一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法与流程

本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法。

背景技术：

肝损伤是由多种病因所致的以短时间内大量肝细胞变性、坏死和炎细胞浸润等为特征的肝功能损伤的临床综合征，死亡率高。而肝细胞坏死是各型肝损伤共同的病理特点，包括：肝细胞坏死(necrosis)、程序性坏死(necroptosis)、凋亡(apoptosis)及自噬(autophagyd)。肝病病情进展，即肝细胞损伤与多种因素有关，在各种致病因素作用下，肝细胞通过启动多种保护机制维持细胞内环境稳定，促进细胞存活。故肝细胞自身的抗损伤能力与损伤因素共同决定肝病的结局。

绝大多数肝损伤患者优先选择的治疗方法为内科综合治疗，然而，由于发病机制尚不清楚，内科治疗效果局限，其死亡率为50～80％。实验动物肝损伤内质网应激差异性表达模型是研究各种肝脏疾病的发病机制及治疗药物筛选中必不可缺的一个工具。近年来国内外制造实验性肝损伤动物模型方法主要集中在化学性肝损伤模型和免疫性肝损伤模型。免疫性肝损伤模型多采用刀豆蛋白a(con)、脂多糖(bcg+lps)等造模；化学性肝损伤模型主要是由四氯化碳(ccl4)、d-氨基半乳糖(d-gal)、乙醇、致黄素等诱导。另外，现有技术中公开了一种新型的造模方法，例如公开号cn103735561a的专利公开了采用衣霉素二甲基亚砜溶液作为内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，给药8～48h后完成动物模型的建立，所述方法虽然能了解细胞在应激状态下的自我调控能力，还能进一步了解肝病发病机制，从而对制定新的干预、治疗措施具有较高的帮助。但是该方法并未给出采用上述给药方法处理的小鼠是否真正形成小鼠肝损伤模型，采用的是测定给药小鼠肝脏中ast和alt的酶活力，测定肝重和肝脏指数以及做病理切片，可见上述方案虽然公开了肝损伤小鼠模型的建立方法，但是其后续验证步骤较复杂，测定内容较大，而且测定结果的判断方法没有给出明确的判断标准，对于没有经验的研究者来说判断困难。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，所述方法不仅操作简便、对操作者要求低，而且建模成功率高。

本发明提供的一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，包括以下步骤：

1)随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的balb/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组给药一次，给药24h后处死小鼠；慢性组每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周后处死小鼠；给药的药物为内质网应激诱导剂；

2)分别提取步骤1)中两组小鼠的肝组织，得到急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织；

3)分别测定所述急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中grp78和chop的表达水平，计算急性组chop/grp78的比值和慢性组chop/grp78的比值；

4)分析急性组chop/grp78比值与慢性组chop/grp78的比值相比变化情况，当慢性组chop/grp78比值显著高于急性组chop/grp78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。

优选的，步骤1)中内质网应激诱导剂为ccl4橄榄油混合溶液；所述ccl4橄榄油混合溶液中ccl4和橄榄油的体积比为1∶3～5。

优选的，所述ccl4橄榄油混合溶液的给药量为5～10ml/kg小鼠。

优选的，步骤3)中急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中grp78和chop的表达水平的测定方法包括采用蛋白质印迹法将grp78或chop形成条带，测定grp78或chop条带的灰度值，以所述chop和grp78的灰度值比值表示急性组chop/grp78表达水平比值和慢性组chop/grp78表达水平的比值。

优选的，步骤1)中balb/c小鼠的体重包括23～27g。

优选的，步骤1)中在急性组或慢性组中每组不低于8只balb/c小鼠。本发明提供了一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，根据给药时间分为急性组肝损伤和慢性组肝损伤，这是现有技术未提及的肝损伤内质网应激差异性表达的实验动物模型，然后检测grp78和chop蛋白的表达为核心评估指标，其中grp78蛋白为促生存标志蛋白，其表达预示肝损伤有所好转，而chop蛋白为凋亡标志蛋白，其表达预示肝损伤加重；同时设定成功建立肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的判断标准为当慢性组chop/grp78比值显著高于急性组chop/grp78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。本发明提供的方法具有检测准确率100％的特点，为建立肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠提供了新思路，同时为研究急性和慢性肝损伤及病情进展的发病机制提供实验工具，为临床肝病的预防、治疗提供理论基础。

同时，本发明提供的建立及检测方法，该具有条件要求低、方法简便、稳定性好、建模成功率高、可重复性好等优点；以westernblot检测grp78与chop的表达水平，具有操作简便、可重复性好的特点。

附图说明

图1为实施例中建立ccl4诱导模型小鼠内质网应激差异性表达的流程图；

图2为实施例中模型组的蛋白质印迹法(westernblot)结果图和统计图；

图3为实施例中模型组中grp78和chop蛋白表达量及chop/grp78值的柱形图。

具体实施方式

本发明提供的一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，包括以下步骤：

1)随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的balb/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组的给药方法为给药次数为一次，给药24h后处死小鼠；慢性组的给药方法为每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周后处死小鼠；给药的药物为内质网应激诱导剂；

2)分别提取步骤1)中两组小鼠的肝组织，得到急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织；

3)分别测定所述急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中grp78和chop的表达水平，计算急性组chop/grp78的比值和慢性组chop/grp78的比值；

4)分析急性组chop/grp78比值与慢性组chop/grp78的比值相比变化情况，当慢性组chop/grp78比值显著高于急性组chop/grp78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。

本发明提供了随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的balb/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组的给药方法为给药次数为一次，给药后24h；慢性组的给药方法为每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周；给药的药物为内质网应激诱导剂。

在本发明中，内质网应激诱导剂优选为ccl4橄榄油混合溶液；所述ccl4橄榄油混合溶液中ccl4和橄榄油的体积比优选为1∶3～5，更优选为1∶4。所述ccl4橄榄油混合溶液优选用0.22微米滤菌器滤菌。所述ccl4橄榄油混合溶液的给药量优选为5～10ml/kg小鼠。

在本发明中，所述给药方法优选包括以下步骤：在小鼠下腹部离腹白线约0.5cm处将注射针刺入皮下，沿皮下向前推进3～5cm，然后使针头与小鼠腹部约成30°刺入腹腔，针头刺入的速度要快，待抵抗感消失瞬间，说明针头已利入腹腔内，进入腹腔后的针头一般不超过1cm，注射时小鼠头呈低位，尾部稍稍提起，使内脏前移，避免注射进脏器。此时注射配制好的ccl4橄榄油混合溶液，给药前禁饮禁食12h。

在本发明中，balb/c小鼠的体重优选包括23～27g。在急性组或慢性组中优选每组不低于8只balb/c小鼠。

注射后，本发明处死2组balb/c小鼠，分别提取两组小鼠肝组织，得到急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织。

在本发明中，所述处死的方法优选为经摘除眼球放尽血液后颈椎脱臼法处死。提取肝组织的方法如下：新鲜肝脏组织块50mg，溶于5ml裂解液，用匀浆器充分碾匀，于4℃条件下12000r/min的转速离心5min，抽取上清液与蛋白上样缓冲液4∶1的体积比混合，沸水煮3～5min，得到肝损伤蛋白。

得到肝损伤蛋白后，本发明分别测定所述急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中grp78和chop的表达水平，计算急性组chop/grp78的比值和慢性组chop/grp78的比值。

在本发明中，采用westernblot法标准流程检测促生存标志蛋白(grp78)及凋亡标志蛋白(chop)的水平。grp78表示肝再生，而chop表示凋亡的情况，两者都是肝脏本身具有的，当肝脏处于内质网应激时，它们的表达会发生变化，提示小鼠肝病进程变好还是变坏。优选用蛋白质印迹法(westernblot)检测grp78和chop的表达水平，测定各组grp78或chop蛋白条带的灰度值，以各组chop和grp78的灰度值比值表示急性组chop/grp78比值和慢性组chop/grp78的比值。

得到急性组chop/grp78比值与慢性组chop/grp78的比值后，本发明分析急性组chop/grp78比值与慢性组chop/grp78的比值相比变化情况，当慢性组chop/grp78比值显著高于急性组chop/grp78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。当慢性组chop/grp78比值显著高于急性组chop/grp78的比值时，提示慢性肝损伤内质网应激促凋亡反应增强，完成肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测。

为了得到准确检测结果，以上实验步骤优选重复3次。从小鼠活动反应可见，急性组小鼠活动、反应如常，食量如常，呼吸平稳，无死亡，而慢性组小鼠表现为活动、反应迟钝，食量变差，出现腹水，甚至死亡；从图2可见注射ccl4橄榄油混合溶液24h，grp78和chop表达升高，注射ccl4橄榄油混合溶液12～16周，grp78表达无明显变化而chop表达显著升高，比较chop/grp78的比值变化，慢性肝损伤组chop/grp78比值明显高于急性肝损伤组(p≤0.05)，提示慢性肝损伤内质网应激促凋亡反应增强，存在促生存信号向促凋亡信号的差异性转换。

下面结合实施例对本发明提供的一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)小鼠选择

从公司购买一批体重为23～27g的balb/c小鼠，分为三组，每组包括24只，24只balb/c小鼠又分成急性组、慢性组和对照组。

(2)ccl4橄榄油混合溶液配制

将1mlccl4充分溶解于4ml橄榄油中，并用0.22微米滤菌器滤菌，室温无菌条件下存放备用。

(3)给药组给药

在给药前12h禁食。急性组的给药方法为注射ccl4橄榄油混合溶液(ccl4和橄榄油体积比为1∶4)一次，给药24h后经摘除眼球放尽血液后颈椎脱臼法处死小鼠；慢性组的给药方法为每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周，给药结束后经摘除眼球放尽血液后颈椎脱臼法处死小鼠；对照组为不给药，经摘除眼球放尽血液后颈椎脱臼法处死小鼠。所述给药的方法如下：在小鼠下腹部离腹白线约0.5cm处将注射针刺入皮下，沿皮下向前推进3～5cm，然后使针头与小鼠腹部约成30°角刺入腹腔，针头刺入的速度要快，待抵抗感消失瞬间，说明针头已利入腹腔内，进入腹腔后的针头一般不超过1cm，注射时小鼠头呈低位，尾部稍稍提起，使内脏前移，避免注射进脏器。

4)标志蛋白的提取剂测定

注射药物24h及12～16周后，经摘除眼球放尽血液后颈椎脱臼法处死上述小鼠取新鲜肝脏组织块50mg，溶于5ml裂解液，用匀浆器充分碾匀，于4℃离心5min(12000r/min)，抽取上清液与蛋白上样缓冲液4∶1的体积比混合，沸水煮至3～5min。按westernblot法标准流程检测促生存标志蛋白(grp78)及凋亡标志蛋白(chop)的水平，其中grp78表示肝再生，而chop表示凋亡的情况，两者都是肝脏本身具有的，当肝脏处于内质网应激时，它们的表达会发生变化，提示小鼠肝病进程变好还是变坏，以β-acatin蛋白为内参。用蛋白质印迹法(westernblot)检测的，通过分析相应蛋白条带灰度值，比较chop/grp78的比值变化。以上实验重复3次。结果见表1。

表1不同时间标志蛋白的表达量

将急性组和慢性组的chop/grp78均值进行统计分析发现，慢性肝损伤组chop/grp78比值明显高于急性肝损伤组(p≤0.05)，提示慢性肝损伤内质网应激促凋亡反应增强，完成肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测。

从小鼠活动反应可见，急性组小鼠活动、反应如常，食量如常，呼吸平稳，无死亡，而慢性组小鼠表现为活动、反应迟钝，食量变差，出现腹水，甚至死亡；从图2可见注射ccl4橄榄油混合溶液24h，grp78和chop表达升高，注射ccl4橄榄油混合溶液12～16周，grp78表达无明显变化而chop表达显著升高，比较chop/grp78的比值变化，慢性肝损伤组chop/grp78比值明显高于急性肝损伤组(p≤0.05)，提示慢性肝损伤内质网应激促凋亡反应增强，存在促生存信号向促凋亡信号的差异性转换。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。