复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及医药
技术领域：
，特别涉及一种复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
：雨生红球藻虾青素是从红球藻科单细胞绿藻雨生红球藻(haematococcuspluvialis)中提炼出来的一种疏水性物质，化学名为3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β,β'-胡萝卜素，分子式为c40h52o4，分子质量为596.84，是唯一能通过血脑屏障的类胡萝卜素的含氧衍生物，颜色为红色，为不饱和萜烯类化合物，碳链末端各有一个含羟基的β-紫罗兰酮环(见图1)，不溶于水，具脂溶性。虾青素的结构根据羟基与整个分子平面的位置关系可分为4种光学异构体，雨生红球藻积累的虾青素产物为纯s构象。研究表明，虾青素有极强的染色、抗氧化和增强机体免疫的能力，在化妆品中还能够有效地延迟皮肤老化，在临床医药上能够有效地促进癌细胞凋亡，抑制心血管疾病引发的炎症。近年来雨生红球藻虾青素的广泛用途与独特的营养、药理特性日益受到人们的关注。随着研究越来越热，人们对其生理功能的认识越来越深，主要包括抗氧化性、抑制肿瘤、提高免疫力、预防高血压、预防糖尿病、预防心脑血管疾病、保护视力、保护神经等方面。由于雨生红球藻虾青素分子中含有共轭双键，且分子末端有不饱和的酮基和羟基，因此电子效应比较活跃，能够吸引自由基中未配对的电子，清除游离的自由基，产生抗氧化作用，也正是由于这样的结构，使得雨生红球藻虾青素对光、热、氧极为敏感，长时间放置在空气中容易氧化，高温易破坏其分子结构，因此生物利用度较低。并且，雨生红球藻虾青素或其提取物还存在水溶液不稳定的问题。因此，如何有效利用雨生红球藻虾青素，是人们亟待解决的一个技术问题。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂。本发明的另一目的在于提供通过上述复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂的制备方法。本发明的再一目的在于提供上述复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂，主要包含以下按质量分数计的组分：雨生红球藻虾青素或其提取物0.005～1％、植物油2～20％、乳化剂2～10％、抗氧剂0.005～0.5％、增溶剂1～8％、等渗调节剂0～5％、调味剂0～5％、香精0～0.5％、防腐剂0～0.5％；优选地，主要包含以下按质量分数计的组分：雨生红球藻虾青素0.005～0.5％、植物油5～15％、乳化剂2～5％、抗氧剂0.01～0.3％、增溶剂2～6％、等渗调节剂0～3.5％、调味剂0～3.5％、香精0～0.4％、防腐剂0～0.2％；更优选地，主要包含以下按质量分数计的组分：雨生红球藻虾青素0.01～0.2％、植物油9.9～11％、乳化剂3～4％、抗氧剂0.01～0.02％、增溶剂2.5～4％、等渗调节剂0～2.2％、调味剂0～2％、香精0～0.16％、防腐剂0～0.05％。所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂还包含ph调节剂，ph调节剂的量以所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂的ph值为6.5～7确定。所述的ph值调节剂优选为naoh溶液、na2co3溶液和nahco3溶液中的一种或至少两种；更优选为naoh溶液。所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂还包含水，水的用量为余量。所述的植物油优选为牡丹籽油、紫苏籽油、杜仲籽油、亚麻籽油和美藤果油中的一种或至少两种；优选为杜仲籽油和紫苏籽油按质量比1：0.8～1配比得到的油，或是杜仲籽油和紫苏籽油按质量比1：0.9～1配比得到的油，或是牡丹籽油：紫苏籽油：杜仲籽油＝质量比1：0.8～1：0.8～1配比得到的油，或是牡丹籽油：紫苏籽油：杜仲籽油：亚麻籽油＝质量比1.1～1.5：1～1.5：0.8～1：1配比得到的油，或是牡丹籽油：紫苏籽油：亚麻籽油：杜仲籽油：美藤果油＝质量比1：1：1：1：0.9～1配比得到的油。所述的乳化剂优选为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、液态卵磷脂和合成磷脂中的一种或至少两种。所述的增溶剂优选为乙醇、聚乙二醇、羟丙基β-环糊精、聚维酮和甘油中的一种或至少两种；更优选为聚维酮。所述的抗氧剂优选为维生素e和维生素c中的一种或两种。所述的等渗调节剂优选为甘油。所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂同时含增溶剂和等渗调节剂时，优选的方案为，所述的增溶剂和所述的等渗调节剂为不同的物质。所述的调味剂优选为甜菊糖苷、阿斯巴甜、葡萄糖和果糖中的一种或至少两种。所述的调味剂的含量优选为0.02～2％。所述的香精优选为薄荷香精、柠檬香精、玫瑰香精和牛奶香精中的一种或至少两种。所述的防腐剂优选为山梨酸钾。所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂包括复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射制剂和复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂。所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂为注射制剂时，所述的植物油、等渗调节剂和所述的水分别为注射用植物油、注射用甘油和注射用水；所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂为口服制剂时，所述的植物油和所述的水为食用植物油和纯化水。所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂为口服制剂时，所述的等渗调节剂的用量为0。所述的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂为注射制剂时，所述的调味剂、所述的香精和所述的防腐剂的用量为0。上述复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)在水浴和在氮气保护下，将植物油和雨生红球藻虾青素混合均匀，加入部分乳化剂、抗氧剂，混匀，冷却，得到油相；(2)在水浴和氮气保护下，将增溶剂、剩余乳化剂、等渗调节剂、调味剂、香精和防腐剂加入部分水中，搅拌，冷却，得到水相；(3)在搅拌状态下，将步骤(1)得到的油相加入步骤(2)得到的水相中；在氮气保护下搅拌，调节ph值，加入剩余水，得到乳白色的初乳；(4)将步骤(3)得到的初乳均质，过滤，充氮，灭菌，得到雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂。步骤(1)和(2)中所述的水浴的温度为50～60℃；优选为55～59℃。步骤(1)中所述的混匀的方式优选为搅拌。步骤(1)和(2)中所述的冷却的程度优选为冷却至室温。所述的室温为10～35℃；优选为20～30℃；更优选为24～26℃。步骤(2)中所述的搅拌优选为剪切搅拌。步骤(3)中所述的搅拌优选为剪切搅拌。所述的剪切搅拌的时间优选为15～60min。所述的剪切搅拌的转速优选为5000～8000r/min。步骤(3)中所述的调节优选为采用naoh溶液进行调节。所述的naoh溶液优选为质量体积比1％的naoh溶液。步骤(3)中所述的调节是将ph调节至6.5～7。步骤(4)中所述的均质为采用高压均质机进行高压均质。所述的高压均质的压力为1000～1200bar。所述的高压均质的次数为3～15次；优选为5～12次。所述的高压均质的温度为50～60℃；优选为55～58℃。步骤(4)中所述的过滤优选为采用微孔滤膜。步骤(4)中所述的灭菌是在100℃、fo值为20的条件下灭菌。上述复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂在制备抗衰老药物和保健品中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.本发明的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂具有高度的分散性，优良的贮存稳定性，特别是雨生红球藻虾青素的不稳定性在与选用的其它植物油复合相溶时被抑制，克服了现有雨生红球藻虾青素或其提取物产品的缺陷，生物利用度和效果明显提高。2.雨生红球藻虾青素或其提取物为油类物质，既是原料药有效成分，又是油相辅料，且本发明选用的其它植物油既可作为雨生红球藻虾青素的分散剂或载体，分散或溶解雨生红球藻虾青素或其提取物的有效成分，减少雨生红球藻虾青素及其有效成分的被氧化性，稳定雨生红球藻虾青素，又可作为抗衰老作用或辅助抗衰老作用的原料药有效成分，相对增加活性药物成分的浓度，药物服用量相对减少。3.本发明的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳是将雨生红球藻虾青素或其提取物与牡丹籽油、紫苏籽油、杜仲籽油、亚麻籽油和美藤果油等合理配伍得到，可明显增强衰老模型大鼠的抗疲劳能力和学习记忆能力，提高胃组织中sod活性并降低mda含量，清除体内自由基，抗衰老效果明显好于单一雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂。4.本发明的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射剂直接进入人体血液，起效快，吸收较完全，避免了药物的首过效应，提高了雨生红球藻虾青素或其提取物的生物利用度，最大限度发挥有效成分的疗效。雨生红球藻虾青素或其提取物不溶于水，因此作为注射用药物制剂，制备成了较为适宜的静脉注射乳剂，药物被动定向浓集在富含吞噬细胞的肝、脾、淋巴系统等部位，不仅可实现靶向给药，并且具有潜在的缓释作用，由于粒径＜1000nm而不易被网状皮质系统摄取，达到了“长循环”的效果。5.本发明的雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂将不溶于水的成分制成乳化水剂应用于临床，提高了雨生红球藻虾青素或其提取物口服制剂的生物利用度，同时起到吸收快、口感好、服用方便的作用。6.本发明原料易得，工艺简单，可用常规的生产设备和工艺制备，适合于具gmp生产厂家大规模地投入批量生产。附图说明图1是雨生红球藻虾青素的分子结构图。具体实施方式下面将结合实施方式对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射制剂一(1)成分组成如表1所示：表1(2)制备方法(1)在约55℃水浴及氮气保护下，取注射用牡丹籽油99g，加入雨生红球藻虾青素1g，搅拌至溶解并混合均匀，投入大豆卵磷脂20g、维生素e100mg，搅拌至大豆卵磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。(2)在约55℃水浴及氮气保护下，将注射用水800ml置于容器中，加入聚维酮40g、注射用甘油22g及另一部分大豆卵磷脂15g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。(3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时在氮气保护下剪切搅拌(8000rpm)约20分钟,然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加注射用水至1000ml，得到乳白色初乳。(4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约55℃下高压均质(均质压力1200bar)12次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用1μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖，用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌。灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射剂，室温下贮存。(5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观粒径(nano-zs型纳米粒度仪)、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳静脉注射液稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。其ph值为6.8，乳粒的大小及范围：小于lμm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在300～600nm之间。实施例2复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射制剂二(1)成分组成如表2所示：表2(2)制备方法(1)在约56℃水浴及氮气保护下，取注射用紫苏籽油50g，加入注射用杜仲籽油49.5g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素0.5g，搅拌至溶解并混合均匀，投入蛋黄卵磷脂15g、维生素c100mg，搅拌至蛋黄卵磷脂溶解形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。(2)在约56℃水浴及氮气保护下，将注射用水800ml置于容器中，加入聚乙二醇30g、注射用甘油22g及蛋黄卵磷脂20g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。(3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(7500rpm)约30分钟，然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加注射用水至1000ml，得到乳白色初乳。(4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约56℃下高压均质(均质压力1200bar)11次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用1μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖，采用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌。灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射剂，室温下贮存。(5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳静脉注射液稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳静脉注射液ph值：6.7，乳粒的大小及范围：小于lμm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在300～600nm之间。实施例3复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射制剂三(1)成分组成如表3所示：表3(2)制备方法(1)在约58℃水浴及氮气保护下，取注射用牡丹籽油35g，加入注射用杜仲籽油35g和紫苏籽油29.8g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素0.2g，搅拌溶解并混合均匀，投入蛋黄卵磷脂15g和维生素e100mg，搅拌至蛋黄卵磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。(2)在约58℃水浴及氮气保护下，将注射用水800ml置于容器中，加入聚维酮25g、注射用甘油22g及蛋黄卵磷脂20g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。(3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(7000rpm)约40分钟，然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加注射用水至1000ml，得到乳白色初乳。(4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约58℃下高压均质(均质压力1100bar)10次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用1μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖，采用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌。灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射剂，室温下贮存。(5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳静脉注射液稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳静脉注射液ph值：6.9，乳粒的大小及范围：小于lμm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在300～600nm之间。实施例4复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射制剂四(1)成分组成如表4所示：表4(2)制备方法(1)在约55℃水浴及氮气保护下，取注射用亚麻籽油30g，加入注射用牡丹籽油30g、紫苏籽油29g和杜仲籽油20g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素提取物1.0g，搅拌溶解并混合均匀，投入合成磷脂20g和维生素e100mg，搅拌至合成磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。(2)在约55℃水浴及氮气保护下，将注射用水800ml置于容器中，加入聚维酮25g、注射用甘油22g及合成磷脂20g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。(3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(6500rpm)约40分钟,然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加注射用水至1000ml，得到乳白色初乳。(4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约55℃下高压均质(均质压力1100bar)11次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用1μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖。采用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌。灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射剂，室温下贮存。(5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳静脉注射液稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳静脉注射液ph值：6.9，乳粒的大小及范围：小于lμm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在300～600nm之间。实施例5复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射制剂五(1)成分组成如表5所示：表5(2)制备方法1)在约56℃水浴及氮气保护下，取注射用牡丹籽油20g，加入注射用亚麻籽油20g、紫苏籽油20g、杜仲籽油20g和美藤果油19g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素提取物1.0g，搅拌溶解并混合均匀，投入合成磷脂10g、蛋黄卵磷脂10g和维生素e100mg，搅拌至合成磷脂和蛋黄卵磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。2)在约56℃水浴及氮气保护下，将注射用水800ml置于容器中，加入聚维酮25g、注射用甘油22g及合成磷脂20g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(6000rpm)约40分钟,然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加注射用水至1000ml，得到乳白色初乳。4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约56℃下用高压均质(均质压力1200bar)11次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用1μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖。用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌，灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳注射剂，在室温下贮存。5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳静脉注射液稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳静脉注射液ph值：6.8，乳粒的大小及范围：小于lμm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在300～600nm之间。实施例6复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂一(1)成分组成如表6所示：表6(2)制备方法1)在约55℃水浴及氮气保护下，取牡丹籽油50g，加入紫苏籽油49g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素1.0g，搅拌溶解并混合均匀，投入大豆卵磷脂20g和维生素e100mg，搅拌至大豆卵磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。2)在约55℃水浴及氮气保护下，将纯化水800ml置于容器中，加入羟丙基β-环糊精30g、甜菊糖苷200mg、山梨酸钾500mg及另一部分大豆卵磷脂15g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(6000rpm)约15分钟，然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加纯化水至1000ml，得到乳白色初乳。4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约55℃下高压均质(均质压力1000bar)7次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用5μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖。用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌，灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服液，在室温下贮存。5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳口服制剂稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳口服制剂ph值：6.9，乳粒的大小及范围：小于5μm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在1500～3000nm之间。实施例7复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂二(1)成分组成如表7所示：表7(2)制备方法1)在约57℃水浴及氮气保护下，取杜仲籽油49.5g，加入紫苏籽油60g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素0.5g，搅拌溶解并混合均匀，投入蛋黄卵磷脂15g和维生素c100mg，搅拌至蛋黄卵磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。2)在约57℃水浴及氮气保护下，将纯化水800ml置于容器中，加入聚乙二醇30g、葡萄糖20g、玫瑰香精1.6g、山梨酸钾500mg及蛋黄卵磷脂20g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(6000rpm)约40分钟,然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加纯化水至1000ml，得到乳白色初乳。4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约57℃下高压均质(均质压力1000bar)6次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用5μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖。用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌。灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服液，室温下贮存。5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳口服制剂稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳口服制剂ph值：6.7，乳粒的大小及范围：小于5μm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在1500～3000nm之间。实施例8复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂三(1)成分组成如表8所示：表8(2)制备方法1)在约56℃水浴及氮气保护下，取牡丹籽油35g，加入紫苏籽油35g和杜仲籽油29g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素1.0g，搅拌溶解并混合均匀，投入蛋黄卵磷脂15g和维生素e100mg，搅拌至蛋黄卵磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。2)在约56℃水浴及氮气保护下，将纯化水800ml置于容器中，加入甘油25g、果糖20g、牛奶香精1.6g、山梨酸钾500mg及蛋黄卵磷脂20g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(5000rpm)约50分钟，然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加纯化水至1000ml，得到乳白色初乳。4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约56℃下高压均质(均质压力1000bar)5次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用5μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖。用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌，灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪口服液，在室温下贮存。5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳口服制剂稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳口服制剂ph值：6.9，乳粒的大小及范围：小于5μm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在1500～3000nm之间。实施例9复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂四(1)成分组成如表9所示：表9(2)制备方法1)在约58℃水浴及氮气保护下，取牡丹籽油28g，加入亚麻籽油25g、紫苏籽油25g和杜仲籽油20g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素提取物2.0g，搅拌溶解并混合均匀，投入合成磷脂20g和维生素e100mg，搅拌至磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。2)在约58℃水浴及氮气保护下，将纯化水800ml置于容器中，加入聚维酮25g、阿斯巴甜200mg、薄荷香精0.8g、柠檬香精0.8、山梨酸钾500mg及合成磷脂20g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(6000rpm)约30分钟，然后用1％(w/v)naoh溶液调节ph至6.5～7.0，再加纯化水至1000ml，得到乳白色初乳。4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约58℃下高压均质(均质压力1000bar)7次，每次2min；进行乳滴粒径检查，匀化后采用5μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖。用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌，灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服液，在室温下贮存。5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳口服制剂稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳口服制剂ph值：6.7，乳粒的大小及范围：小于5μm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在1500～3000nm之间。实施例10复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂五(1)成分组成如表10所示：表10(2)制备方法1)在约57℃水浴及氮气保护下，取紫苏籽油20g，加入杜仲籽油20g、亚麻籽油20g、牡丹籽油20g和美藤果油18.8g，混合均匀，再加入雨生红球藻虾青素1.2g，搅拌溶解并混合均匀，投入大豆卵磷脂10g、蛋黄卵磷脂10g、维生素e100mg，搅拌至磷脂溶解并形成均匀混和相，冷却至室温，得到油相。2)在约57℃水浴及氮气保护下，将纯化水800ml置于容器中，加入甘油25g、果糖20g、牛奶香精1.6g、山梨酸钾500mg及另一部分大豆卵磷脂10g和蛋黄卵磷脂10g，剪切搅拌使其溶解并混合均匀，冷却至室温，得到水相。3)在搅拌条件下，将油相缓慢地加入水相中，同时氮气保护下进行剪切搅拌(5000rpm)约50分钟，每次2min；然后用1％(w/v)naoh液调节ph至6.5～7.0，再加纯化水至1000ml，得到乳白色初乳。4)将制备好的白色初乳移入高压匀质机，约57℃下高压均质(均质压力1000bar)5次，进行乳滴粒径检查，匀化后采用5μm的微孔滤膜过滤，充氮，灌封，压盖。用旋转高压灭菌器在100℃、fo为20的条件下灭菌，灭菌完毕后逐渐冷却，即制成复合雨生红球藻虾青素脂肪口服液，在室温下贮存。5)稳定性测定：将新制备的脂肪乳置于具塞离心管中，4000rpm离心15min后，查看是否分层和沉淀析出。室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观、粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。检查结果：脂肪乳口服制剂稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观、粒径、zeta电位和含量均未发生明显变化，表明脂肪乳制剂稳定。脂肪乳口服制剂ph值：6.8，乳粒的大小及范围：小于5μm，乳粒粒径在放置前后的分布区别不大，均85％分布在1500～3000nm之间。对比例1基本同实施例1，区别仅在于用等量的大豆油代替牡丹籽油。将得到的脂肪乳制剂于室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。结果如下：脂肪乳静脉注射液稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观未发生明显变化。其初始的ph值为6.8，乳粒的分布小于lμm，85％的乳粒分布在300～600nm之间；在放置一年后检测得到的乳粒也小于lμm，但是85％的乳粒分布在600～900nm之间。对比例2基本同实施例6，区别仅在于用等量的大豆油代替牡丹籽油和紫苏籽油。将得到的脂肪乳制剂于室温阴凉处贮存一年，检查脂肪乳制剂外观粒径、zeta电位等理化性质以及含量是否发生明显变化。结果如下：脂肪乳静脉注射液稳定性良好，未发现分层和药物析出，外观未发生明显变化。其初始的脂肪乳口服制剂ph值：6.9，乳粒的大小及范围：小于5μm，85％分布在1500～3000nm之间；在放置一年后检测得到的乳粒的85％的乳粒分布在2500～4000nm之间。效果例1复合雨生红球藻虾青素脂肪乳对衰老模型大鼠的抗衰老作用研究衰老的自由基学说认为，衰老是由于自由基产生过多而引起脂质过氧化反应，使生物膜、蛋白质(酶)及遗传物质等损伤并最终导致衰老。活性氧自由基(o2-和h2o2)清除剂超氧化物歧化酶(sod)可使有毒的o2-和h2o2经过歧化和还原得到清除，从而阻止其引起自由基的链锁反应，因而降低自由基代谢产物丙二醛(mda)的生成。因此，可将sod活力大小作为机体抵抗衰老的一项重要指标。另外，也可将mda作为抗氧化的一项指标。本实施例主要研究复合雨生红球藻虾青素口服脂肪乳制剂对衰老动物的学习记忆障碍的改善、降低衰老小鼠脑组织内mda的含量及增加sod的活性来检测复合雨生红球藻虾青素及其脂肪乳制剂的抗衰老作用。(一)实验材料与方法1.实验试剂(1)雨生红球藻虾青素市购得到。(2)雨生红球藻虾青素或其提取物脂肪乳制剂按上述实施例6的方法制备，将实施例6中的牡丹籽油和紫苏籽油以等量大豆油替代，制备成雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂，命名为脂肪乳系统1。复合雨生红球藻虾青素脂肪乳制剂为上述实施例6和实施例8制备的脂肪乳制剂供用，依次命名为脂肪乳系统2和脂肪乳系统3；将实施例6中的雨生红球藻虾青素以等量的牡丹籽油替代，得到自乳化系统4(3)吡拉西坦片：山东仁和堂药业有限公司；d-半乳糖：德国sigma公司；超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、总蛋白、一氧化氮(no)、一氧化氮合酶(nos)测定试剂盒：上海常斤生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。2.实验仪器与设备morris水迷宫系统：北京众实迪创科技发展有限责任公司；dy89-ⅱ电动玻璃匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司；hh-21-6电热恒温水浴锅：常州诺基仪器有限公司；wh-1微型漩涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；gtr16-2高速冷冻离心机：北京时代北利离心机有限公司；752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。3.实验动物清洁级wistar大鼠60只，雄性，体重为200±20g，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证明编号：no.44411600000901。实验动物使用许可证号：syxk(粤)2013-0002。饲养环境：spf级，单笼饲养。4.实验方法(1)实验分组、造模和给药1)动物分组：将wistar大鼠70只先喂养一周以适应环境，然后随机法随机分为7组：阴性对照组，模型组、脂肪乳系统1组、脂肪乳系统2组、脂肪乳系统3组、脂肪乳系统4组和阳性对照组(使用吡拉西坦)。2)衰老模型造模：d-半乳糖溶液配制：6.25g溶入100ml生理盐水中。d-半乳糖剂量为125mg/kg，皮下注射体积应控制在0.2ml/100g。d-半乳糖溶液配制：6.25g溶入100ml生理盐水中，可控制皮下注射量为0.2ml/100g。阴性对照组注射同体积生理盐水，连续注射8周。造模过程的时间中同时给予脂肪乳系统药物灌胃。3)给药：根据成人每人每天可食用雨生红球藻虾青素的较大剂量，通过换算得到大鼠的相应等效剂量约为10mg/kg。脂肪乳系统1组、脂肪乳系统2组、脂肪乳系统3组、脂肪乳系统4组(加入量与其他脂肪乳系统组相同)和阳性对照组中的大鼠每日经口灌胃给药，阴性对照组和模型组正常喂养，不给药；各组均给药8周。实验结束后，进行负重游泳测试和水迷宫测试，期间持续给药。(2)负重游泳测试实验负重游泳测试实验选用直径80cm、高度100cm四周光滑的圆桶，负重物选用铅条，水温控制在28±2℃。将铅条绑在大鼠尾部根部，质量为大鼠体重的10％，从大鼠放入水中开始计时，当大鼠头部沉入水中10s以上时，实验结束，记录时间。负重游泳测试实验主要检测大鼠抗疲劳能力。(3)morris水迷宫实验morris水迷宫是由不锈钢圆形水槽、隐藏在水面以下的平台以及一套图像自动采集和处理系统(摄像机、显示器和分析软件等)。水槽内部直径1.5m、高0.5m，水槽四周光滑，内壁涂成黑色。将圆形水槽分为4个象限(ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ)，在4个象限水槽壁处各选一处标记作为入水点，大鼠每次面向水槽壁放入水中。平台位于第ⅱ象限，水面高过平台2cm为宜。水槽上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。房间内光照恒定，无光线直接照射水槽。整个实验过程中，水槽周围参照物不能移动，同时实验者不得在动物视力范围内出现，并保持安静，无噪音影响。实验前1d，所有组别大鼠各自进行自由游泳，适应水槽环境。实验历时5d，分两个阶段进行：1)定位航行实验：每只大鼠进行4次训练，依此从第ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ象限的入水点面向水槽壁入水。记录大鼠从入水到找到平台的时间，此为逃避潜伏期(escapelatency)。大鼠登上平台后，使其在平台停留15s。如果大鼠90s内无法找到平台，则将其牵引至平台，也使其在平台停留15s，潜伏期此时记为90s。每次训练结束后，使大鼠休息15s，4个象限训练的潜伏期的平均值记为当天的逃避潜伏期。总共训练4d，以第4天的逃避潜伏期作为最终的成绩，以此检测大鼠的学习能力。2)空间探索实验：第5天开始进行空间搜索实验，撤除水下平台，将大鼠从距原平台所处第ⅱ象限最远的第ⅳ象限入水点放入水中，记录大鼠90s内穿越原平台位置的次数以及有效时间比(即原平台所处象限游泳时间与总游泳时间的比值)，以此检测大鼠的记忆能力。(4)生化指标测定大鼠最后一天给药结束后禁食12h处死。断头处死，以15mlep管取血。血液室温放置30min后离心，3000r/min4℃离心10min，取上层血清，进行超氧化物歧化酶(sod)和丙二醛(mda)的检测。将大鼠头部置于冰盘上，迅速剥离大脑，用预冷的生理盐水冲洗，制10％的组织匀浆，3000r/min4℃离心，取上清，进行总蛋白、一氧化氮(no)和一氧化氮合酶(nos)的检测。(5)统计学方法实验数据以“x±s”表示，使用spss17.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。(二)实验结果1.负重游泳测试结果负重游泳测试结果见表11，与模型组相比，阴性对照组负重游泳时间明显长于模型组(p＜0.05)，说明衰老模型造模成功；与模型组相比，脂肪乳1系统组、脂肪乳2系统组和脂肪乳3系统组游泳时间也明显长于模型组(p＜0.05)。结果表明，雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂及复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂均可增强衰老模型大鼠的抗疲劳能力，并且复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂对衰老模型大鼠抗疲劳能力比雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂明显增强。表11各组大鼠负重游泳测试结果(n＝12)组别游泳时间/min阴性对照组19.47±0.41★阳性对照组19.46±0.35★模型组12.13±0.32脂肪乳系统1组16.19±0.29★脂肪乳系统2组19.39±0.44★脂肪乳系统3组19.52±0.42★脂肪乳系统4组12.59±0.35注：与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01。2.水迷宫结果水迷宫结果见表12，与模型组相比，阴性对照组大鼠的逃避潜伏期明显少于模型组(p＜0.05)，有效时间比和穿越平台次数明显高于模型组(p＜0.05)；与模型组相比，脂肪乳系统组各组大鼠的逃避潜伏期也明显少于模型组(p＜0.05)，脂肪乳1系统组的有效时间比高于模型组(p＜0.05)，脂肪乳1系统组的穿越平台次数无明显差异，脂肪乳2系统组和脂肪乳3系统组二组的有效时间比和穿越平台次数均明显高于模型组(p＜0.05)。上述结果表明，雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂能增强衰老模型大鼠的学习记忆能力，而且复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂对衰老模型大鼠的学习记忆能力的影响明显强于雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂。表12各组大鼠morris水迷宫实验结果(n＝12)组别潜伏期/s有效时间比穿越平台次数阴性对照组36.36±8.22★0.3909±0.1666★3.93±2.51★阳性对照组36.34±7.98★0.3907±0.2006★3.92±2.07★模型组56.73±6.610.3286±0.24222.19±1.60脂肪乳系统1组43.44±5.19★0.3863±0.2292★2.93±1.98脂肪乳系统2组36.59±4.59★0.3990±0.2168★3.90±2.05★脂肪乳系统3组35.95±4.54★0.4052±0.2409★3.94±2.11★脂肪乳系统4组56.11±6.610.3358±0.21352.32±1.51注：与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01。3.生化指标结果大鼠血清生化指标测定结果见表13，与模型组相比，阴性对照组sod活力明显高于模型组(p＜0.05)，mda含量明显低于模型组(p＜0.05)；与模型组相比，脂肪乳系统组的sod活力明显高于模型组(p＜0.05)、mda含量明显低于模型组(p＜0.05)，且复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂组(脂肪乳系统2组和脂肪乳系统3组)的活力强于雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂组(脂肪乳系统1组)的活力。表13各组大鼠血清生化指标测定结果(n＝12)注：与模型组比较，★p＜0.05，★★p＜0.01。(三)结论造模实验结果表明：本实验复制的d-半乳糖亚急性衰老模型是可信的。负重游泳实验结果显示：雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂和复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂均可增强衰老模型大鼠的抗疲劳能力，并且复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂对衰老模型大鼠抗疲劳能力比雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂明显增强。水迷宫实验结果表明：雨生红球藻虾青素和复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂均能增强衰老模型大鼠的学习记忆能力，而且复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂对衰老模型大鼠的学习记忆能力的影响明显强于雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂。生化指标测定结果显示：雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂和复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂均可提高超氧化物歧化酶的活力，降低体内丙二醛的含量，清除体内自由基，从而达到保护机体的作用。但雨生红球藻虾青素与牡丹籽油、紫苏籽油、杜仲籽油、亚麻籽油、美藤果油复合后形成的复合雨生红球藻虾青素脂肪乳口服制剂可明显增强雨生红球藻虾青素的抗衰老的作用，达到了更为理想的效果。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12