌株后对黑顺片单双酯生物碱的影响。结果如下表：如上表可知，这两株效果好的菌株在炮制附子制黑顺片的过程中，效果进一步提高，分析可能是因为胆巴浸泡和附子蒸煮后杀死了杂菌，再接入纯种微生物后炮制减少了杂菌的影响，使效果得到提高。其中加入宛氏拟青霉的效果最好，有毒成分双酯型生物碱含量降低49.40％，有效成分单酯型生物碱含量提高23.18％。试验3：目的：炮制条件对黑顺片单双酯生物碱含量的影响宛氏拟青霉炮制黑顺片：在传统炮制黑顺片基础上，蒸制后加入筛选的纯种宛氏拟青霉，在不同的条件下进行炮制，炮制时间分别为24h、36h、48h、60h、72h，初始ph值分别为5.8、8、10，温度分别为27℃、30℃、33℃，检测双酯型和单酯型生物碱含量，研究炮制条件对黑顺片单双酯生物碱的影响。炮制时间对双酯型和单酯型生物碱含量的影响炮制时间双酯型生物碱单酯型生物碱24h0.0098％0.0162％36h0.0061％0.0171％48h0.0042％0.0186％60h0.0033％0.0158％72h0.0027％0.0130％初始ph对双酯型和单酯型生物碱含量的影响温度对双酯型和单酯型生物碱含量的影响温度℃双酯型生物碱单酯型生物碱270.0040％0.0183％300.0042％0.0186％330.0043％0.0188％如表可知，用宛氏拟青霉炮制附子制黑顺片，当炮制时间为48h,初始ph为10，温度为33℃时，其单酯型生物碱含量最高。但考虑到药物的安全性，不宜用ph过高的条件，为避免杂菌的污染，并且菌种炮制温度的影响较小，所以确定炮制的最适条件为：时间48h,初始ph8，温度为30℃。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12