一种人多能干细胞来源的外泌体的应用的制作方法

本发明涉及人多能干细胞来源的外泌体的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

衰老作为一种不可避免的生物过程其特征是组织和器官的功能衰退。在衰老过程中，衰老细胞逐渐积累在多种组织中，并表达衰老相关的β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(p16和p21)以及与氧化应激相关的多种介质等，这种变化导致了内环境平衡的紊乱进而影响细胞再生功能。目前，老年患者慢性伤口的愈合仍是世界性的医学难题。在对不同年龄患者伤口愈合的研究中发现，伤口局部血管新生能力减弱是导致老年患者伤口愈合延迟的重要因素。血管新生作为一种内源性修复机制，通过恢复血液灌注和向受损部位提供营养，在伤口愈合和组织再生中起着至关重要的作用，而内皮细胞则是参与血管新生的关键组成部分。在老年组织中，衰老的内皮细胞数目增加使得血管生成功能受损，因此，通过改善内皮细胞衰老、恢复血管新生功能是促进老年患者伤口愈合的一项新的治疗策略。

干细胞疗法在衰老相关疾病中显示出巨大的治疗潜力，不同组织来源的人成体干细胞已被多数研究证实具有改善衰老相关表型、提高老年患者机体功能的作用。间充质干细胞的移植可以改善衰老心肌细胞和骨关节炎中软骨细胞的衰老相关表型。除成体干细胞外，多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonicstemcell,escs)与诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,ipscs)有望成为治疗衰老相关疾病的最有前景的候选细胞，因为它们具有无限增殖能力及多向分化潜能，可以阻止细胞衰老。min等人的一项研究表明，向心肌内注射胚胎干细胞可通过协同血管生成和肌细胞生成来改善衰老大鼠的心肌功能。然而，成瘤和免疫反应限制了干细胞移植在临床的大规模应用。外泌体是一类直径为30-150nm的天然纳米粒子，几乎可以被所有类型的细胞分泌。它们可以通过从供体细胞转移生物活性分子来调节受体细胞的功能。干细胞分泌的外泌体已被证明同样具有干细胞的促进再生功能，并在多种动物疾病模型中得到验证，与干细胞移植相比几乎无成瘤风险且免疫反应低。先前的研究表明，来自间充质干细胞的外泌体通过促进损伤部位血管新生加速了皮肤伤口愈合和下肢缺血后的修复。由于诱导人多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的全能性，其分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mrna、microrna等，表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。研究发现多能干细胞分泌的外泌体具有显著的抑制细胞衰老过程，改变靶细胞表观遗传特征，且发现其能显著激活衰老相关信号通路nrf2，促使衰老的内皮细胞年轻化，从而促进衰老组织的再生与修复。目前尚未见利用多能干细胞外泌体激活nrf2，促使内皮细胞年轻化修复衰老组织损伤的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种人多能干细胞来源的外泌体的应用，尤其是人多能干细胞来源的外泌体靶向nrf2改善内皮细胞衰老修复难愈合皮肤创面的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种人多能干细胞来源的外泌体的应用，所述人多能干细胞来源的外泌体作为制备减少氧化应激水平的药物的应用。

进一步地，所所述人多能干细胞来源的外泌体作为制备减少氧化应激水平，进而改善内皮细胞衰老和/或促使衰老的内皮细胞年轻化的药物的应用。

进一步地，所述人多能干细胞来源的外泌体作为制备减少氧化应激水平，进而促进皮肤创面的血管新生的药物的应用。

进一步地，所述人多能干细胞来源的外泌体作为制备激活nrf2的药物的应用。

进一步地，所述人多能干细胞来源的外泌体作为制备下调keap1的药物的应用。

进一步地，所述人多能干细胞来源的外泌体作为制备将所述人多能干细胞来源的外泌体中包裹的mirna转移至受体细胞的药物的应用。

进一步地，所述mirna包括mir-7、mir-200a、mir-141a、mir-432、mir-29和mir-23a。

进一步地，所述人多能干细胞来源的外泌体通过转运mir-200a调控nrf2信号通路改善内皮细胞衰老。

进一步地，所述内皮细胞为人脐静脉内皮细胞或人微血管内皮细胞。

进一步地，所述人多能干细胞来源的外泌体作为制备修复难愈合皮肤创面的药物时，所述人多能干细胞来源的外泌体以悬浮剂、负载其他物质的复合物或作为功效成分的添加剂的形式使用。

本发明中，人多能干细胞外泌体的收集与鉴定方法为：采用无饲养层及无血清培养基e8或mtesr培养人胚胎干细胞(escs)，收集培养上清，采用超速离心方法分离收集培养上清中的外泌体，通过电镜分析形态、数量及粒径分析及免疫印迹(wb)检测标志物对外泌体进行鉴定，获得escs来源的外泌体(escs-exos)。

本发明中，采用动物实验观察escs-exos对老年压力性溃疡创面的修复功能。构建衰老小鼠模型及实验分组：取6-8周雄性c57bl/6小鼠按1000mg/kg每天皮下注射d-半乳糖，8周后取材鉴定模型成功。对衰老模型鼠背部皮肤构建压力性溃疡创面，分实验组与对照组，实验组以escs-exos对溃疡创面进行涂抹，对照组涂抹生理盐水。分不同时间点取材分析，主要观察以下指标：

1)大体观分析创面愈合情况：分d0、d3、d7、d14、d21不同时间点记录；

2)he染色：观察表皮、真皮层厚度等结构变化；

3)masson染色：观察胶原含量、排列等；

4)免疫组化检测：p16免疫荧光染色观察细胞衰老状况；

5)氧化指标检测：mda、sod、gsh-px、cat

6)血管新生检测：cd31免疫组化、cd31/alpha-sma免疫双染、micro-fil血管成像；

7)血管衰老检测：cd31/p16免疫双重染色

本发明中，采用体外细胞实验验证escs-exos对衰老血管内皮细胞功能的影响。以d-半乳糖诱导构建人脐静脉内皮细胞衰老模型，实验分衰老内皮细胞escs-exos干预组及生理盐水对照组及年轻内皮细胞组，通过以下指标检测分析escs-exos对衰老内皮细胞功能的影响。

1)sa-β-gal染色及p16细胞免疫荧光检测观察细胞衰老状况；

2)外泌体内吞实验观察内皮细胞摄入escs-exos情况；

3)wb检测p16、p21、nrf2、ho1、keap1等，分析细胞衰老标志物及nrf2信号通路相关分子的变化；

4)ki-67免疫荧光及cck8检测细胞增殖能力；

5)划痕实验及transwell实验检测细胞迁移能力；

6)成管实验检测细胞成血管能力；

7)ros检测细胞氧化应激能力；

本发明中，采用体外细胞实验进一步验证escs-exos通过转运mir-200a调控nrf2信号通路改善内皮细胞衰老。实验分衰老内皮细胞escs-exos干预组及mir-200a反向sirna同时干预组及对照组(aged、aged+exos、aged+exos+ansirna)，观察以下指标：

1)荧光定量pcr技术检测外泌体和细胞mirnas,包括mir-200a；

2)wb检测p16、p21、nrf2、ho1、keap1等，分析细胞衰老标志物及nrf2信号通路相关分子的变化。

与现有技术相比，本发明首次证明了escs-exos可以加速皮肤创面愈合的进程，通过改善血管内皮细胞衰老促进创面局部血管新生。escs-exos通过将mir-200a转移至衰老的血管内皮细胞并激活nrf2信号发挥抗衰老作用。我们的研究表明，作为一类天然纳米材料，多能干细胞外泌体可以像多能干细胞一样发挥作用，并通过将包裹的生物活性分子转移至靶细胞而发挥抗衰老和促再生的功能。总之，多能干细胞外泌体将会是一种治疗衰老相关疾病的新的治疗途径。

附图说明

图1：escs及escs-exos表征的鉴定结果：

a为escs形态，b为碱性磷酸酶染色，c分别为oct4、nanog、tra-1-60、ssea4的免疫荧光染色，d为escs-exos的粒径分布，e为escs-exos的电镜图，f为escs-exos的标志物cd9/cd63/tsg101/gm130的免疫印迹结果。

图2：d-半乳糖诱导皮肤衰老模型的鉴定结果：

a为对照组和衰老组的大体观，b为对照组和衰老组小鼠皮肤的he染色，c为表皮、真皮、肌肉厚度的统计图，d为衰老标志物p16免疫荧光染色，e为mda，sod，cat和gsh-px表达水平的统计图。

图3：escs-exos促进衰老小鼠皮肤压力性溃疡愈合的实验结果：

a为创面大体观，b创面收缩率统计图，c为创面组织的h&e染色结果，d瘢痕宽度的统计图，e为masson染色显示胶原沉积结果。

图4：escs-exos增强血管生成并改善小鼠伤口部位血管内皮细胞衰老的实验结果：

a为microct皮肤血管造影结果，b为二组血管数量统计图，c为血管内皮标志物cd31免疫组化染色，d为新生血管统计图，e为cd31与衰老标志物p16双色免疫荧光染色。

图5：escs-exos改善体外培养的血管内皮衰老的表型：

a和b为sa-β-gal染色结果及阳性细胞统计图，c为p16和p21蛋白westernblot结果，d为p16免疫荧光染色结果。

图6：escs-exos改善体外培养的衰老血管内皮细胞的功能：

a和b为ki67检测及统计结果，c、d、e、f为细胞迁移功能检测及统计结果，g为成管功能检测结果。

图7：escs-exos通过激活nrf2改善内皮细胞氧化应激水平，

a为活性氧(ros)水平检测结果，b为mda、sod、cat和gsh-px水平检测结果，c为nrf2和ho1的检测结果。

图8：escs-exos通过激活nrf2改善内皮细胞衰老表型：

a为衰老标志物p16和p21检测结果，b和c为sa-β-gal检测结果，d为p16免疫荧光染色结果，e为活性氧(ros)检测结果。

图9：escs-exos通过激活nrf2改善内皮细胞的功能：

a和b为ki67检测及统计结果，c、d、e、f为细胞迁移功能检测及统计结果，g为成管功能检测结果。

图10：esc-exos通过转移mir-200a下调keap1的表达来激活nrf2：

a为escs-exos中mir-7、mir-200a、mir-141a、mir-432、mir-29和mir-23a的相对表达水平，b为escs-exos处理后的huvec中mir-200a的表达水平，c和d为验证mir-200a与keap1靶向关系的结果，e为mir-200a的特异性抑制剂(mir-200aantagomir)处理后huvec衰老表型的变化结果，f和g为mir-200a的特异性抑制剂处理后huvec的sa-β-gal阳性细胞的变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

人多能干细胞外泌体的收集与鉴定：采用无饲养层及无血清培养基e8或mtesr培养人胚胎干细胞(escs)，收集培养上清，采用超速离心方法分离收集培养上清中的外泌体，通过电镜分析形态、数量及粒径分析及免疫印迹(wb)检测标志物对外泌体进行鉴定。获得escs来源的外泌体(escs-exos)。

对escs及escs-exos表征进行鉴定，如图1所示。

荧光染色显示，escs克隆表达多能性相关标志物，包括oct4，nanog，tra-1-60，ssea4，以及碱性磷酸酶。从escs培养基中提取的外泌体进行qnano检测，显示大多数外泌体的粒径分布在50-150nm的范围内，透射电子显微镜(tem)成像观察到囊泡具有外泌体特征性的杯口样形态。通过蛋白质印迹分析，证明提取的囊泡表达外泌体标志物，包括cd9，cd63和tsg101，但不表达高尔基体基质蛋白gm130。

实施例2

动物实验观察escs-exos对老年压力性溃疡创面的修复功能。

构建衰老小鼠模型及实验分组：取6-8周雄性c57bl/6小鼠按1000mg/kg每天于颈背部皮下注射d-半乳糖(d-gal)，诱导小鼠衰老，8周后取材鉴定。

参考图2，与对照组小鼠，d-gal处理后的小鼠表现出明显的皮肤老化表型。h&e染色显示d-gal处理后皮肤中真皮层和皮下肌肉层厚度明显减少。此外，p16的免疫荧光(if)染色显示，与对照组相比，d-gal处理后皮肤p16阳性细胞的数量明显增多。考虑到增加的氧化应激水平是d-gal诱导衰老的关键机制，因而又对每组皮肤组织中mda、sod、cat和gsh-px水平进行测量。发现d-gal处理的小鼠mda水平显着增加，而sod，cat和gsh-px水平的活性明显降低。所有这些变化都与自然衰老过程中的表现一致。这些结果表明d-gal诱导的皮肤衰老模型已经成功建立。

其中，control表示的是年轻的小鼠，aged表示的是注射d-半乳糖后衰老的小鼠。

对衰老模型鼠背部皮肤构建压力性溃疡创面，分实验组与对照组，实验组以escs-exos对溃疡创面进行涂抹，对照组涂抹pbs。分不同时间点取材分析，主要观察以下指标：

1)大体观分析创面愈合情况：分d0、d3、d7、d14、d21(第21天)不同时间点记录；

2)he染色：观察表皮、真皮层厚度等结构变化；

3)masson染色：观察胶原含量、排列等；

4)免疫组化检测：p16免疫荧光染色观察细胞衰老状况；

5)氧化指标检测：mda、sod、gsh-px、cat

6)血管新生检测：cd31免疫组化、cd31/alpha-sma免疫双染、micro-fil血管成像；

7)血管衰老检测：cd31/p16免疫双重染色

结果参考图3，结果显示，与年轻对照组相比aged-pbs组中的伤口显示出明显的延迟愈合，而外泌体的局部应用可明显加速老年小鼠的伤口愈合，其愈合速率与年轻对照组相当，第21天时，各组小鼠伤口都达到了相似的愈合效果。第7天的h&e染色显示，与年轻对照组相比，aged-pbs组中表皮和真皮的再生受损，而aged-exos组中的表皮和真皮则显示出明显增强的再生能力。不仅如此，与aged-pbs组相比，masson三色染色显示aged-exos组中的胶原沉积明显增加。以上数据表明，escs-exos的局部应用可加速衰老小鼠皮肤压力性溃疡的愈合，且愈合速率与年轻小鼠相当。

实施例3

体外细胞实验验证escs-exos对衰老血管内皮细胞功能的影响。

以d-半乳糖诱导构建人脐静脉内皮细胞衰老模型，实验分衰老内皮细胞escs-exos干预组及pbs对照组及年轻内皮细胞组，通过以下指标检测分析escs-exos对衰老内皮细胞功能的影响。

1)sa-β-gal染色及p16细胞免疫荧光检测观察细胞衰老状况；

2)外泌体内吞实验观察内皮细胞摄入escs-exos情况；

3)wb检测p16、p21、nrf2、ho1、keap1等，分析细胞衰老标志物及nrf2信号通路相关分子的变化；

4)ki-67免疫荧光及cck8检测细胞增殖能力；

5)划痕实验及transwell实验检测细胞迁移能力；

6)成管实验检测细胞成血管能力；

7)ros检测细胞氧化应激能力。

血管新生能力是皮肤伤口愈合的关键因素。

参考图4，本实施例评估了escs-exos对衰老小鼠伤口部位血管生成的影响。在首次治疗后的第14天，通过micro-ct来评价创面局部血管新生的情况。三维重建图像显示，aged-pbs组中创面局部血管密度明显低于年轻对照组，而外泌体治疗后创面局部血管密度明显提高。cd31和α-sma/cd31免疫染色的结果也证实了这一结论。此外，通过观察cd31/α-sma双阳性细胞的数量，发现escs-exos也可以明显促进新生血管的成熟。这些结果表明，escs-exos可以增强衰老小鼠的血管生成并促进血管成熟。

先前的研究表明，血管内皮细胞的衰老导致了血管生成能力的受损，而这些衰老内皮细胞的年轻化可以改善衰老相关的血管功能障碍，促进血管新生，增强伤口愈合速率。

因此，进一步观察escs-exos是否能够通过改善衰老小鼠伤口部位血管内皮细胞的衰老状态从而恢复活力。通过对衰老指标p16和血管内皮标志物cd31的免疫荧光共染，观察到，aged-pbs组创面存在大量衰老的血管内皮细胞，而在年轻对照组中几乎未观察到血管内皮细胞的衰老。escs-exos治疗后衰老血管内皮细胞的数量明显降低。这些结果表明，escs-exos可以改善内皮细胞衰老和恢复衰老相关的血管生成的功能障碍，从而加速衰老小鼠压力性溃疡的愈合。

实施例4

体外细胞实验进一步验证escs-exos可以在体外改善血管内皮衰老和衰老相关的血管生成功能障碍。

参考图5、图6。

首先，在体外通过使用d-gal建立了人脐静脉内皮细胞(huvec)的衰老模型。与年轻对照组相比，在d-gal处理(aged组)后，sa-β-gal阳性细胞的数量明显增多，同时westernblot显示aged组p16和p21蛋白表达水平显着增加。免疫荧光也进一步证实。

d-gal处理后huvecp16阳性细胞数增多。为了检测escs-exos对huvec衰老表型的影响，首先确定escs-exos是否可以被内吞至衰老huvec中。荧光结果显示，绿色荧光染料(dio)标记的escs-exos在孵育12小时后可以转移至huvec中。之后采用1×10¹⁰颗粒/mlescs-exos处理衰老的huvec。随着处理时间的延长，衰老huvec中sa-β-gal阳性细胞数逐渐减少，且在处理后第9天出现明显减少，因而在接下来的实验中均采用外泌体处理9天进行后续实验。westernblot分析显示，escs-exos处理后衰老huvecp16和p21蛋白表达水平明显下调。免疫荧光也显示escs-exos处理后衰老huvecp16阳性细胞数量减少。这些结果表明，通过escs-exos处理可以逆转由d-gal诱导的内皮细胞衰老的表型。

由于血管内皮细胞的血管生成活性在衰老过程中受到损害，因此接下来检测了escs-exos对衰老huvec的血管生成表型的影响。通过ki-67免疫荧光染色和cck8检测评估huvec的增殖能力，结果表明：d-gal处理后huvec增殖能力相比的未处理组(年轻组)明显降低，而escs-exos可以明显改善d-gal处理后huvec的增殖能力。划痕实验和transwell实验显示衰老的huvec的迁移能力受损，但在escs-exos处理后迁移能力明显提高，衰老huvec的成管能力也在escs-exos处理后明显改善。以上结果表明，escs-exos可以改善内皮细胞衰老状态、恢复其血管生成能力。

实施例5

escs-exos通过激活nrf2改善内皮细胞的衰老

参考图7，图8，图9。

增加的氧化应激水平是血管内皮细胞衰老的主要特征。结果显示d-gal处理后huvec中活性氧(ros)水平明显增加，而在escs-exos处理后该效应几乎被消除。同时还检测了mda，sod，cat和gsh-px水平，结果显示，d-gal处理后大大增加了mda水平并降低了抗氧化相关分子sod，cat和gsh的活性，而escs-exos处理后逆转了这些变化。以上结果表明，escs-exos可以通过增强内源性抗氧化系统的活性来减少氧化应激水平。

nrf2是一种转录因子，可调节多种抗氧化基因的表达。最近的研究表明，nrf2在衰老或慢性氧化应激环境下表达减少，而上调nrf2的信号可以改善与衰老相关的功能障碍。因此，观察nrf2是否参与escs-exos对衰老内皮细胞的作用。研究结果表明，衰老过程中总nrf2和核内nrf2蛋白明显减少，ho1(nrf2的下游靶点)的表达也出现下降，而escs-exos处理后可以提高nrf2和ho1的表达。为了进一步检测nrf2上调是否参与escs-exos的治疗作用，在用escs-exos处理衰老huvecs的同时加入nrf2抑制剂(brusatol)。通过westernblot实验我们发现brusatol消除了escs-exos介导的nrf2上调和p16、p21下调的作用。同样的，在同时加入escs-exos和nrf2抑制剂后，衰老huvecs的sa-β-gal表达水平、ros水平并没有得到明显改善。之后又检测了nrf2在escs-exos发挥改善衰老huvec血管生成表型中的作用。escs-exos改善衰老huvec增殖、迁移和成管的能力均在加入brusatol后消失。以上结果表明escs-exos通过激活nrf2改善血管内皮细胞的衰老状态并恢复与衰老相关的血管生成功能障碍。

实施例6

escs-exos通过转移mir-200a下调keap1的表达来激活nrf2

参考图10。

接下来进一步探索了escs-exos在衰老的血管内皮细胞中激活nrf2的机制。先前的研究显示，keap1是nrf2的负性调节蛋白，keap1的下调有助于nrf2激活，keap1的表达随着机体的衰老而逐渐上调。结果显示，长期采用d-gal处理huvec导致keap1的表达增加，而escs-exos减少了衰老huvec中keap1的表达，这些结果表明escs-exos可以通过抑制keap1的表达从而激活nrf2。最近的研究发现外泌体可将其中包裹的mirna转移至受体细胞，在转录后水平调节基因的表达。一些mirna如mir-7、mir-200a、mir-141a、mir-432、mir-29和mir-23a已被证明可以通过靶向keap1的表达来调节nrf2的活性。为了验证keap1是否被escs-exos转移的这些mirna下调，通过定量实时pcr(qrt-pcr)检测了这些mirna的水平。结果发现mir-200a在escs-exos中高度富集。在escs-exos处理后，衰老huvec中mir-200a的水平出现明显上调，这与keap1的下调结果一致。以上结果表明mir-200a可以转移到huvec中从而调节keap1的表达。

为了评估mir-200a在escs-exos发挥抗huvec衰老中的作用，在escs-exos处理衰老huvec的同时加入靶向mir-200a的特异性抑制剂(mir-200aantagomir)。结果显示，在用mir-200a的rna拮抗剂共处理后，escs-exos降低keap1的表达和上调nrf2的作用明显减弱。此外，mir-200aantagomir也阻断了escs-exos对衰老huvec衰老表型的改善作用。这些结果表明，mir-200a是escs-exos发挥抗衰老的关键介质之一，通过下调keap1表达从而激活nrf2。然而，值得注意的是，escs-exos对nrf2激活和huvec衰老的影响并未完全被mir-200aantagomir治疗所消除，这表明可能存在其他机制参与这些过程。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。