肿瘤细胞源微颗粒载药制剂及其制备方法与流程

本发明实施例涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种肿瘤细胞来源的微颗粒载药制剂及其制备方法。

背景技术：

近年来，癌症对于人类健康的威胁越来越受到研究者的重视。伴随科学技术的发展，人类对于癌症的治疗手段也愈加多样化。但是癌症的治疗效果却依旧难以尽如人意。因此，不断推动发展新的有效的癌症治疗方式是广大相关研究者的历史使命。

细胞来源微颗粒是细胞因受外源或内源刺激分泌的一种磷脂双分子层囊泡。一般认为微颗粒的大小介于100-1000nm之间，其主要由蛋白质、磷脂、dna和rna等组成。微颗粒参与细胞间生物活性分子传递的特性，使其在癌症治疗中作为一种有效的药物运载工具成为可能。相较于传统人工构建的载药系统，细胞来源的微颗粒载药系统具有极低的免疫原性、优良的体内循环稳定性、能够克服生理屏障以及易于被肿瘤细胞摄取等优点。其在癌症的化学治疗、免疫治疗以及基因治疗上已取得良好的治疗效果。

纳米载药颗粒由于其独特的纳米结构和物理化学性质在癌症治疗中有着广泛的应用，特别是基于无机纳米颗粒的综合治疗及诊疗一体化研究相较于单一的治疗模式能够有效解决癌症多成因的治疗困境。例如，光热治疗不仅可以利用细胞对过高热的敏感性来杀伤细胞，并且可以增敏化疗及抑制其多药耐药性。

因此，整合细胞来源微颗粒与功能性无机纳米颗粒，将为癌症治疗提供一种新的有效策略。截至目前，最新的研究发现，通过基因调控或膜磷脂代谢对供体细胞膜进行修饰，得到的微颗粒进一步通过受-配体结合或化学键合将纳米颗粒连接至微颗粒表面，能够将细胞来源微颗粒与功能性无机纳米颗粒整合在一起制备得到多功能性微颗粒载药制剂。然而此种整合方式将不可避免的改变微颗粒的表面结构，从而影响其固有的体内行为，降低微颗粒本身固有的载药功效，且整合构建方式复杂、费用高、效率低，进一步限制了其在治疗肿瘤中的应用。

技术实现要素：

本发明实施例提供一种肿瘤细胞来源的微颗粒载药制剂及其制备方法，用以解决现有技术中细胞来源微颗粒与功能性纳米颗粒通过受-配体结合或化学键合的结合方式会改变微颗粒的表面结构从而影响其固有的体内行为的问题。

本发明实施例提供一种肿瘤细胞来源的微颗粒载药制剂的制备方法，该方法包括：利用电穿孔技术将光热纳米颗粒和化疗药物通过微孔递送至所述肿瘤细胞内；经紫外光或化疗药物处理使所述肿瘤细胞凋亡，释放包裹所述光热纳米颗粒和化疗药物的载药微颗粒，从而制得所述微颗粒载药制剂。

化疗在肿瘤治疗方面靶向性差，毒副作用大，治疗效率低；而光热治疗法利用近红外光直接照射肿瘤部位，并通过光热试剂将光能转化成热能，从而有效地杀死肿瘤细胞而不引起系统毒性。而纳米颗粒更有利于在肿瘤部位富集、穿过肿瘤血管并渗透肿瘤深部、更有效地被普通肿瘤细胞摄取杀伤。因此，光热-化疗联合治疗是目前一种高效、毒副作用低的较先进的肿瘤临床治疗技术。

细胞来源微颗粒是一种有效的药物载体，其在肿瘤治疗中体现出极低的免疫原性、优良的体内循环稳定性、能够克服生理屏障以及易于被肿瘤细胞摄取等优点。在光热-化疗联合治疗技术中，利用细胞来源微颗粒作为光热纳米颗粒和化疗药物的载体，能够显著地提高联合治疗效果。然而，如何整合细胞来源微颗粒以及光热纳米颗粒和化疗药物并充分发挥其协同治疗效果则是一个难题。

针对于此，本发明首先利用电脉冲对肿瘤细胞进行电穿孔，在电脉冲的作用下，肿瘤细胞膜磷脂双分子层上会形成瞬时微孔，使细胞膜的通透性和膜电导瞬时增大，光热纳米颗粒和化疗药物通过微孔进入肿瘤细胞内，再通过紫外光或化疗药物等诱导肿瘤细胞凋亡释放微颗粒，此时光热纳米颗粒和化疗药物被包裹在微颗粒内，实现细胞来源微颗粒以及光热纳米颗粒和化疗药物的整合，形成微颗粒载药制剂。

本发明采用电穿孔技术克服了细胞对于光热纳米颗粒有限摄取的限制，使光热纳米颗粒和化疗药物较容易地进入肿瘤细胞中，从而实现与微颗粒的整合，其次先递送药物再释放微颗粒的整合方式，不会改变微颗粒结构，不影响微颗粒本身固有的体内行为，能够充分发挥微颗粒与光热纳米颗粒和化疗药物的协同治疗疗效，同时，肿瘤细胞内含有光热纳米颗粒，通过紫外光或红外光照射即可诱导细胞凋亡，整个整合构建方式简单、效率高、费用低，能够在肿瘤治疗中广泛地推广应用。

优选地，所述电脉冲进行电穿孔的条件为：电压100-500v，电容100-300μf，更优选电击次数1-6次。亲水分子、dna、蛋白质、大分子颗粒等正常情况下不能通过细胞膜，肿瘤细胞对于光热纳米颗粒的摄取存在限制，通过电穿孔技术使肿瘤细胞产生瞬时微孔而使光热纳米颗粒能够进入细胞内与微颗粒进行整合，而在此优化条件下，肿瘤细胞膜上形成的微孔孔径介于20-200nm之间，可供大量的光热纳米颗粒和化疗药物进行细胞内，极大地提高了肿瘤细胞内光热纳米颗粒、化疗药物的含量，从而提高了微颗粒的负载量，与传统制备方法相比，微颗粒中光热纳米颗粒、化疗药物的负载量提高了2-4倍。同时，在此优化条件下还可避免对肿瘤细胞造成不可恢复的损伤。

优选地，所述肿瘤细胞的悬液的浓度为1-4×10⁶个/ml，所述光热纳米颗粒的浓度为0.2-0.8mg/ml，所述化疗药物的浓度为0.05-0.2mg/ml。肿瘤细胞的浓度越高，微颗粒释放量越多，光热纳米颗粒和化疗药物的浓度越高，进入肿瘤细胞中的含量越高，微颗粒负载能力越大，然而负载能力会存在一定的限度，故浓度也不宜过高，本发明优选的浓度即为最适宜的浓度范围，能够使微颗粒的负载量达到最大的饱和度。

优选地，在所述肿瘤细胞进行电穿孔之前，还包括：将所述肿瘤细胞的悬液置于细胞培养基中，加入所述光热纳米颗粒和所述化疗药物后，于0-8℃下孵育10-30min。优选的温度及时间能够保证肿瘤细胞更好的固化，同时光热纳米颗粒、化疗药物能均匀地分散在肿瘤细胞周围，便于在电穿孔过程中迅速地进入肿瘤细胞内，提高整合效率。

优选地，将所述光热纳米颗粒和化疗药物递送至所述肿瘤细胞内之后制得的细胞悬混液于37℃下孵育0.5-3h。优选的温度及时间下能够保证肿瘤细胞更好的固化形成合适的机械力。

优选地，在所述肿瘤细胞凋亡释放载药微颗粒后，于4-6℃低温下、以200-20000g的离心力离心收集所述载药微颗粒。在此优选的离心条件下可以将肿瘤细胞分泌的粒径在200-600nm的微颗粒更有效的富集。

优选地，所述光热纳米颗粒包括硒化铋纳米点、硫化铋纳米点、金纳米粒或铂纳米点中的一种或多种。

良好的光热剂需要满足安全无毒、稳定及高光热转换效率，尤其是能将组织穿透性强的近红外光进行热转化。本发明优选的光热纳米颗粒则是一种近红外纳米材料的无机光热试剂，在低能量的近红外光照射下产生高光热转换效率，达到光热治疗的效果。由于光热治疗会诱导细胞产生热休克蛋白，增加其热耐受性，降低热疗效果，因此通过其与化疗药物联用可以取得更好的治疗效果。

优选地，所述化疗药物包括治疗肝癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤癌卵巢癌、急性白血病、子宫颈癌、膀胱癌或绒毛膜上皮癌的化疗药物中的一种或多种。

优选地，所述肿瘤细胞源自于肝癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤癌卵巢癌、急性白血病、子宫颈癌、膀胱癌或绒毛膜上皮癌中的肿瘤细胞。

化疗药物的最高量取决于所使用的化疗药物在微颗粒中的最大饱和度，故在最高范围内可以得到不同规格的药剂。用于包裹化疗药物的微颗粒可以是与所要治疗的肿瘤细胞不同种来源，也可以是同种来源，优选与所要治疗的肿瘤细胞同种来源。

本发明实施例还提供了一种由上述所述的方法制备得到的肿瘤细胞源微颗粒载药制剂。本发明所制得的微颗粒载药制剂的剂型为注射制剂。

本发明实施例提供的肿瘤细胞源微颗粒载药制剂及其制备方法，该制备方法采用电穿孔技术，克服了细胞对于光热纳米颗粒、化疗药物有限的摄取的限制，使光热纳米颗粒和化疗药物较容易地进入肿瘤细胞中，从而实现与微颗粒的整合，其次先递送纳米颗粒及药物再释放微颗粒的整合方式，不会改变微颗粒结构，不影响微颗粒本身固有的体内行为，能够充分发挥微颗粒与光热纳米颗粒和化疗药物的协同治疗疗效，同时，肿瘤细胞内含有光热纳米颗粒，通过紫外光或红外光照射即可诱导细胞凋亡，整个整合构建方式简单、效率高、费用低，能够在肿瘤治疗中广泛地推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例制备得到的载药微颗粒的电子显微镜观察图；

图2为纯粹微颗粒、阿霉素和本发明实施例的载药微颗粒的荧光发射光谱；

图3a为纯粹微颗粒和本发明实施例的载药微颗粒的粒径分布图；

图3b为纯粹微颗粒和本发明实施例的载药微颗粒的zeta电势图；

图4为经过电穿孔和未经过电穿孔处理后的h22小鼠肝癌细胞内硒化铋含量图；

图5为经过电穿孔和未经过电穿孔处理后诱导产生的载药微颗粒中硒化铋含量图；

图6为经过电穿孔和未经过电穿孔处理后诱导产生的微颗粒蛋白量图；

图7为本发明实施例的载药微颗粒的体外光热性能图；

图8为不同载药微颗粒对h22皮下瘤小鼠生长的影响图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明使用的术语“微颗粒”是由凋亡肿瘤细胞产生的细胞囊泡，没有包裹化疗药物，“载药微颗粒”是由细胞囊泡包裹化疗药物和光热纳米颗粒后形成。本发明中所述的包裹在微颗粒中的“化疗药物”，可以是被临床应用的化疗药物，也可以是临床应用的化疗药物中的有效成分，本发明中所涉及的药物剂量，均应理解为该药物的有效成分量。

通过诱导肿瘤细胞凋亡释放得到微颗粒，可通过本领域技术人员可知的方法将化疗药物和光热纳米颗粒包裹进所述微颗粒中从而得到载药微颗粒，本发明优选采用紫外光或化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡。根据本领域技术人员公知的判断标准，如观察到肿瘤细胞缩小、折光变暗，即可认为细胞凋亡。对于载药微颗粒的收集可使用高速离心机在低温条件下进行分离。

下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物及实验动物：

h22小鼠肝癌细胞，从中国典型物保藏中心cctcc购买；

balb/c小鼠，购自湖北省实验动物中心，体重18-20克；

阿霉素，购自sigma公司。

实施例1：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：

(1)h22小鼠肝癌细胞在rpmi1640细胞培养液中培养。

(2)将h22小鼠肝癌细胞以2.5×10⁶个/ml的浓度悬浮于rpmi1640无血清细胞培养基中，分别加入浓度为0.4mg/ml的硒化铋纳米点和0.1mg/ml的化疗药物阿霉素，于4℃孵育10min。将400μl上述混悬液加入到电穿孔仪所配额套的0.4cm电转杯中，于300v电压和150μf的电容条件下进行电穿孔。电穿孔结束后，将细胞混悬液置于37℃孵育2h。

(3)将第(2)步最终所得细胞混悬液于强度为300jm^-2的紫外光下照射12h。

(4)在紫外光照射12h后，以在4℃下200g离心除去残存细胞。进一步取上清进行逐步离心，分别在6℃下以600g的转速离心10min，以14000g的离心力离心1min，以除去细胞碎片。取离心后的上清以20000g的离心力离心1h，得到来自h22小鼠肝癌细胞所产生的载药微颗粒。于-80℃储存备用。

实施例2：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：在500v电压和100μf电容条件下进行电穿孔。

实施例3：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：在100v电压和300μf电容条件下进行电穿孔。

实施例4：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：肿瘤细胞的悬液的浓度为4×10⁶个/ml，所述光热纳米颗粒的浓度为0.8mg/ml，所述化疗药物的浓度为0.1mg/ml。

实施例5：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：肿瘤细胞的悬液的浓度为4×10⁶个/ml，所述光热纳米颗粒的浓度为0.6mg/ml，所述化疗药物的浓度为0.2mg/ml。

实施例6：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：肿瘤细胞的悬液的浓度为1×10⁶个/ml，所述光热纳米颗粒的浓度为0.2mg/ml，所述化疗药物的浓度为0.05mg/ml。

实施例7：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：在细胞培养基中加入硒化铋纳米点和化疗药物阿霉素后，于0℃孵育10min。

实施例8：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：在细胞培养基中加入硒化铋纳米点和化疗药物阿霉素后，于8℃孵育30min。

实施例9：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：电穿孔结束后，将细胞混悬液置于37℃孵育0.5h。

实施例10：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：电穿孔结束后，将细胞混悬液置于357℃孵育3h。

实施例11-14：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：光热纳米颗粒分别为硫化铋纳米点、金纳米粒、铂纳米点、硒化铋纳米点和硫化铋纳米点的混合体。

实施例15-22：载药微颗粒

载药微颗粒的制备方法如下：同实施例1，不同之处在于：化疗药物分别为治疗乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤癌卵巢癌、急性白血病、子宫颈癌、膀胱癌或绒毛膜上皮癌的化疗药物；相应地，肿瘤细胞分别来源于乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤癌卵巢癌、急性白血病、子宫颈癌、膀胱癌或绒毛膜上皮癌。

以下以实施例1为例，对本发明制备得到的载药微颗粒进行实验研究。

1、透射电子显微镜观察载药微颗粒

将提取得到的载药微颗粒用2.5％(v/v)的戊二醛固定后，以1％乙酸双氧铀进行负染，然后进行透射电子显微镜观察。图1为本发明实施例制备得到的载药微颗粒的电子显微镜观察图，从图1可以看出，大量的黑色圆点分布于微颗粒内部，即表明成功将硒化铋纳米点负载至微颗粒中。

2、多功能载药微颗粒的荧光光谱分析

将h22小鼠肝癌细胞以2.5×10⁶个/ml的浓度悬浮于rpmi1640无血清细胞培养基中，直接在紫外光照射12h后，离心步骤同实施例1，收集得到纯粹微颗粒(对照组)。通过荧光分光光度计于488nm激发波长下，分别观察纯粹微颗粒、阿霉素和实施例1的载药微颗粒的荧光发射光谱，图2为纯粹微颗粒、阿霉素和本发明实施例的载药微颗粒的荧光发射光谱。如图2所示，纯粹微颗粒并没有阿霉素的特征发射峰，而载药微颗粒则显示了阿霉素的特征发射峰。由此结果显示阿霉素成功负载至多功能载药微颗粒中。

3、动态光散射监测多功能载药微颗粒的粒径分布及zeta电势

分别将纯粹微颗粒和实施例1的载药微颗粒分散于磷酸缓冲液中，于动态光散射仪进行粒径分布和zeta电势的测定，图3a为纯粹微颗粒和本发明实施例的载药微颗粒的粒径分布图；图3b为纯粹微颗粒和本发明实施例的载药微颗粒的zeta电势图。如图3a所示，两种微颗粒的粒径分布并无显著性差异，其平均粒径分别为360.5和356.7nm；如图3b所示，zeta电势也无显著性差异，分别位于-12.60和-12.02mv。由此结果显示细胞经电穿孔后产生的微颗粒表面性质并未发现明显改变。

4、电穿孔对细胞摄取硒化铋含量、载药微颗粒负载量及蛋白含量的影响

将h22小鼠肝癌细胞与硒化铋纳米点和阿霉素直接于37℃孵育2h后，紫外光照射12h，离心步骤同实施例1，收集由孵育进而诱导得到的载药微颗粒(即未经过电穿孔处理)。

分别通过原子荧光分光光度计检测经孵育或电穿孔处理的同等数量h22小鼠肝癌细胞内以及由其诱导产生的载药微颗粒中硒化铋含量，图4为经过电穿孔和未经过电穿孔处理后的h22小鼠肝癌细胞内硒化铋含量图，图5为经过电穿孔和未经过电穿孔处理后诱导产生的载药微颗粒中硒化铋含量图，图6为经过电穿孔和未经过电穿孔处理后诱导产生的微颗粒蛋白量图。

如图4所示，电穿孔处理的h22小鼠肝癌细胞内硒化铋含量为直接孵育的2.7倍。如图5所示，由电穿孔处理后诱导产生的载药微颗粒内硒化铋的含量为直接孵育的3.7倍。微颗粒的数量通常是通过其膜蛋白来进行定量的，通过对相同数量细胞产生微颗粒的蛋白质进行定量，如图6所示，电穿孔处理后所得微颗粒蛋白量要显著高于孵育处理的。因此，电穿孔不仅提高了单个微颗粒内硒化铋负载量，且提高了载药微颗粒的产率。

本发明通过以上方法分别对实施例1-21进行了电穿孔对细胞摄取硒化铋含量、载药微颗粒负载量及蛋白含量的影响研究，经过最终的实验结果可以得到，经过本发明的制备方法得到的载药微颗粒内光热纳米颗粒的负载量相较于传统直接孵育的方式提高了2-4倍。

5、载药微颗粒的体外光热性能评价

为评价载药微颗粒的光热性能，将载药微颗粒分散于磷酸缓冲液中，配置浓度为100μg/ml。分别量取1ml超纯水和多功能载药微颗粒分散液，于808nm近红外激光1.5w/cm²强度持续照射10min，并记录其温度变化，图7为本发明实施例的载药微颗粒的体外光热性能图。如图7所示，本发明的载药微颗粒分散液在激光照射10min后温度上升幅度高达43.5℃，然而纯水升温仅3.1℃。由此结果显示本发明制备得到的载药微颗粒具备优异的光热转换性能。

6、载药微颗粒的对h22皮下瘤小鼠生长的影响

(1)小鼠肝癌h22皮下瘤模型的建立：在balb/c小鼠背部右下侧近右下肢处皮下接种肝癌h22细胞悬液100μl(细胞数为2×10⁶)，建立小鼠肝癌h22皮下瘤模型。

(2)当小鼠肝癌h22皮下瘤长到体积为80-100mm³时，随机将荷有肝癌h22皮下瘤的小鼠分为4组，每组8只。将所制备的h22小鼠肝癌细胞的载药微颗粒尾静脉注射到荷瘤balb/c小鼠，并于注射12h后808激光(1.5w/cm²)照射10min，作为实验组；将所制备的h22小鼠肝癌细胞的载药微颗粒尾静脉注射到荷瘤balb/c小鼠，无激光照射，作为对照组三；将所制备的h22小鼠肝癌细胞的单硒化铋负载微颗粒尾静脉注射到荷瘤balb/c小鼠，并于注射12h后808激光(1.5w/cm²)照射10min，作为对照组二；将生理盐水尾静脉注射到荷瘤balb/c小鼠，作为对照组一。

(3)将实验组和对照组中的小鼠都每天用游标卡尺测量肿瘤的瘤长(l)和瘤宽(w)，计算肿瘤体积v＝l×w²/2。

图8为不同载药微颗粒对h22皮下瘤小鼠生长的影响图，如图8所示，实验组中h22小鼠肝癌细胞来源的载药微颗粒能显著抑制小鼠h22肝癌的生长。相较于对照组三的单纯光热治疗和对照组二的单纯化疗，实验组显示出良好的光热与化疗联用效果。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。