本发明属于药物技术领域，具体涉及一种肉灵芝培养物、含有肉灵芝培养物的组合物及其应用。
背景技术：
肉灵芝又称人工肉灵芝培养液。根据“人工肉灵芝培养液协会”王潮姜教授介绍：肉灵芝，传说是秦始皇苦苦找寻的长生不老之药。李时珍《本草纲目》记载有肉灵芝，并把它收入“菜”部“芝”类，可食用、入药，奉为“本经上品”，功效为“久食，轻身不老，延年神仙”。据《神农本草经》记载：“肉灵芝，无毒、补中、益精气、增智慧，治胸中结，久服轻身不老”。《山海经》称之谓“视肉”、“聚肉”、“人工肉灵芝培养液”、“封”，乃古代帝王养生佳肴。人工肉灵芝培养液十分稀有，是百药中的上品。有典籍记载，人工肉灵芝培养液性平，苦，无毒，具有补脾润肺，补肾益肝等价值。现代科学家认为人工肉灵芝培养液是一种大型粘菌复合体，但其在显微镜下仍观察不到细胞结构。《本草纲目》中记载：“肉芝状如肉。附于大石，头尾具有，乃生物也。赤者如珊瑚，白者如脂肪，黑者如泽漆，青者如翠羽，黄者如紫金，皆光明洞彻如坚冰也”。东晋道家葛洪在《抱朴子》中记载，“诸芝捣末，或化水服，令人轻身长生不老。”是古人认为的长生不老仙药。人工肉灵芝培养液十分稀有，是百药中的上品，有典籍记载，人工肉灵芝培养液性平，苦，无毒，具有补脾润肺，补肾益肝等价值。
肿瘤是一类严重威胁人类健康的重大疾病，化学预防是肿瘤防治的热点，通过化学或生物物质阻止和减缓肿瘤的发展，降低肿瘤的发病率。但这些药物常伴随着一些副作用，在治疗肿瘤的同时也会损害人们的健康。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种肉灵芝培养物、含有肉灵芝培养物的组合物及其应用，能够有效地抑制肿瘤的生长，且对人体无毒副作用。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种肉灵芝培养物，包括如下步骤制备得到：
1)将葡萄、分叉蓼、山梨、苹果、猕猴桃、桃子、李子和樱桃按照等质量的比例混合后依次进行榨汁、过滤，得到混合果汁；
2)将所述步骤1)的混合果汁与白糖、蜂蜜混合，将得到的营养液与野生肉灵芝混合，在10～30℃的密封条件下培养85～95d，得到肉灵芝培养物。
优选的，所述步骤2)中混合果汁、白糖和蜂蜜的质量比为10～20:1:2。
优选的，所述步骤2)中营养液与野生肉灵芝的质量比为90～110:1。
优选的，包括如下重量份的组分：肉灵芝培养物1.8～2.2份、蓝莓果汁0.8～1.2份和长白山中药材水提物0.4～0.6份；
所述长白山中药材水提物，包括如下重量份的原料制备得到：长白山蒲公英2～5份、红景天1～2份、党参1～2份、黄芪1～2份、人参1～2份、银耳1～2份、猴头菇1～2份、北虫草1～2份和蘑菇1～2份。
优选的，所述长白山中药材水提取的制备方法，包括如下步骤：
a.将长白山蒲公英、红景天、党参、黄芪、人参、银耳、猴头菇、北虫草和蘑菇分别干燥和粉碎后进行混合，得到长白山中药材粉；
b.将所述步骤a的长白山中药材粉依次进行煎煮和过滤，得到的滤液为长白山中药材水提物。
优选的，所述步骤a中干燥的温度为40～50℃。
优选的，所述步骤b进行煎煮时，水与长白山中药材粉的质量比为5～10:1；所述煎煮的时间为20～30min。
优选的，所述蓝莓果汁的制备方法包括：将蓝莓与水混合后，依次进行振荡、静置和离心，得到蓝莓果汁。
优选的，所述蓝莓与水的质量比为1:45～55。
本发明提供了一种上述方案所述的含有肉灵芝培养物的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种肉灵芝的培养物、包含灵芝培养物的组合物及其应用。本发明提供的肉灵芝培养物含有多种活性物质，粗多糖类的质量浓度超过10％，核酸、几丁质、维生素、蛋白质、氨基酸、pqq等成分也很丰富，可活化t、b淋巴细胞，提高非特异性免疫细胞巨噬细胞的吞噬能力，也可激活nk细胞对肿瘤细胞的杀伤或溶解细胞作用，分泌il-2等免疫因子。从而可清除癌细胞，抑制肿瘤的生长。实施例结果表明：给药10天后，在荷瘤h22小鼠模型上，阳性药组荷瘤率与模型组相同，肿瘤体积为122.4±14.6mm3，与模型组相比肿瘤体积较小且有显著性差异；肉灵芝培养物组合物高、中剂量组的荷瘤率与模型组、阳性药组相比较低，肿瘤体积分别为72.1±8.3mm3、65.1±7.4mm3，与模型组相比肿瘤体积较小且有显著性差异；肉灵芝培养物组合物低剂量组的荷瘤率与模型组、阳性药组相同，肿瘤体积分别为132.3±15.1mm3，与模型组相比肿瘤体积较小且有显著性差异。试验结果表明：含有肉灵芝培养物的组合物对小鼠h22肿瘤的生长具有抑制作用。
具体实施方式
本发明提供了一种肉灵芝培养物，包括如下步骤制备得到：
1)将葡萄、分叉蓼、山梨、苹果、猕猴桃、桃子、李子和樱桃按照等质量的比例混合后依次进行榨汁、过滤，得到混合果汁；
2)将所述步骤1)的混合果汁与白糖、蜂蜜混合，将得到的营养液与野生肉灵芝混合，在10～30℃，ph值为2～4的密封条件下培养85～95d，得到肉灵芝培养物。
本发明将葡萄、分叉蓼、山梨、苹果、猕猴桃、桃子、李子和樱桃按照等质量的比例混合后依次进行榨汁、过滤，得到混合果汁。在本发明中，所述过滤用网筛的孔径优选为55～65目，更优选为60目。
得到混合果汁后，本发明将所述混合果汁与白糖、蜂蜜混合，将得到的营养液与野生肉灵芝混合，在10～30℃的密封条件下培养85～95d，得到肉灵芝培养物。在本发明中，所述混合果汁、白糖和蜂蜜的质量比优选为10～20:1:2，更优选为15:1:2。在本发明中，所述营养液与野生肉灵芝的质量比优选为90～100:1，更优选为100:1。在本发明中，所述培养的温度为10～30℃，优选为15～25℃，更优选为20℃；所述培养的时间为85～95d，优选为90d。所述培养时的ph值优选为2～4，更优选为3。
在本发明中，所述肉灵芝培养物含有各种营养物质，粗多糖类超过10％，核酸、几丁质、维生素、蛋白质、氨基酸、pqq等成分也很丰富，可活化t、b淋巴细胞，提高非特异性免疫细胞巨噬细胞的吞噬能力，也可激活nk细胞对肿瘤细胞的杀伤或溶解细胞作用，分泌il-2等免疫因子。因此可清除癌细胞，抑制肿瘤的生长。
本发明对所述野生肉灵芝的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用的野生肉灵芝购买自市场。在本发明中，所述葡萄优选为山葡萄，所述蜂蜜优选为长白山椴树蜜。本发明对所述葡萄、分叉蓼、山梨、苹果、猕猴桃、桃子、李子、樱桃、白糖和蜂蜜的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
本发明提供了一种含有上述方案上述的肉灵芝培养物的组合物，包括如下重量份的组分：肉灵芝培养物1.8～2.2份、蓝莓果汁0.8～1.2份和长白山中药材水提物0.4～0.6份。
本发明提供的肉灵芝组合物中包括肉灵芝培养物。按重量份计，包括1.8～2.2份，优选为2份。
本发明提供的肉灵芝组合物中包括蓝莓果汁。按重量份计，包括0.8～1.2份，优选为1份。在本发明中，所述蓝莓果汁的制备方法优选包括：将蓝莓与水混合后，依次进行振荡、静置和离心，得到蓝莓果汁。
在本发明中，所述蓝莓与水的质量比优选为1:45～55，更优选为1:50。在本发明中，所述振荡的频率优选为120～180rpm，更优选为150rpm；所述振荡的时间优选为30min。在本发明中，所述静置的时间优选为0.2～1h，更优选为0.5h；所述静置的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。在本发明中，所述离心的次数优选为2次。第一次离心的转速优选为2500～3500rpm，更优选为3000rpm；第一次离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。第二次离心的转速优选为4500～5500rpm，更优选为5000rpm；第二次离心的时间优选为25～35min，更优选为30min。
在本发明中，所述蓝莓果汁为肉灵芝的生长提供必需的碳源、氮源及生长因子。
本发明提供的肉灵芝组合物中包括长白山中草药水解液。在本发明中，所述长白山中药材水提物，包括如下重量份的原料制备得到：长白山蒲公英2～5份、红景天1～2份、党参1～2份、黄芪1～2份、人参1～2份、银耳1～2份、猴头菇1～2份、北虫草1～2份和蘑菇1～2份，优选为长白山蒲公英4份、红景天1.5份、党参1.5份、黄芪1.5份、人参1.5份、银耳1.5份、猴头菇1.5份、北虫草1.5份和蘑菇1.5份。
在本发明中，所述长白山中药材水提物的制备方法，优选包括如下步骤：
a.将长白山蒲公英、红景天、党参、黄芪、人参、银耳、猴头菇、北虫草和蘑菇分别干燥和粉碎后进行混合，得到长白山中药材粉；
b.将所述步骤a的长白山中药材粉依次进行煎煮和过滤，得到的滤液为长白山中药材水提物。
本发明优选将长白山蒲公英、红景天、党参、黄芪、人参、银耳、猴头菇、北虫草和蘑菇分别干燥和粉碎后进行混合，得到长白山中药材粉。在本发明中，所述干燥的温度优选为40～50℃，更优选为45℃。所述粉碎的粒度优选为55～65目，更优选为60目。
得到长白山中药材粉后，本发明将所述长白山中药材粉依次进行煎煮和过滤，得到的滤液为长白山中药材水提物。在本发明中，所述进行煎煮时，水与长白山中药材粉的质量比优选为5～10:1，更优选为7.5:1。在本发明中，所述煎煮的时间优选为20～30min，更优选为25min。
在本发明中，所述长白山中药材水提物为肉灵芝的生长提供生长必需的营养物质。本发明对制备长白山中药材水提取所用原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
本发明中，肉灵芝提取物中含有粗多糖类超过10％，同时含有核酸、几丁质、维生素、蛋白质、氨基酸、pqq等成分，可通过活化t、b淋巴细胞，提高非特异性免疫细胞巨噬细胞的吞噬能力，也可激活nk细胞对肿瘤细胞的杀伤或溶解细胞作用，分泌il-2等免疫因子。从而可清除癌细胞，抑制肿瘤的生长，从而达到抑制肿瘤的作用。
本发明提供了一种上述方案所述的肉灵芝组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将山葡萄、分叉蓼、山梨、苹果、猕猴桃、桃子、李子和樱桃按照等质量的比例混合后依次进行榨汁后，采用60目筛过滤，得到混合果汁。将得到的混合果汁与白糖、长白山椴树蜜按照10:1:2的质量比混合，得到营养液。将营养液与野生肉灵芝按照110:1的质量比混合，调整ph值至2后，置于国标304食品级白钢桶中密封，在30℃的密封条件下培养85d，采用65目筛过滤，得到肉灵芝培养物。
称量长白山蒲公英5kg、红景天1kg、党参2kg、黄芪1kg、人参2kg、银耳1kg、猴头菇2kg、北虫草1kg和蘑菇2kg，将上述原料在40℃下进行干燥12h后，将得到的干燥物料粉碎至65目，得到长白山中草药粉。将得到的长白山中草药粉与水按照1:5的质量比混合后进行煮沸30min，过滤，得到长白山中草药水解液。
将蓝莓与水按照1:45的质量比混合后，以150rpm的速度振荡30min，将振荡后的蓝莓水混合物在30℃下静置30min后，以2500rpm的转速离心6min后，将上清液以4500rpm的转速离心35min，取上清液为蓝莓果汁。
将上述得到的肉灵芝培养物、蓝莓果汁和长白山中药材水提物按照1.8：1.2：0.4的质量比混合，得到含肉灵芝培养物的组合物。
实施例2
将山葡萄、分叉蓼、山梨、苹果、猕猴桃、桃子、李子和樱桃按照等质量的比例混合后依次进行榨汁后，采用55目筛过滤，得到混合果汁。将得到的混合果汁与白糖、长白山椴树蜜按照20:1:2的质量比混合，得到营养液。将营养液与野生肉灵芝按照90:1的质量比混合，调整ph值至4后，置于国标304食品级白钢桶中密封，在10℃的密封条件下培养95d，采用60目筛过滤，得到肉灵芝培养物。
称量长白山蒲公英2kg、红景天2kg、党参1kg、黄芪2kg、人参1kg、银耳2kg、猴头菇1kg、北虫草2kg和蘑菇1kg，将上述原料在50℃下进行干燥12h后，将得到的干燥物料粉碎至55目，得到长白山中草药粉。将得到的长白山中草药粉与水按照1:10的质量比混合后进行煮沸20min，采用60目筛过滤，得到长白山中草药水解液。
将蓝莓与水按照1:55的质量比混合后，以150rpm的速度振荡30min，将振荡后的蓝莓水混合物在20℃下静置30min后，以3500rpm的转速离心4min后，将上清液以5500rpm的转速离心25min，取上清液为蓝莓果汁。
将上述得到的肉灵芝培养物、蓝莓果汁和长白山中药材水提物按照2.2：0.8：0.6的质量比混合，得到含肉灵芝培养物的组合物。
实施例3
将山葡萄、分叉蓼、山梨、苹果、猕猴桃、桃子、李子和樱桃按照等质量的比例混合后依次进行榨汁后，采用60目筛过滤，得到混合果汁。将得到的混合果汁与白糖、长白山椴树蜜按照15:1:2的质量比混合，得到营养液。将营养液与野生肉灵芝按照100:1的质量比混合，调整ph值至3后，置于国标304食品级白钢桶中密封，在20℃的密封条件下培养90d，采用60目筛过滤，得到肉灵芝培养物。
称量长白山蒲公英4kg、红景天1.5kg、党参1.5kg、黄芪1.5kg、人参1.5kg、银耳1.5kg、猴头菇1.5kg、北虫草1.5kg和蘑菇1.5kg，将上述原料在45℃下进行干燥12h后，将得到的干燥物料粉碎至60目，得到长白山中草药粉。将得到的长白山中草药粉与水按照1:8的质量比混合后进行煮沸25min，采用60目筛过滤，得到长白山中草药水解液。
将蓝莓与水按照1g：50ml的比例混合后，以150rpm的速度振荡30min，将振荡后的蓝莓水混合物在25℃下静置30min后，以3000rpm的转速离心5min后，将上清液以5000rpm的转速离心30min，取上清液为蓝莓果汁。
将上述得到的肉灵芝培养物、蓝莓果汁和长白山中药材水提物按照2：1：0.5的质量比混合，得到含肉灵芝培养物的组合物。
实施例4
含肉灵芝培养物的组合物对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用
实验动物：
(1)复制小鼠肿瘤模型：取h22腹水型小鼠的腹水，冷pbs清洗并离心，获取的肿瘤细胞制备成终浓度为2*104肿瘤细胞混悬液。无菌接种h22肿瘤细胞悬液0.1ml于小鼠右前肢上方(含1*104肿瘤细胞)。
(2)分组及给药：给予待测药物21d。每日观察小鼠活动情况及肿瘤生长情况。试验结束前3日,腹腔注射3％硫代乙醇酸钠溶液3ml。
(2)试验选用km种小鼠，雄性，按上述肿瘤接种方法分别接种肿瘤细胞，肿瘤细胞接种后，动物按体重随机分组。动物分组：每组12只小鼠，共7组；具体分组及给药方案如下：
1)空白组：灌胃纯水0.3ml/10g，一日两次；
2)荷瘤模型组：接种肿瘤细胞，灌胃纯净水0.3ml/10g，一日两次；
3)荷瘤+人工肉灵芝培养物组合物低剂量组：接种肿瘤细胞，灌胃实施例3的肉灵芝培养物组合物0.1ml/10g，一日两次；
4)荷瘤+肉灵芝培养物组合物中剂量组：接种肿瘤细胞，灌胃实施例3的肉灵芝培养物组合物0.2ml/10g，一日两次；
5)荷瘤+肉灵芝培养物组合物高剂量组：接种肿瘤细胞，灌胃实施例3的肉灵芝培养物组合物0.3ml/10g，一日两次；
6)阳性对照药：接种肿瘤细胞，给与阳性药胸腺肽；
7)空白组+肉灵芝培养物组合物高剂量：灌胃实施例3的肉灵芝培养物组合物0.3ml/10g，一日两次。
检测指标：
1、小鼠体重：每3日测定体重一次，描记体重变化曲线。
2、小鼠肿瘤生长容积曲线：每3日测定肿瘤容积，描记肿瘤容积变化曲线。计算公式volume＝0.52×长径×短径2
3、脾脏t，b淋巴细胞转化试验
颈部脱臼处死小鼠，75％酒精浸泡消毒。无菌条件下，取小鼠脾脏。将含有10％胎牛血清的rpmi1640培养液加入平皿中，将脾脏放入平皿中的200目尼龙网上，研磨，制备细胞悬液。加入红细胞裂解液，裂解1min离心(1500r/min，3min)，重复至无肉眼可见红色。透尼龙网吸1.5ml细胞悬液放入ep管，洗涤2～3遍细胞(1500r/min，3min)。稀释50倍，取20～30μl填充细胞计数板，显微镜下进行计数。调整细胞浓度为1×107/ml，取1.5×107个细胞至ep管，加入培养液到1.5ml。取细胞悬液，每孔100μl培养于96孔培养板，每孔分别加cona100μl(终浓度10μg/ml，t细胞刺激液)和lps100μl(终浓度10μg/ml，b细胞刺激液)，每组设3个空白对照孔。37℃，5％co2孵箱内细胞培养48h。加入mtt(5mg/ml)10μl/孔，继续培养4小时。取出，小心吸去上清，加入dmso100μl/孔，振荡5min，溶解甲臢，待颗粒完全溶解。用酶标仪在波长570nm处测定od值，计算t，b淋巴细胞的转化功能。
4、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的检测
1)小鼠腹腔巨噬细胞制备、纯化和培养：
称取硫代乙醇酸钠3g，溶于100ml的0.9％氯化钠注射液中，121℃高压灭菌20min，放4℃冰箱备用。每只小鼠经腹腔注射3％硫代乙醇酸钠溶液3ml，3天后处死，用2mlrpmi1640培养剂冲洗腹腔，收集腹腔细胞，再用pbs洗涤细胞2次，1500r/min离心5min，弃上清，细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640悬浮后，调整细胞浓度至1×106/ml，培养于96孔培养板。
2)巨噬细胞吞噬中性红测定：
每孔加入100μl的0.1％中性红(生理盐水溶解)，37℃，5％co2培养箱中孵育4h后，用pbs清洗3次，巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬细胞在孵育过程中已黏附在板底，而其他非吞噬细胞大部分被冲洗掉。然后每孔加200μl溶解剂(50％冰醋酸，50％乙醇)，30min后，用酶标仪在波长450nm处测定od值，计算巨噬细胞吞噬功能。
5、nk细胞活性测定
制备细胞悬液与t、b淋巴细胞转化实验相同。
将yac-1细胞培养于96孔培养板，每孔100μl。生长良好的yac-1细胞(5×104)作为靶细胞。并设效应细胞、靶细胞对照。震荡混匀，置37℃，5％co2培养箱中孵育48h，加入mtt(5mg/ml)10μl/孔，继续孵育4h。取出后小心弃去上清，然后加dmso100μl/孔，轻轻震荡培养板，使颗粒完全溶解。用酶标仪在波长570nm处测定od值，计算nk细胞活性。计算公式如下：
6、血清il-2，干扰素-γ检测参照试剂盒
7、血清溶血素测定(抗体igg、igm含量测定参照试剂盒)
流式细胞术检测小鼠脾脏t细胞亚群
1.无菌取脾，将脾置200目筛网上研磨，不断用生理盐水冲洗细胞，350g离心2次。
2.加入预冷的红细胞裂解液，4℃裂解1min，350g离心3min，重复裂解直到细胞团肉眼观察无明显红色。
3.加入1ml预冷的pbs洗2次，350g离心3min/次。
4.计数，调节细胞密度至1x107个/ml，体积100ul，加入fc受体阻断剂，冰上孵育10min。
5.pbs洗一次，350g离心3min。
6.避光加入流式荧光标记抗体。
7.冰上避光孵育20min。
8.加入pbs1ml洗2次，350g离心5min/次。
9.吸尽残余液体，加入200～300ul4％多聚甲醛固定。
10.流式检测
bd_accuri_c6流式细胞仪检测小鼠脾脏t细胞亚群
1.设组：1)阴性对照组2)cd3单标组3)cd4单标祖4)cd8单标组5)实验各组。
2.将各组样品经200目尼龙筛网过滤后上机检测，防止堵塞细胞仪。
3.clean液冲洗流式通道1～2次，蒸馏水冲洗2次后进样检测。检测顺序：阴性对照组、单标各组、实验各组。
4.检测完毕后clean液冲洗流式通道1～2次，蒸馏水冲洗2次，登记。
实验结果(接种肿瘤，给药第10日结果)
表1肉灵芝培养物组合物对荷瘤h22小鼠模型肿瘤生长的抑制作用
注：给药组与模型组比较*p<0.05；给药组与阳性药组比较▲p＜0.05
由表1可以看出，给药10天后，在荷瘤h22小鼠模型上，阳性药组荷瘤率与模型组相同，肿瘤体积为122.4±14.6mm3，与模型组相比肿瘤体积较小且有显著性差异；肉灵芝培养物组合物高、中剂量组的荷瘤率与模型组、阳性药组相比较低，肿瘤体积分别为72.1±8.3mm3、65.1±7.4mm3，与模型组相比肿瘤体积较小且有显著性差异；肉灵芝培养物组合物低剂量组的荷瘤率与模型组、阳性药组相同，肿瘤体积分别为132.3±15.1mm3，与模型组相比肿瘤体积较小且有显著性差异。试验结果表明：肉灵芝培养物组合物对小鼠h22肿瘤的生长具有抑制作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。