具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法及应用与流程

本发明涉及功能化石墨烯材料，具体涉及一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法及应用。

背景技术：

皮肤创面细菌感染，一直是烧、创伤救治的重大挑战，目前针对细菌感染，仍然主要依赖于抗生素治疗，但临床抗生素治疗常常伴随着多重耐药菌株的出现与流行，由于缺乏新的抗生素，一些泛耐药的菌株，尤其是多重耐药革兰阴性杆菌，甚至出现“无药可治”的状况。皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染已经成为临床抗感染治疗的一大棘手问题，由于传统抗生素治疗难以奏效，因此，我们迫切需要寻找一些新的治疗策略来解决该问题。

光热治疗作为替代治疗之一，具有无创或微创性、可控性、良好的抗菌效率、不会产生耐药性等诸多优势，已成为近年的研究热点。最近，金纳米粒子、金纳米棒、铜纳米粒子、聚多巴胺等众多重金属纳米材料、高分子聚合物及其复合物均成功应用于光热抗菌治疗，显示出卓越的杀菌能力与良好的应用前景。然而，目前光热治疗的关键问题在于光热剂对细菌无靶向性，不能结合到病原菌上对其直接进行加热杀灭，难以避免对周围正常组织造成副损伤。

石墨烯，是一种只有单原子厚度的、蜂窝状晶格的碳基二维材料。作为一种良好的光热剂，基于石墨烯的光热治疗目前已经成功应用于抗菌领域。与其他光热剂相比，石墨烯可与多种小分子、聚合物发生交联，功能化方法简单，容易通过简单的化学反应优化石墨烯作为光热剂的特性。并且，石墨烯在体内外均具有良好的生物相容性，不会对正常组织、细胞产生强烈毒性。同时，与球形纳米粒子或圆柱形的纳米棒相比，片层状的石墨烯具有较大的比表面积，可与细菌充分接触、包裹，进而提高光热效率与抗菌效率。

针对病原菌与光热抗菌材料之间的特异性作用问题，静电相互作用和硼酸分子共价结合被分别视为代表性的“物理靶向”与“化学靶向”策略。细菌细胞壁上含有大量阴离子磷脂或磷壁酸，因而表面带有负电荷。研究证实，将不同的阳离子聚合物或多肽整合入纳米粒子，可以通过静电相互作用与表面带有负电荷的细菌紧密结合，从而实现材料与细菌的物理靶向结合作用，进而实现靶向抗菌的目。硼酸分子通过与多糖顺式邻羟基发生共价酯化反应，能够识别识别多糖并与多糖特异结合。最近，galstyan等利用硼酸分子可与多糖特异性共价结合的特性，制备了一种硼酸功能化的光敏剂，在体外条件下能够直接靶向大肠杆菌胞壁脂多糖及胞外生物膜基质多糖成分，极大地提高了光动力治疗的抗菌效率。另外，硼酸功能化可降低材料毒性、提高体内稳定性，目前已成功应用于医疗器械的表面修饰。

综上，以石墨烯作为光热基底材料，通过对石墨烯的功能化实现材料对细菌的“物理靶向”与“化学靶向”，制备一种安全、高效的新型靶向纳米抗菌材料，能够为治疗皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染提供新思路、新策略。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法及应用，其具有高效靶向细菌及光热杀伤细菌的能力，生物相容性良好，制备方法简单，能够有效治疗多重耐药革兰阴性杆菌皮肤创面感染并促进皮肤感染创面的愈合。

本发明所述的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，所述方法是通过选择羧基化石墨烯，基于氨基与羧基的缩合反应通过共价交联引入3-氨基吡啶，然后基于季铵化反应引入3-溴甲基苯硼酸，接枝硼酸基团及季铵盐基团，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料，其包括如下步骤：

步骤一：将1~5重量份羧基化石墨烯、0.5~2重量份edc、0.5~2重量份nhs和5~20重量份去离子水均匀混合，室温条件下搅拌4~12小时，得到混合液；edc指的是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，nhs指的是n-羟基琥珀酰亚胺；

步骤二：将1~5重量份3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌24~48小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，使用去离子水洗涤；

步骤四：将步骤三得到的产物以5~20重量份dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入1~5重量份3-溴甲基苯硼酸，在温度为50~100℃的油浴条件下搅拌6~12小时，得到悬液c；dmf指的是n，n-二甲基甲酰胺；

步骤五：对悬液c进行离心处理，使用去离子水洗涤，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

进一步，所述步骤三和步骤五中的离心处理工艺参数为：离心转速为10000~15000转/分，离心时间为60~90分钟。

进一步，所述步骤三和步骤五中的离心处理工艺参数为：离心转速为11000转/分，离心时间为90分钟。

进一步，所述步骤一中羧基化石墨烯为2重量份，edc为0.6重量份，nhs为0.6重量份，去离子水为10重量份；

所述步骤二中3-氨基吡啶为2重量份；

所述步骤四中dmf为10重量份，3-溴甲基苯硼酸为2重量份。

进一步，所述步骤五中得到的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料呈片状，片层厚度为1.1~1.4nm，粒径为150~250nm。

由上述的制备方法得到的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料在多重耐药革兰阴性杆菌皮肤感染中的应用。

进一步，所述皮肤感染为皮下脓肿或皮肤创面感染。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

1、本发明通过选择羧基化石墨烯，基于氨基与羧基的缩合反应通过共价交联引入3-氨基吡啶，然后基于季铵化反应引入3-溴甲基苯硼酸，接枝硼酸基团及季铵盐基团，获得硼酸功能化石墨烯材料，具有高效靶向细菌的能力，实现了对细菌的靶向杀伤，且具有良好的生物相容性，毒副作用小。

2、本发明的制备方法条件温和，操作简单。

3、本发明的硼酸功能化石墨烯材料能够靶向光热杀菌，抗菌效率高，能够有效治疗多重耐药革兰阴性杆菌皮肤感染。

附图说明

图1是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的透射电子显微镜照片；

图2是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的原子力显微镜照片；

图3是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的细胞相容性实验的结果统计图；

图4是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的靶向细菌能力检测实验的结果统计图；

图5是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的多重耐药铜绿假单胞菌抗菌实验的典型平板培养图；

图6是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的多重耐药铜绿假单胞菌抗菌数据统计图；

图7是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的动物皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染治疗效果测试的创面照片；

图8是本发明实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的动物皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染治疗效果测试的创面愈合率统计图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。

原料来源：羧基化石墨烯购买自南京先丰纳米材料科技有限公司，n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n,n-二甲基甲酰胺（dmf）、3-氨基吡啶以及3-溴甲基苯硼酸购买自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

实施例一：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将2mg羧基化石墨烯、0.6mg的edc、0.6mg的nhs和10ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌4小时，得到混合液；

步骤二：将2mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌24小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为11000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以10ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入2mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为50℃的油浴条件下搅拌12小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为13000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例二：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将2mg羧基化石墨烯、0.6mg的edc、0.6mg的nhs和10ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌8小时，得到混合液；

步骤二：将2mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌24小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为11000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以10ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入2mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为50℃的油浴条件下搅拌6小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为13000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例三：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将2mg羧基化石墨烯、0.6mg的edc、0.6mg的nhs和10ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌4小时，得到混合液；

步骤二：将2mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌24小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为11000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以10ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入2mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为90℃的油浴条件下搅拌12小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为13000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例四：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将2mg羧基化石墨烯、0.6mg的edc、0.6mg的nhs和10ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌4小时，得到混合液；

步骤二：将2mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌24小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为11000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以10ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入2mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为90℃的油浴条件下搅拌6小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为13000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例五：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将1mg羧基化石墨烯、1mgedc、1mgnhs和20ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌6小时，得到混合液；

步骤二：将1mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌30小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为10000转/分，离心80分钟，再使用去离子水反复洗涤产物4次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以15ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入5mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为50℃的油浴条件下搅拌12小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为11000转/分，离心60分钟，再使用去离子水反复洗涤产物4次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例六：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将5mg羧基化石墨烯、2mg的edc、2mg的nhs和20ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌12小时，得到混合液；

步骤二：将5mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌48小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为15000转/分，离心60分钟，再使用去离子水反复洗涤产物5次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以20ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入5mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为100℃的油浴条件下搅拌6小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为15000转/分，离心60分钟，再使用去离子水反复洗涤产物5次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例七：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将3mg羧基化石墨烯、1.5mg的edc、1.5mg的nhs和15ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌10小时，得到混合液；

步骤二：将3.5mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌30小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为14000转/分，离心75分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以15ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入2.5mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为80℃的油浴条件下搅拌12小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为14000转/分，离心75分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例八：一种具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料的制备方法，其包括如下步骤：

步骤一：将2mg羧基化石墨烯、0.6mg的edc、0.6mg的nhs和10ml去离子水均匀混合，室温条件下搅拌4小时，得到混合液；

步骤二：将2mg的3-氨基吡啶加入到混合液中，室温条件下搅拌48小时，得到悬液a；

步骤三：对悬液a进行离心处理，离心转速为11000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质；

步骤四：将步骤三得到的产物以10ml的dmf重悬，得到悬液b，向悬液b中加入2mg的3-溴甲基苯硼酸，在温度为90℃的油浴条件下搅拌6小时，得到悬液c；

步骤五：对悬液c进行离心处理，离心转速为13000转/分，离心90分钟，再使用去离子水反复洗涤产物3次，去除杂质，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料。

实施例九：对实施八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料进行形貌结构观察，使用透射电子显微镜及原子力显微镜观察，参见图1和图2，得到具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料呈薄片状，平均厚度为1.4nm，长度为250nm。

实施例十：对实施八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料进行细胞相容性检测实验。

实验分组：将具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料溶于溶剂中，得到浓度为0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.5mg/ml的溶液；对照组：无菌pbs缓冲液。

实验步骤：在96孔培养板中接种适量小鼠3t3细胞（100μl/孔），将培养板在培养箱中培养至细胞贴壁，培养环境：温度为37℃以及5%co2。以不同浓度功能化石墨烯纳米材料为实验组，以无菌pbs缓冲液为对照组，以不含细胞的空白孔为空白对照。在培养板不同培养孔中分别加入不同浓度硼酸功能化石墨烯纳米材料及无菌pbs缓冲液，继续培养1天、3天、5天。向每孔中加入10μl的cck8试剂，培养4h后，以酶标仪测定450nm吸光度。按照公式计算细胞存活率，并绘制柱状图，所述公式为：

细胞存活率（%）=[(as-ab)/(ac-ab)]×100%，其中as为实验孔，ac为对照孔，ab为空白孔。

参见图3，所示的硼酸功能化石墨烯纳米材料的细胞相容性实验的结果统计，其表明：细胞活性检测显示实验组与对照组无明显差异，提示功能化石墨烯纳米材料未引起明显细胞毒性，具有较好的细胞相容性。

实施例十一：对实施八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料进行细胞相容性检测实验。

首先将菌株置于培养基中，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下摇动过夜，预培养到指数生长期。然后，将经过洗涤的细菌细胞重悬于无菌pbs缓冲液中，并将600nm处光密度调节至0.4~0.5，大致对应于菌液浓度107-108cfu/ml。

实验分组，实验组：实施八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料；对照组：羧基化石墨烯混悬液和无菌pbs缓冲液。取上述菌液800μl，分别加入200μl硼酸功能化石墨烯纳米材料、羧基化石墨烯混悬液及无菌pbs缓冲液，并使硼酸功能化石墨烯纳米材料及羧基化石墨烯混悬液的最终浓度为0.2mg/ml。上述混悬液充分混合后在37℃下静置30分钟，吸取上清液测定600nm处吸光度，并绘制柱状图。

参见图4，所示的硼酸功能化石墨烯纳米材料的靶向细菌能力检测实验的结果统计，其表明：硼酸功能化石墨烯纳米材料能够使细菌混悬液分层沉淀，说明其能够与细菌结合，对细菌具有靶向作用。

实施例十二：将实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料以标准平板计数法进行多重耐药鲍曼不动杆菌、多重耐药肺炎克雷伯菌及多重耐药铜绿假单胞菌光热靶向杀菌性能检测。

将菌株置于培养基中，在温度为37℃转速为220rpm的条件下摇动过夜，预培养到指数生长期。然后，将经过洗涤的细菌细胞重悬于无菌pbs缓冲液中，并将600nm处光密度调节至0.4~0.5，大致对应于菌液浓度107-108cfu/ml。

实验分组，实验组：硼酸功能化石墨烯纳米材料；对照组：羧基化石墨烯混悬液和无菌pbs缓冲液。取上述菌液800μl，分别加入200μl硼酸功能化石墨烯纳米材料、羧基化石墨烯混悬液及无菌pbs缓冲液，并使硼酸功能化石墨烯纳米材料及羧基化石墨烯混悬液的最终浓度为0.2mg/ml。在温度为37℃的条件下震荡30分钟，然后将上述混合液以无菌pbs缓冲液反复洗涤3次，并以1ml无菌pbs缓冲液重悬。以808nm近红外激光（0.5w/cm²）照射上述重悬液10分钟。而后，将处理后的细菌混悬液适当稀释，取等量菌液均匀涂布于lb琼脂平板上，以未经处理的菌液涂板作为空白对照，37℃孵育18h后进行菌落计数，从而估计治疗对细菌的杀伤程度，按如下公式计算：

细菌活力损失（%）=[1－（空白对照计数－实验组计数）/空白对照计数]×100％。

参见图5和图6，结果表明：与羧基化石墨烯相比，硼酸功能化石墨烯纳米材料对多重耐药鲍曼不动杆菌、多重耐药肺炎克雷伯菌及多重耐药铜绿假单胞菌都具有良好的光热杀菌能力，硼酸功能化石墨烯纳米材料能够靶向结合细菌，从而实现对细菌的光热杀伤作用。

实施例十二：对实施例八制得的具有靶向光热杀菌性能的硼酸功能化石墨烯材料进行动物皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染治疗效果测试。

balb/c小鼠（购自第三军医大学实验动物中心）皮肤多重耐药革兰阴性杆菌感染创面模型制备方法如下：小鼠予1%戊巴比妥钠腹腔注射（100mg/kg，0.01ml/g）麻醉。手术前1天仔细取出每只小鼠的背部毛发。暴露的皮肤用75％（v/v）乙醇灭菌，然后冲压成直径为6mm圆形的全层缺损伤口。将50μl多重耐药铜绿假单胞菌（108cfu/ml）滴于全层缺损伤口，并以无菌伤口贴膜覆盖。

实验分组，实验组：硼酸功能化石墨烯纳米材料；对照组：羧基化石墨烯和无菌pbs缓冲液。

术后24小时将无菌pbs缓冲液或100μl浓度为0.2mg/ml硼酸功能化石墨烯纳米材料注射于感染创面，注射后6小时予808nm激光（0.5w/cm²）照射10分钟。将直径为6mm的无菌圆形标记放置在每个感染伤口的旁边，并使用数码相机立即拍摄伤口，无菌圆形标记用于表示初始伤口面积。更换伤口敷料，并在术后第1，3，5和7天拍照伤口，使用imageproplus6.0软件仔细追踪每个伤口和标记的边缘，并计算包含跟踪区域的像素数，然后将像素数转换为平方毫米，伤口使用公式计算封闭率，所述公式为：创面愈合率=（原始创面面积－残余创面面积）/原始创面面积。

参见图7和图8，结果表明：硼酸功能化石墨烯纳米材料能有效治疗皮肤创面多重耐药革兰阴性杆菌感染，从而促进创面愈合，缩短愈合时间。