本发明属于生物材料中的止血材料制备方法，具体地，本发明涉及一种具有表面止血和填充止血功能的复合止血材料的制备方法。
背景技术：
软组织创伤中，大血管出血和创伤性组织广泛性渗血是导致受伤人员死亡的重要原因，及时有效的急救止血可为伤员的救治赢得宝贵时间。传统伤口的止血方法包括加压、包扎、敷料填塞以及止血绷带等，常导致造成远端组织缺血和代谢异常等症状，以及皮肤和远端组织缺血性坏死等后遗症，同时神经损伤型缺血还会导致筋膜间室综合征，代谢产物聚集以及肾功能衰竭等。
采用具有止血效果的生物材料进行止血具有止血快，伤口愈合效果好以及后遗症低等。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，这种天然高分子的生物功能性和生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注。利用壳聚糖自带正电荷性质、固态壳聚糖吸附性能，促进红细胞快速聚集性能从而达到启动止血的效果。此外，壳聚糖与活化的血小板间存在一定的静电作用，增强血小板的黏附和聚集效果，促进血小板血栓形成，从而加速凝血。
胶原是一种天然生物高分子材料，利用胶原促使血管的收缩、血小板激活和凝血系统启动的性能，可实现快速止血的效果。胶原天然高级结构是胶原具有凝血能力的基础，对血小板的激活作用可缩短血栓形成的时间。血管受损时胶原能引起血小板聚集并能刺激血小板释放一些亚细胞颗粒和分泌物，包括各种凝血因子，凝血因子黏附在受损血管上，以填塞受伤血管，达到止血目的。胶原具有可使血小板凝聚的能力，胶原还能直接激活内源性凝血，最终产生凝血酶，凝血酶再催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血液凝固。基于胶原的止血材料作用于创面时，初始期胶原吸附血小板，与凝血因子相互作用，并引起血小板聚合，起止血作用；血小板的破坏，使其释放出生长因子等多种活性物质，诱发成纤维细胞的活性，激活和调节不同血细胞的功能，从而达到修复效果。
基于胶原和壳聚糖的止血材料的作用机理存在差异，理论上采用胶原和壳聚糖制备的止血材料具有双重止血效果。但由于壳聚糖是自带正电荷的多糖，胶原中存在大量游离的羧基，主要来自于谷氨酸和天冬氨酸，在制备材料时易导致沉淀，材料的均匀性难以保证。此外，胶原的机械强度不高，易导致制备的止血材料降解等。
技术实现要素：
针对传统的止血材料制备方法存在的问题，本发明旨在提供一种多功能复合止血材料的制备方法，本发明的技术方案是通过以下方式实现的。一种多功能复合止血材料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)胶原微球制备：将0.5-5w/v％有机酸酯溶于有机酸中作为油相，称取一定量胶原溶于有机酸水溶液中作为水相；在搅拌下将水相加入油相中，搅拌乳化5-60min得到水/油预乳液；将预乳液转入乳化装置的储罐中，控制搅拌速率，将微球的粒径控制在一定范围内，过滤收集乳液，冷冻干燥得到微球；
(2)壳聚糖溶液配制：称取一定分子量范围的壳聚糖，加入到一定浓度的氨基酸水溶液中，将温度加热至20-60℃范围，搅拌后形成均一的溶液，将温度降至20℃以下；
(3)胶原微球与壳聚糖溶液的混合：将胶原微球与壳聚糖溶液进行混合，使胶原微球均匀分散于壳聚糖溶液中；
(4)冷冻干燥：将混合后的胶原微球与壳聚糖溶液进行冷冻干燥，控制冻干后的膜状材料含水量低于5w/w％。
优选地，在所述步骤(1)胶原微球制备过程中，胶原在有机酸水溶液中的浓度控制在0.1-2w/v％范围内。
优选地，所述有机酸酯是醋酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、壬酸酯、辛酸酯、月桂酸酯或癸酸酯，所述有机酸是油酸、亚油酸、己酸、庚酸、辛酸、乙酸、丙酸、丁酸或戊酸。
优选地，所述步骤(1)胶原微球制备过程中，制备的胶原微球粒径控制在50-500微米范围内。
优选地，所述步骤(2)壳聚糖溶液配制过程中，使用的壳聚糖分子量为100-500kda，浓度为0.5-10w/v％。
优选地，所述步骤(2)壳聚糖溶液配制过程中，所述氨基酸是天冬氨酸和/或谷氨酸，浓度为0.1-5w/v％。
优选地，所述步骤(3)胶原微球与壳聚糖溶液的混合过程中，搅拌的时间控制在1-30min，搅拌过程中溶液温度控制在20℃以下。
本发明的一种多功能复合止血材料的制备方法具有操作过程简单、步骤少等优点，制备出的止血材料具有强度高，降解周期长，达到既可贴服也可填充的使用效果。
具体实施例
下面通过具体实施例对本发明进行具体地描述，值得提出的是，实施例只是对本发明一种多功能复合止血材料及其制备方法的举例说明，并不能代表本发明专利的全部，更不能理解为对本发明保护范围的限制，在不脱离本发明实质的构思前提条件下，还可以做出若干调整或改进，均都属于本发明的保护范围。
实施例1
原料：牛i型胶原，分子量300kda，胶原含量>90％；壳聚糖：分子量50kda-200kda。
(1)胶原微球制备：将月桂酸甲酯溶于庚酸中作为油相，月桂酸甲酯浓度控制在5％，称取一定量胶原溶于醋酸水溶液中作为水相，胶原浓度控制在0.1％。在搅拌下将水相以一定速度加入油相中，500r/m搅拌乳化60min得到水/油乳液。将预乳液转入高速乳化装置的储罐中，搅拌转速在3000r/m，停止搅拌后向溶液中加入一定量的丁酸，过滤后收集乳液，冷冻干燥后得到微球，胶原微球的粒径为100-300微米。
(2)壳聚糖溶液配制：将壳聚糖加入到2％的谷氨酸水溶液中，壳聚糖浓度控制在10％，将溶液温度加热至60℃内，4000r/m搅拌形成均一的溶液，将其温度降至10℃以下。
(3)胶原微球与壳聚糖溶液的混合：将制备的100-300微米的胶原微球与壳聚糖溶液进行混合，微球在壳聚糖溶液中的浓度为0.05％；4000r/m搅拌10min，使胶原微球均匀分散于壳聚糖溶液中，立刻注入冻干容器内。
(4)冷冻干燥：将混合后的胶原微球与壳聚糖溶液进行冷冻干燥，冻干后的膜状材料含水量低于5％。
制备的材料为胶原微球和壳聚糖复合的止血材料，其内部孔径均匀，抗拉实验时，1cm宽的止血海绵条能够承受20n拉力，1min不断裂；可吸收自身重量20倍以上液体，材料能够很好地与止血创面贴合，止血效果明显且无碎片掉落；填充止血，四个月后观察材料小部分降解，明显长于胶原海绵。
实施例2
原料：牛i型和iii型胶原混合物，分子量300kda；壳聚糖：分子量200kda-350kda。
(1)胶原微球制备：将癸酸甲酯溶于亚油酸中作为油相，癸酸甲酯浓度控制在4％，称取一定量胶原溶于丙酸水溶液中作为水相，胶原浓度控制在1％。在搅拌下将水相以一定速度加入油相中，200r/m搅拌乳化40min得到水/油乳液。将预乳液转入高速乳化装置的储罐中，搅拌转速在4000r/m左右，停止搅拌后向溶液中加入一定量的戊酸，过滤后收集乳液，冷冻干燥后得到微球，胶原微球的粒径为50-260微米。
(2)壳聚糖溶液配制：将壳聚糖加入到一定3.5％的天冬氨酸水溶液中，壳聚糖浓度控制在7％，将溶液温度加热至45℃内，3000r/m搅拌后形成均一的溶液，将其温度降至20℃以下。
(3)胶原微球与壳聚糖溶液的混合：将制备的50-260微米的胶原微球与壳聚糖溶液进行混合，微球在壳聚糖溶液中的浓度为1％；3000r/m搅拌15min，使胶原微球均匀分散于壳聚糖溶液中，立刻注入冻干容器内。
(4)冷冻干燥：将混合后的胶原微球与壳聚糖溶液进行冷冻干燥，冻干后的膜状材料含水量低于5％。
制备的材料为胶原微球和壳聚糖复合的止血材料，其内部孔径均匀，抗拉实验时，1cm宽的止血海绵条能够承受15n拉力，1min不断裂；可吸收自身重量20倍以上液体，材料能够很好地与止血创面贴合，止血效果明显且无碎片掉落；填充止血，四个月后观察材料仅部分降解，明显长于胶原海绵。
实施例3
原料：牛i型和iii型胶原混合物，分子量200kda；壳聚糖：分子量150kda-300kda。
(1)胶原微球制备：将醋酸乙酯溶于己酸中作为油相，月桂酸乙酯浓度控制在2.5％，称取一定量胶原溶于丁酸水溶液中作为水相，胶原浓度控制在2％。在搅拌下将水相以一定速度加入油相中，300r/m搅拌乳化20min得到水/油乳液。将预乳液转入高速乳化装置的储罐中，搅拌转速在3000r/m左右，停止搅拌后向溶液中加入一定量的戊酸，过滤后收集乳液，冷冻干燥后得到微球，胶原微球的粒径为200-400微米。
(2)壳聚糖溶液配制：将壳聚糖加入到0.1％的天冬氨酸水溶液中，壳聚糖浓度控制在5％，将溶液温度加热至35℃内，3000r/m搅拌后形成均一的溶液，将其温度降至15℃以下。
(3)胶原微球与壳聚糖溶液的混合：将制备的200-400微米的胶原微球与壳聚糖溶液进行混合，微球在壳聚糖溶液中的浓度为1％；3000r/m搅拌30min，使胶原微球均匀分散于壳聚糖溶液中，立刻注入冻干容器内。
(4)冷冻干燥：将混合后的胶原微球与壳聚糖溶液进行冷冻干燥，冻干后的膜状材料含水量低于5％。
制备的材料为胶原微球和壳聚糖复合的止血材料，内部形成均匀网状结构，1cm宽的止血海绵条能够承受12n拉力，1min不断裂；表面止血时能够与伤口较好贴合，液体吸收量达自身重量15倍以上，止血效果明显；填充止血，三个月后材料小部分降解且无明显免疫反应，降解时间明显优于胶原止血海绵。
实施例4
原料：牛iii型胶原，分子量250kda；壳聚糖：分子量300kda-500kda。
(1)胶原微球制备：将庚酸甲脂溶于油酸中作为油相，月桂酸脂浓度控制在0.5％，称取一定量胶原溶于丙酸水溶液中作为水相，胶原浓度控制在1.5％。在搅拌下将水相以一定速度加入油相中，50r/m搅拌乳化5min得到水/油乳液。将预乳液转入高速乳化装置的储罐中，搅拌转速在4000r/m左右，停止搅拌后向溶液中加入一定量的戊酸，过滤后收集乳液，冷冻干燥后得到微球，胶原微球的粒径为300-500微米。
(2)壳聚糖溶液配制：将壳聚糖加入到2％的天冬氨酸水溶液中，壳聚糖浓度控制在0.5％，将溶液温度加热至20℃内，4000r/m搅拌后形成均一的溶液，将其温度降至5℃以下。
(3)胶原微球与壳聚糖溶液的混合：将制备的300-500微米的胶原微球与壳聚糖溶液进行混合，微球在壳聚糖溶液中的浓度为1％；4000r/m搅拌20min，使胶原微球均匀分散于壳聚糖溶液中，立刻注入冻干容器内。
(4)冷冻干燥：将混合后的胶原微球与壳聚糖溶液进行冷冻干燥，冻干后的膜状材料含水量低于5％。
制备的材料为胶原微球和壳聚糖复合的止血材料，其内部网格结构均一，1cm宽的止血海绵条能够承受10n拉力，1min不断裂；液体吸收量为自身重量15倍左右，能够快速止血且无碎片；填充止血两个月后仍能肉眼观察到大部分材料，长于胶原海绵，且无明显的炎症反应。