一种大鼠体内引入稳定同位素示踪剂的方法与流程

本发明涉及稳定同位素示踪技术，具体涉及一种大鼠体内引入稳定同位素示踪剂的方法。

背景技术：

稳定同位素是天然存在于生物体内的不具有放射性的一类同位素，其原子核结构是稳定的，不会自发的放出射线而使核结构发生改变。20世纪70年代初被成功引入生物学的多个研究领域，如光合作用途径的研究、光能利用率、植物水分利用率、物质代谢和生物量变化等。稳定同位素示踪技术可对所研究的代谢通路中的前体物质进行特异性标记（如¹³c-葡萄糖、¹⁵n-谷氨酰胺等），通过示踪原子示踪标记化合物在机体内的变化规律，根据其中间代谢产物的同位素峰分布特征确证具体的代谢途径，探索疾病形成的机理，寻求预防和治疗疾病的有效途径，为疾病的作用机制研究提供新的方法，为药物靶点的发现和新药研发提供新的思路。

目前国内外大多以细胞为对象进行研究，尚无实验动物的研究报道。而人类疾病的发生发展均十分复杂，细胞试验（包括离体器官试验等）离开了体内内环境的调控，所得结果不能完全反映人类疾病发生的机制。实验动物因其自身的代谢系统与人类高度相似，能很好反映人类体内的代谢特征，利用大鼠模型研究人类疾病能更准确全面理解疾病的发生机制。因此，本发明提供的一种大鼠体内引入稳定同位素示踪剂的方法十分必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大鼠体内引入稳定同位素示踪剂的方法，该方法可用于精准阐明疾病代谢紊乱的具体代谢路径，为探究疾病的作用机制以及药物靶点的发现和新药研发提供新的思路。

本发明提供的一种大鼠体内引入稳定同位素示踪剂的方法，包括如下步骤：

（1）稳定同位素示踪剂种类的选择：根据所研究的代谢通路进行选择，对代谢通路的前体物质进行稳定同位素标记，如¹³c-葡萄糖、¹⁵n-谷氨酰胺、¹³c-棕榈酸等；

（2）稳定同位素示踪剂溶液的配置：称取适量稳定同位素示踪剂粉末，溶于生理盐水配置稳定同位素示踪剂溶液（稳定同位素示踪剂溶液浓度：0.168-0.420mg/ml）；

（3）稳定同位素示踪剂引入时间的确定：采用sd大鼠，连续尾静脉推注9.0h，每隔1.5h进行一次眼眶采血（0.5-1.0ml），稳定同位素峰在5.5-6.5h达到稳态，即为最佳引入时间；

（4）稳定同位素示踪剂引入剂量的确定：采用sd大鼠，设置不同剂量组（4.0-10.0mg/kg·min）分别进行尾静脉推注，连续推注6.0h后，7.5-8.5mg/kg·min剂量下的稳定同位素峰较高，即为最佳引入剂量。

所述方法可在大鼠的血液样本中明显检测到同位素峰，为精准阐明疾病代谢紊乱的具体代谢路径提供技术支持。

本发明提供了一种大鼠体内引入稳定同位素示踪剂的方法，相对于细胞水平的稳定同位素示踪研究，以实验动物的稳定同位素示踪研究能全面反映人类疾病的发生机制，精准阐明疾病发生紊乱的具体代谢路径，为探究疾病的作用机制提供新的方法，同时也为药物靶点的发现和新药研发提供新的思路。

附图说明

图1为稳定同位素示踪剂引入装置

图2为大鼠血清中葡萄糖的同位素峰分布；图中：上图为标记¹³c6-葡萄糖前，下图为标记¹³c6-葡萄糖后

图3为稳定同位素示踪剂引入时间确定（以丙酮酸为例说明）

图4为稳定同位素示踪剂引入剂量确定（以丙酮酸为例说明）

图5为稳定同位素峰（m+3）占总峰面积的比例（以丙酮酸为例说明）。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。这些实施例仅用来说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例所用稳定同位素示踪剂为¹³c6-葡萄糖。

实施例1稳定同位素示踪剂引入时间的确定

（1）稳定同位素示踪剂种类的选择：根据所研究的代谢通路进行选择，对能量代谢的前体物质葡萄糖进行稳定同位素标记（¹³c6-葡萄糖）；

（2）稳定同位素示踪剂溶液的配置：称取¹³c6-葡萄糖粉末2.50g于5.0ml容量瓶中，用生理盐水溶解后稀释至刻线，配置稳定同位素示踪剂溶液（按剂量8.0mg/kg·min进行配置）；

（3）稳定同位素示踪剂引入装置的组装：微量注射针吸取5.0ml稳定同位素示踪剂溶液，与一次性静脉注射器进行连接，排除气泡后备用。将sd大鼠（0.35kg）固定于固定器中，用一次性静脉注射器穿刺大鼠尾静脉血管，轻轻抽拉微量注射针，回血后放置微量注射泵上固定，设置参数（流速=8.33μl/min）后进行尾静脉推注；

（4）稳定同位素示踪剂引入时间的确定：连续尾静脉推注9.0h，每隔1.5h进行一次眼眶采血（0.8ml），静置0.5h后，4℃下3000rpm离心10min后备用。

结果表明，经lc-ms分析，稳定同位素峰在6.0h达到稳态，即为最佳引入时间。

实施例2稳定同位素示踪剂引入剂量的确定

（1）稳定同位素示踪剂种类的选择：根据所研究的代谢通路进行选择，对能量代谢的前体物质葡萄糖进行稳定同位素标记（¹³c6-葡萄糖）；

（2）稳定同位素示踪剂溶液的配置：分别称取¹³c6-葡萄糖粉末0.84g、1.26g、1.68g、2.10g于4个5.0ml容量瓶中，分别用生理盐水溶解后稀释至刻线，配置4个不同剂量的稳定同位素示踪剂溶液；

（3）稳定同位素示踪剂引入装置的组装：4个微量注射针分别吸取5.0ml稳定同位素示踪剂溶液，与一次性静脉注射器进行连接，排除气泡后备用。将4只sd大鼠（均约0.35kg）分别固定于固定器中，用一次性静脉注射器穿刺大鼠尾静脉血管，轻轻抽拉微量注射针，回血后放置微量注射泵上固定，设置参数（流速=8.33μl/min）后进行尾静脉推注；

（4）稳定同位素示踪剂引入剂量的确定：4个剂量组（4.0mg/kg·min、6.0mg/kg·min、8.0mg/kg·min、10.0mg/kg·min）分别对4只sd大鼠进行尾静脉推注，连续尾静脉推注6.0h后立即眼眶采血（0.8ml），麻醉后进行腹主动脉取血，静置0.5h后，4℃下3000rpm离心10min后备用。

结果表明，经lc-ms分析，连续尾静脉推注6.0h，剂量10.0mg/kg·min下的稳定同位素峰（m+3）占总峰面积的比例最大，但其增加率却开始明显减缓。综合考虑，剂量8.0mg/kg·min占总峰面积的比例仅次于剂量10.0mg/kg·min，且其增加率没有明显减缓，故确定剂量8.0mg/kg·min为最佳引入剂量。

以上所述，仅为本发明较佳的实施例，本发明的保护范围不应局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其方案构思加以等同替换及改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。