九味羌活制剂在制备抗单纯疱疹病毒药物中的用途的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及一种中药制剂在制备抗单纯疱疹病毒药物中的用途。
背景技术：
：单纯疱疹是一种由单纯疱疹病毒所致的病毒性皮肤病，中医称为热疮。单纯疱疹病毒属于痗疫病毒科α病毒亚科，为dna病毒，有i型和ii型2种血清型，人类是其唯一宿主。i型单纯疱疹病毒(hsv-1)主要感染面部的皮肤和粘膜，引起疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、口龈炎、咽炎或扁桃体炎和皮肤疱瘆性湿疼等。据统计，目前人群中hsv-1血清型阳性较高，大约为90％。具有嗜神经性，能在中枢神经系统中建立潜伏感染，且在免疫低下等情况下复发。单纯疱疹病毒性脑炎，是hsv侵犯中枢神经系统引起相应的炎性改变，是中枢神经系统最常见的病毒感染性疾病，研究表明，hsv-1是常见的中枢神经系统感染病原体，由hsv-1感染引起的神经性脑炎的发病率逐年增高，在缺乏治疗的情况下可达70％的致死率，其引起的临床病死率高，预后差，患者常遗留较多的神经功能缺损。流行病学调查表明病毒性角膜炎以单纯疱疹病毒感染最为常见，其中hsv-1致病率高达90％以上，是疱疹病毒中，引起眼疾最多的病原体。该病病程长、反复发作，最终可以导致角膜白斑、角膜新生血管增生、角膜溃疡甚至穿孔等而严重危害患者的视功能。目前尚无有效控制复发的药物，其治疗困难，已成为眼科最棘手的问题。反复发作后角膜混浊逐渐加重，最终导致失明。hsv-1感染与神经退行性疾病如阿尔茨海默病等的发生发展密切相关，也是hiv并发感染的主要病原体。九味羌活制剂是由羌活、防风、苍术、细辛、川芎、白芷、黄芩、甘草、地黄等九味中药制成的制剂，具有疏风解表，散寒除湿的功效，用于外感风寒挟湿所致的感冒，症见恶寒、发热、无汗、头痛、口干、肢体酸痛等。但目前尚未有九味羌活制剂抗单纯疱疹病毒的报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供九味羌活制剂在制药中的新用途。九味羌活制剂在制药中的新用途是：九味羌活制剂在制备抗单纯疱疹病毒药物中的用途。所述九味羌活制剂包括如下重量份的原料药：羌活20-40份，防风20-40份，苍术20-40份，细辛5-15份，川芎10-30份，白芷10-30份，黄芩10-30份，甘草10-30份，地黄10-30份。优选的，所述九味羌活制剂包括如下重量份的原料药：羌活30份，防风30份，苍术30份，细辛10份，川芎20份，白芷20份，黄芩20份，甘草20份，地黄20份。所述九味羌活制剂的剂型包括丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液剂、喷雾剂。所述九味羌活制剂的剂型优选为喷雾剂。本发明所涉及的九味羌活制剂对单纯疱疹病毒具有明显的抑制作用，具有毒性小、作用强、安全有效等优点，为由单纯疱疹病毒引起的疾病的预防和治疗开辟了新的途径，具有重要的社会价值、经济价值。为了公众能更好的理解本发明的有益效果，下面将通过实施例和体外细胞实验进一步阐明。附图说明图1是九味羌活喷雾剂对细胞产生毒性作用前后的显微照片对比。图2是药物对单纯疱疹病毒体外抑制作用显微照片对比。具体实施方式下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。实施例1九味羌活喷雾剂制备受试药物：九味羌活喷雾剂。所述受试药物的具体制备方法由以下步骤组成：羌活400g、防风400g、苍术400g、细辛150g、川芎300g、白芷300g提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。药渣与黄芩300g、甘草300g、地黄300g加水煎煮二次，每次1小时；合并上述煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.08～1.13，加乙醇使含醇量达50％，静置，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约900ml，加入上述挥发油和药用辅料，混匀，加水调整总量至1000ml,即得九味羌活喷雾剂样品1。实施例2九味羌活喷雾剂制备受试药物：九味羌活喷雾剂。所述受试药物的具体制备方法由以下步骤组成：羌活300g、防风300g、苍术300g、细辛100g、川芎200g、白芷200g提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。药渣与黄芩200g、甘草200g、地黄200g加水煎煮二次，每次1小时；合并上述煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.08～1.13，加乙醇使含醇量达50％，静置，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约900ml，加入上述挥发油和药用辅料，混匀，加水调整总量至1000ml,即得九味羌活喷雾剂样品2。实施例3九味羌活喷雾剂制备受试药物：九味羌活喷雾剂。所述受试药物的具体制备方法由以下步骤组成：羌活200g、防风200g、苍术200g、细辛50g、川芎100g、白芷100g提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。药渣与黄芩100g、甘草100g、地黄100g加水煎煮二次，每次1小时；合并上述煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.08～1.13，加乙醇使含醇量达50％，静置，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约900ml，加入上述挥发油和药用辅料，混匀，加水调整总量至1000ml,即得九味羌活喷雾剂样品3。实施例4九味羌活喷雾剂体外抗病毒实验细胞与病毒hep-2(人喉癌细胞)由山东省医学科学院微生物室提供；hsv1(单纯疱疹病毒)由山东省医学科学院微生物室提供；利巴韦林(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：110602304)主要仪器超净工作台(济南隆宏公司)；酶标仪(芬兰雷勃公司产品)；低温高速离心机(贺立氏台式低温离心机)；倒置显微镜(olympus公司)；高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司mj37600)；纯水机(济南太平玛环保有限公司)；co2细胞恒温培养箱(美国fomas公司)主要试剂及配置2％细胞维持液：改良型rpmi-1640液500ml，加入10ml新生牛血清(四季青)。10％1640细胞培养液：改良型rpmi-1640液500ml，加入50ml新生牛血清，双抗2ml，混匀，置4℃冰箱，备用。双抗：取l00wu链霉素溶于5ml蒸馏水中，弃去1ml；将80wu青霉素溶于76ml蒸馏水中，与余4ml链霉素相混匀，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装于ep管，置于-20℃冰箱备用。pbs：hyclone产品消化液：0.25％trypsin-edtamtt染色剂：取mtt粉末0.5g，溶于100mlpbs中，0.22微米滤膜过滤除菌，每管1ml分装于ep管，置于-20℃冰箱备用。脱色剂：dmso细胞的复苏及培养：hep2冻存管从液氮罐取出，立即投入37℃～42℃温水中融化，超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，800r/min，5min，弃冻存液，加入5ml浓度10％的1640细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。病毒的扩增：将hsv-1病毒接种于己经长成单层的hep-2细胞上，加1640维持液5ml置37℃、5％co2病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现80％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，1000r/min，5min，取上清液定量分装于冻存管中，封口膜封口，放于-80℃冰箱冻存备用。病毒毒力的测定：将病毒用1640维持液做10倍比系列稀释不同浓度，纵向重复4孔，依次接种于己长成单层的hep-2细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％co2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察24h，加5mg/mlmtt10μl，37℃、5％co2培养箱中4小时，吸弃染液，加dmso100μl，室温脱色l0min，用酶标仪在490mn波长测定od值。根据reed-muench公式计算病毒液的半数感染浓度tcid50。细胞存活率＝各组od值/正常细胞od值×100％细胞病变率＝1－细胞存活率细胞比距＝(高于50％病变率－50％)/(高于50％病变率－低于50％病变率)×100％tcid50＝antilg(ig高于50％cpe百分率病毒稀释度+比距×稀释对数间的差)测定结果显示hsv-1病毒tcid50为10-4.31。实验时用100个tcid50作为病毒液浓度，因此需将病毒原液稀释200倍用于实验。药物对细胞毒性测定：九味羌活喷雾剂用1640维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长成单层rd细胞的96孔板中，并设3个复孔及细胞对照孔；37℃、5％co2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，连续观察3d，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性，mtt染色，用酶标仪在490nm波长测定od值，应用reed-muench公式计算药物半数中毒浓度(tc50)，并确定最小无毒浓度(tc0)。tc50＝[antilog(log高于50％cpe百分率病毒稀释度+比距)]×c抗hsv-1病毒实验：九味羌活喷雾剂从无毒浓度起用1640二倍比系列稀释10个浓度，每孔100μl接种于已长成单层hep-2细胞的96板孔中，每孔再加入100μl的hsv-1病毒液，同时设阿昔洛韦阳性对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每设3个复孔。5％co2培养箱中培养，观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，mtt染色，并用酶标仪在490nm波长测定od值。应用reed-muench方法计算药物半数有效浓度(ec50)和治疗指数(ti)。ec50＝[antilog(log高于50％cpe百分率药物稀释度的值-比距)]×cti＝半数毒性浓度(tc50)/半数有效浓度(ec50)具体结果如下：病毒感染24小时后病毒组开始出现病变，药物组也开始显现病变，细胞在无毒浓度范围内随着药物浓度的降低，hsv-1感染细胞表现明显，细胞间变圆、破碎、脱落，24小时病毒对照组90％病变，药物组几个浓度梯度孔被完全保护，细胞生长良好。各组药物的治疗指数如下：ti指数九味羌活喷雾剂样品1266.9九味羌活喷雾剂样品2298.5九味羌活喷雾剂样品3273.7阿昔洛韦321.3当前第1页12