三叶青黄酮的抗衰老延寿的用途的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及一种三叶青黄酮，主要成分为芦丁、异槲皮素、山奈酚-3-o-芸香糖苷、紫云英苷，在制备抗衰老延寿保健食品和药物中的应用。

背景技术：

衰老是绝大多数生物随年龄增加而缓慢出现、普遍发生、不可逆的衰退过程，是个体走向自然死亡的必然步骤，是老年病发生的共同危险因素。衰老过程中伴随而来的疾病，如高血压、2型糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆等，导致老年人的生活质量降低，这些疾病的产生甚至直接加速衰老。按照世界卫生组织的标准，当一个国家或地区60岁以上的老人超过总人口数的10％，或者65岁以上的老人占总人口数超过7％时，称为“老龄化国家”，当65岁以上的老龄人口超过14％时，称为“老龄国家”。我国的老年人口增长速度远远超过发达国家，属于老龄化速度最快的国家之一。2020-2050年为我国人口老龄化最快的阶段，预计老年人的比重将从15.6％上升到25.8％。据联合国调查预测，到21世纪中叶，全球60岁以上的老龄人口总数将达到20亿，将占世界总人口的22％。如何延缓衰老及提高衰老过程中生活质量尤为重要并已引发全世界学者的关注。

衰老相关机制的研究，一直是相关领域学者关注的重点，有关衰老学说有很多，如自由基学说、线粒体dna损伤学说、端粒学说、染色体突变学说、免疫学说、内分泌学说、细胞凋亡学说等等，总结概括来说主要是内源性衰老和外源性衰老。当前最普遍的抗衰老的方法是使用抗衰老的药物，合成药物是用化学或生物方法制成的具有预防、治疗和诊断效果的物质，广泛应用于临床。目前临床上使用的延缓衰老药大多是合成药物，如维生素e可促进细胞分裂及抑制氧自由基生成、普鲁卡因制剂能延长细胞寿命、酰胺吡酮可延缓脑衰老等。而阿司匹林通过对抗氧化应激，延缓年龄相关的机体功能下降，从而延长线虫寿命；二甲双胍作为腺苷酸活化蛋白激酶(ampk)激活剂，也可改善认知障碍，对延缓衰老也有一定的作用。虽然这些药物都在一定程度上存在延寿抗衰老的作用，但合成药物会存在一定副作用。发掘安全有效的抗衰老延寿药物具有重大意义。

近年来，从天然产物中提纯得到各种活性成分由于效果好，无毒副作用，且避免消费者讳疾忌医心理等优点越来越受到人们关注。同样对抗衰老问题，越来越多的学者感兴趣于具有抗衰老延寿作用的天然产物的开发与研究，以期望找到安全有效的食源性的天然抗衰老延寿功能因子。三叶青属于葡萄科崖爬藤属，是中国特有的珍稀药用植物，主要分布于我国的南部地区。作为一种民间流行的中草药，其具有祛风化痰、清热解毒、活血止痛等多种活性。目前国内外关于三叶青活性物质的功效的研究多集中于抗肿瘤、抗氧化及调节免疫方面，而其抗衰老延寿的效果和调控机制未见报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供三叶青黄酮的抗衰老延寿的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种三叶青黄酮在制备抗衰老延寿保健食品、药物中的应用。

三叶青黄酮(rtf)的主要成分为以下四种：芦丁、异槲皮素、山奈酚-3-o-芸香糖苷、紫云英苷。

三叶青黄酮能够延缓正常秀丽线虫以及百草枯诱导的秀丽线虫；也可以显著减少秀丽线虫的脂褐素积累，其作用靶点很可能是通过daf-16/foxo；此外，三叶青黄酮的干预使秀丽线虫体内的丙二醛(mda)显著下降，sod酶活上升。因此，三叶青黄酮(rtf)可在制备抗衰老延寿保健食品和药物中的应用。

本发明采用秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans,c.elegans)进行实验，通过加入提取的三叶青黄酮(rtf)与正常秀丽线虫，通过加入百草枯诱导和同时加入百草枯(pq)和三叶青黄酮(rtf)混合干预的两种模型，探究三叶青黄酮(rtf)对秀丽线虫寿命的影响。同时利用这两种模型，通过加入不同药物(百草枯或三叶青黄酮)干预4d后测定秀丽线虫体内脂褐素荧光变化，并通过裂解研磨线虫破碎后测定其体内mda含量和sod酶活性。借助不同的秀丽线虫突变株初探其机理，具体发明内容如下：

(1)提取的三叶青黄酮(rtf)为天然功能因子；

(2)三叶青黄酮(rtf)对正常秀丽线虫寿命的作用：将同期化后的线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基或加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养，将平板置于20℃培养，此时记录寿命试验d0天，每天观察线虫，记录生存、死亡和剔除(爬离培养基干死；袋样虫导致死亡；钻进琼脂中)的线虫数目，每隔7天将活着的线虫挑到新的普通培养及或含有相应浓度三叶青黄酮的培养基中。直到最后一条线虫死亡，得到秀丽线虫的寿命曲线，通过平均寿命评价三叶青黄酮(rtf)对秀丽线虫的延寿作用。

(3)三叶青黄酮(rtf)对百草枯诱导短寿秀丽线虫寿命的作用：百草枯的加入可以显著缩短秀丽线虫的寿命，将同期化后的线虫培养到l4期，转到加入百草枯(300μg/ml)或加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的ngm培养基上培养，将平板置于20℃培养，此时记录寿命试验d0天，每天观察线虫，记录生存、死亡和剔除(爬离培养基干死；袋样虫导致死亡；钻进琼脂中)的线虫数目，每隔7天将活着的线虫挑到新的含有相应浓度百草枯(pq)或三叶青黄酮(rtf)的培养基中。直到最后一条线虫死亡，得到秀丽线虫的寿命曲线，通过平均寿命评价三叶青黄酮(rtf)对秀丽线虫的延寿作用。

(4)三叶青黄酮(rtf)对正常秀丽线虫脂褐素积累的作用：将同期化后的线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基或加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养4d，秀丽线虫体内的肠道自发荧光由组织衰老诱发的脂褐质积累产生，将线虫转移到2％琼脂平面上，用5mm左旋咪唑麻醉，盖上盖坡片，荧光显微镜下观察其脂褐素的积累。

(5)三叶青黄酮(rtf)对百草枯诱导短寿秀丽线虫脂褐素积累的作用：将同期化后的线虫培养到l4期，转到加入百草枯(300μg/ml)三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养4d，秀丽线虫体内的肠道自发荧光由组织衰老诱发的脂褐质积累产生，将线虫转移到2％琼脂平面上，用5mm左旋咪唑麻醉，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察其脂褐素的积累。

(6)三叶青黄酮(rtf)对秀丽线虫体内丙二醛(mda)及sod酶活影响的作用：将同期化后的线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基、加入百草枯(0.3mg/ml)、加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养4d，破碎线虫并用试剂盒测定其体内mda含量及sod酶活，通过bca进行蛋白定量。

(7)三叶青黄酮(rtf)对长寿daf-2及短寿daf-16秀丽线虫的作用：将同期化后的daf-2(e1370)或cf1038[daf-16(mu86)i]突变株线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养，并用(2)(3)的方法记录秀丽线虫的寿命，用(4)(5)的方法测定突变株线虫体内的脂褐素积累。

本发明结合实验室前期工作的进展结果和大量的文献调研，利用秀丽隐杆线虫模型，探究了三叶青的抗衰老延寿效果，且其通过下调氧化应激反应水平来实现抗衰老和延寿作用。

本发明同现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.三叶青黄酮(rtf)为天然功能因子。

2.本发明表明，当三叶青黄酮(rtf)浓度为50μg/ml时，可以显著延长正常秀丽线虫及百草枯诱导的短寿秀丽线虫的寿命。

3.本发明表明，当三叶青黄酮(rtf)浓度为50μg/ml时，可以显著减少正常秀丽线虫及百草枯诱导的短寿秀丽线虫体内脂褐素的积累。

4.本发明表明，当三叶青黄酮(rtf)浓度为50μg/ml时，可以减少百草枯诱导的短寿秀丽线虫体内的mda含量，并且提高百草枯诱导短寿线虫体内sod酶活。

5.本发明表明，当三叶青黄酮(rtf)浓度为50μg/ml时为表现出对cf1038[daf-16(mu86)i]突变株线虫的抗衰老延寿作用，推测三叶青黄酮(rtf)的延寿作用或是通过daf-16/foxo这个靶点实现的。

三叶青黄酮(rtf)当用于抗衰老延寿保健食品、药物时，用法和用量为：口服，2.5±0.5mg/天/人。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为三叶青黄酮(rtf)的高效液相色谱图。

图2为三叶青黄酮(rtf)干预下正常野生株秀丽线虫的寿命对比曲线。

图3为三叶青黄酮(rtf)干预下百草枯诱导的短寿野生株秀丽线虫的寿命曲线。

图4为三叶青黄酮(rtf)干预4d后野生株秀丽线虫的脂褐素荧光强度定量图。

图5为三叶青黄酮(rtf)干预4d后秀丽线虫体内丙二醛(mda)的影响图。

图6为三叶青黄酮(rtf)干预4d后秀丽线虫体内sod酶活的影响图；

图7为三叶青黄酮(rtf)干预下突变株cf1038[daf-16(mu86)i]的寿命曲线；

a为control、rtf；b为pq、pq+rtf。

图8为三叶青黄酮(rtf)干预下突变株cf1038[daf-16(mu86)i]的脂褐素积累。

图9(a)为正常环境下三叶青黄酮(rtf)干预下突变株daf-2(e1370)的寿命曲线；

图9(b)为百草枯环境下三叶青黄酮(rtf)干预下突变株daf-2(e1370)的寿命曲线。

图10为百草枯环境下为三叶青黄酮(rtf)干预下突变株daf-2(e1370)的脂褐素积累。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

用三叶青黄酮(rtf)进行关于对秀丽线虫寿命、脂褐素和相关酶活的实验研究，说明其在在制备抗衰老延寿保健食品和药物中应用。下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。

实施例1、三叶青黄酮的提取，

将三叶青块茎洗净晾干后(含水率约为10～15％)，用粉碎机将三叶青打成粉末(过100目的筛)，取100g三叶青粉末用1000ml的80％(体积％)乙醇浸泡，45℃下超声提取(超声频率为20000hz，提取时间为90分钟)，4000rpm/10min离心后，收集上清液。以离心所得的滤渣替代上述三叶青粉末重复上述乙醇浸泡、超声提取、离心，重复2次(即，共超声提取3次)，合并3次离心所得的上清液于-0.1mpa，45℃水浴旋转蒸发至浆状(约为蒸发前原体积的10％)，得提取液。

将提取液10000rpm/15min离心，除去沉淀，离心所得液为三叶青黄酮粗提物。

依次用hpd826大孔树脂和ab-8大孔树脂纯化三叶青黄酮粗提物，使用上海沪西hl-2d蠕动泵，以20转/分转速将三叶青粗提物泵入纯化柱；进样完毕后，用60转/分的转速，以两倍柱体积的纯水过柱洗涤，后用一倍柱体积5％乙醇溶液过柱洗涤；用30转/分的转速，以80％乙醇溶液过柱并收集洗脱液，所得洗脱液即为所需三叶青黄酮提取液。最后将三叶青黄酮提取液在-80℃环境下预冻1天后，-80℃、10pa条件下冻干至恒重。

所得的三叶青黄酮冻干粉用高效液相进行成分测定，流动相是乙腈(a)和0.1％甲酸水溶液(b)。b相的梯度为0-1分钟，95％；1-21分钟，95-85％；21-46分钟，85-75％；46-56分钟，75-95％；和56-60分钟，95％。流速为0.8ml/min，进样量为5μl。

根据图1所示，三叶青黄酮的四个主峰分别为芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷。

实验1：三叶青黄酮对正常野生株秀丽线虫寿命的影响

向ngm培养基中加入三叶青黄酮，使其终浓度达到50μg/ml，并加入fudr(浓度终浓度为50μg/ml)抑制线虫产卵，60℃以下趁热倒板，凝固后在培养板中央加入200μle.coliop50，吹干后立即使用。将同期化后的野生株n2线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基或加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养，将平板置于20℃培养，此时记录寿命试验d0天，每天观察线虫，记录生存、死亡和剔除(爬离培养基干死；袋样虫导致死亡；钻进琼脂中)的线虫数目，每隔7天将活着的线虫挑到新的普通培养及或含有相应浓度三叶青黄酮的培养基中。直到最后一条线虫死亡，得到秀丽线虫的寿命曲线。

根据图2所示，比较三叶青黄酮(rtf)干预的线虫和正常组线虫的寿命，正常组的线虫和加药组线虫的平均寿命(生存率降低到50％的天数)分别为21.14±0.84dvs24.23±0.42d，三叶青黄酮(rtf)的加入显著延长了线虫的平均寿命(p<0.01)，这表明50μg/ml三叶青黄酮(rtf)可以延长秀丽线虫的寿命。

实验2：三叶青黄酮对百草枯诱导短寿野生株秀丽线虫寿命的影响

向ngm培养基中加入百草枯，使其终浓度达到300μg/ml；或向培养基中同时加入百草枯和三叶青黄酮，使百草枯终浓度达到300μg/ml，三叶青黄酮终浓度达到50μg/ml，并加入fudr(终浓度为50μg/ml)抑制线虫产卵，趁热倒板，凝固后在培养板中央加入200μle.coliop50，吹干后立即使用。将同期化后的野生株n2线虫培养到l4期，转到两种不同培养基上培养，将平板置于20℃培养，此时记录寿命试验d0天，每天观察线虫，记录生存、死亡和剔除(爬离培养基干死；袋样虫导致死亡；钻进琼脂中)的线虫数目，每隔7天将活着的线虫挑到新的普通培养及或含有相应浓度三叶青黄酮的培养基中。直到最后一条线虫死亡，得到秀丽线虫的寿命曲线。

根据图3所示，比较百草枯干预组的线虫和同时加入百草枯和三叶青黄酮(rtf)干预的线虫的寿命。结果显示，百草枯(pq)的加入使秀丽线虫的寿命显著缩短，平均寿命仅6.43±0.42d。通过三叶青黄酮的干预(pq+rtf)，线虫的平均寿命提高到8.64±0.61d，三叶青黄酮(rtf)的加入显著延长了百草枯诱导的短寿线虫的平均寿命(p<0.0001)，这表明50μg/ml三叶青黄酮(rtf)可以延长百草枯诱导短寿秀丽线虫的寿命。

实验3：三叶青黄酮对野生株秀丽线虫脂褐素积累的影响

脂褐素又称老年素，是溶酶体作用后剩下不再能被消化的物质而形成的残余体，随着年龄的增长，脂褐素会逐渐积累，是衰老的重要指征之一，在紫外光激发下，可自发显示蓝色荧光。将同期化后的野生株n2线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养4d，秀丽线虫体内的肠道自发荧光由组织衰老诱发的脂褐质积累产生，将线虫转移到2％琼脂平面上，用5mm左旋咪唑麻醉，盖上盖坡片，用uv激发光，观察其脂褐素的积累。通过image-pro6.0进行荧光定量及图片的反转。

根据图4可知，正常条件下，秀丽线虫体内的脂褐素荧光强度较暗，但与之相比，百草枯的加入，使秀丽线虫体内的脂褐素积累显著上升，单独加入三叶青黄酮，不会改变秀丽线虫体内脂褐素的积累，但是在百草枯存在的情况下，三叶青黄酮的加入使线虫体内的脂褐素积累有一定程度的降低。这说明三叶青黄酮可以显著减少百草枯诱导的短寿秀丽线虫体内的脂褐素积累。

实验4：三叶青黄酮对正常及百草枯诱导短寿野生株秀丽线虫体内mda含量

将同期化后的野生株n2线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf)50μg/ml、100μg/ml的培养基上培养4d，破碎线虫并用试剂盒测定其体内mda含量，通过bca进行蛋白定量。用m9缓冲液将线虫冲洗下来，在4℃，2000rpm/min离心5min，去除上清液，再用m9缓冲液冲洗3遍，去除其身体上粘附的op50细菌。加入m9缓冲液1ml左右，液体转移到研磨器当中，充分研磨，整个过程冰浴中进行。在4℃，12000rpm/min离心10min得到组织匀浆的上清液，取上清液立即进行蛋白浓度测定和酶活分析。

根据图5可知，百草枯的加入使秀丽线虫体内mda含量显著上升，说明细胞脂质过氧化反应增强，产生细胞毒性，是缩短线虫寿命的重要原因。不同浓度三叶青黄酮(rtf)的加入使线虫体内的mda含量降低，说明三叶青黄酮可以显著降低由百草枯诱导的线虫体内丙二醛含量，缓解百草枯的毒性，一定程度上缓解线虫的衰老。

实验5：三叶青黄酮对正常及百草枯诱导短寿野生株秀丽线虫体内sod酶活的影响

将同期化后的野生株n2线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf)50μg/ml、100μg/ml的培养基上培养4d，破碎线虫并用试剂盒测定其体内sod酶活，通过bca进行蛋白定量。用m9缓冲液将线虫冲洗下来，在4℃，2000rpm/min离心5min，去除上清液，再用m9缓冲液冲洗3遍，去除其身体上粘附的op50细菌。加入m9缓冲液1ml左右，液体转移到研磨器当中，充分研磨，整个过程冰浴中进行。在4℃，12000rpm/min离心10min得到组织匀浆的上清液，取上清液立即进行蛋白浓度测定和酶活分析。

根据图6可知，百草枯的加入使秀丽线虫线虫体内sod酶的活性增强，这是线虫的一种自我保护机制，通过提高酶活来清除体内过多的自由基，三叶青黄酮(rtf)的加入帮助线虫应对百草枯造成的毒性，体内sod酶活性降低，这说明三叶青黄酮可以缓解线虫在有害条件下的应激状态，帮助恢复到正常水平。

实验6：三叶青黄酮对突变株cf1038[daf-16(mu86)i]的寿命影响

准备正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基，向ngm培养基中加入药物(百草枯或三叶青黄酮)，使其终浓度达到要求，并加入fudr(终浓度为50μg/ml)抑制线虫产卵，趁热倒板，凝固后在培养板中央加入200μle.coliop50，吹干后立即使用。将同期化后的突变株cf1038[daf-16(mu86)i]线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基或加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养，将平板置于20℃培养，此时记录寿命试验d0天，每天观察线虫，记录生存、死亡和剔除(爬离培养基干死；袋样虫导致死亡；钻进琼脂中)的线虫数目，每隔7天将活着的线虫挑到新的普通培养及或含有相应浓度三叶青黄酮的培养基中。直到最后一条线虫死亡，得到秀丽线虫的寿命曲线。

胰岛素/igf-1信号(iis)通路是一条进化上保守的内分泌通路，能够调节各种生物的寿命并让生物在受迫的条件下存活，而daf-2和daf-16是该信号通路中的两个关键基因。daf-16是foxo转录因子同系物，可以增强线虫应对外界不良刺激的能力。通过敲除线虫体内的daf-16，初探该基因在三叶青黄酮(rtf)对线虫抗衰老延寿过程中的作用位点。

根据图7可知，正常组线虫的平均寿命为13.95±1.07d，三叶青黄酮(rtf)干预的线虫的平均寿命为14.94±4.11d，而百草枯(pq)的加入使秀丽线虫的寿命显著缩短，平均寿命仅7.58±1.03d。通过三叶青黄酮的干预(pq+rtf)，线虫的平均寿命为7.42±1.08d，三叶青黄酮(rtf)的加入不能显著延长了百草枯诱导的短寿线虫的平均寿命，这表明daf-16或许是三叶青作用的关键靶点。

实验7：三叶青黄酮对突变株cf1038[daf-16(mu86)i]的脂褐素积累影响

将同期化后的cf1038[daf-16(mu86)i]线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养4d，秀丽线虫体内的肠道自发荧光由组织衰老诱发的脂褐质积累产生，将线虫转移到2％琼脂平面上，用5mm左旋咪唑麻醉，盖上盖坡片，用uv激发光，观察其脂褐素的积累，使用image-pro6.0进行荧光定量及图片的反转。

由图8可知，正常条件下，秀丽线虫体内的脂褐素荧光强度较暗，百草枯的加入，使秀丽线虫体内的脂褐素积累有一定程度的上升，单独加入三叶青黄酮，不会改变秀丽线虫体内脂褐素的积累。同样，在百草枯存在的情况下，三叶青黄酮的加入也并未使使线虫体内的脂褐素积累降低。这可以进一步说明三叶青黄酮对线虫的保护作用可能是通过daf-16实现的。

实验8：三叶青黄酮对突变株daf-2(e1370)的寿命影响

准备正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基，并加入fudr(终浓度为50μg/ml)抑制线虫产卵，趁热倒板，凝固后在培养板中央加入200μle.coliop50，吹干后立即使用。将同期化后的突变株daf-2(e1370)线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基或加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养，将平板置于20℃培养，此时记录寿命试验d0天，每天观察线虫，记录生存、死亡和剔除(爬离培养基干死；袋样虫导致死亡；钻进琼脂中)的线虫数目，每隔7天将活着的线虫挑到新的普通培养及或含有相应浓度三叶青黄酮的培养基中。直到最后一条线虫死亡，得到秀丽线虫的寿命曲线。

daf-2活力的下降可以延长线虫的寿命达一倍，而daf-2功能的丧失则会导致线虫进入dauer期。激活的daf-2会和ins-7和age-1/pi3k/akt相互作用，削弱daf-16的转录活性。daf-16的激活，会促进dauer期的形成，延长寿命，增强线虫对外界刺激的抵抗能力。

由图9可知，正常组线虫的平均寿命为22.18±3.55d，三叶青黄酮(rtf)干预的线虫的平均寿命为22.35±2.64d，而百草枯(pq)的加入使秀丽线虫的寿命显著缩短，平均寿命仅9.53±1.37d。通过三叶青黄酮的干预(pq+rtf)，线虫的平均寿命有一定程度提高，说明三叶青黄酮(rtf)的加入不能延长正常突变株daf-2(e1370)线虫的平均寿命，但可以延长百草枯环境下daf-2(e1370)线虫的寿命。

实验9：三叶青黄酮对突变株daf-2(e1370)的脂褐素积累影响

将同期化后的daf-2(e1370)线虫培养到l4期，转到正常ngm培养基、加入百草枯(300μg/ml)、加入三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)或同时加入百草枯(300μg/ml)和三叶青黄酮(rtf,50μg/ml)的培养基上培养4d，秀丽线虫体内的肠道自发荧光由组织衰老诱发的脂褐质积累产生，将线虫转移到2％琼脂平面上，用5mm左旋咪唑麻醉，盖上盖坡片，用uv激发光，观察其脂褐素的积累，使用image-pro6.0进行荧光定量及图片的反转。

由图10可知，正常条件下，秀丽线虫体内的脂褐素荧光强度较暗，百草枯的加入并未使daf-2(e1370)线虫体内的脂褐素荧光亮度增强，单独加入三叶青黄酮，不会改变秀丽线虫体内脂褐素的积累，但在百草枯环境下，加入三叶青黄酮可以降低线虫体内的脂褐素的积累。说明三叶青作用的上游位点不是，或者说不全是通过daf-2实现的。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。