卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在抑制肝癌细胞增殖中的应用的制作方法

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及卤化ⅱ型聚酮类抗生素在抑制肝癌细胞增殖中的应用。

背景技术：

肝癌严重威胁人类生命健康，探索治疗肝癌新方法是世界性难题。原发性肝癌(primaryhepaticcarcinoma,phc)，是世界上常见的恶性肝癌之一。每年全球新患phc人数为62.6万人，因phc死亡者高达59.8万人，位居全球恶性肝癌发病率第6位，死亡原因第3位。而新发肝癌病例中55％发生于中国，并且肝癌病死率在各种癌症病死率中居第2位。基于肝癌对国民健康构成严重威胁，探索更为有效的治疗方法是一个亟待解决的世界性问题。申请号为201610394737.5，公开号为cn106167495a，名称为一种卤化ii型聚酮类抗生素、制备方法及其应用的专利公开了一种卤化ⅱ型聚酮类抗生素，抗肝癌活性测试表明该对肝癌不同来源的细胞株都表现出了很好的抗肝癌活性，为临床研究提供了很高的研究价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供卤化ⅱ型聚酮类抗生素在抑制肝癌细胞增殖中的应用，对抑制肝癌细胞增殖有显著效果。

本发明所采用的技术方案是，卤化ⅱ型聚酮类抗生素在抑制肝癌细胞增殖中的应用。

本发明的其他特征还在于，

具体涉及卤化ⅱ型聚酮类抗生素在抑制hepg2肝癌细胞增殖中的应用。

具体涉及卤化ⅱ型聚酮类抗生素在抑制hep1肝癌细胞增殖中的应用。

具体涉及卤化ⅱ型聚酮类抗生素在抑制mhcc97h肝癌细胞增殖中的应用。

卤化ⅱ型聚酮类抗生素的结构为：

本发明的有益效果为，通过将卤化ⅱ型聚酮类抗生素用于临床治疗肝癌疾病，可以抑制肝癌细胞增殖，为治疗肝癌的临床研究提供了非常高的研究价值。

附图说明

图1为1.0μmol/l的a亚基lfa-1a/itgal与不同浓度卤化ⅱ型聚酮类抗生素结合的荧光淬灭效果分析图；

图2为卤化ⅱ型聚酮类抗生素对pparγ基因表达影响情况分析图；

图3为卤化ⅱ型聚酮类抗生素对mapk基因表达影响情况分析图；

图4为卤化ⅱ型聚酮类抗生素对creb基因表达影响情况分析图；

图5为卤化ⅱ型聚酮类抗生素对gsk3b基因表达影响情况分析图；

图6为hepg2肝癌细胞给药前显微镜下细胞数量图；

图7为hepg2肝癌细胞给药后显微镜下细胞数量图；

图8为hep1肝癌细胞给药前显微镜下细胞数量图；

图9为hep1肝癌细胞给药后显微镜下细胞数量图；

图10为mhcc97h肝癌细胞给药前显微镜下细胞数量图；

图11为mhcc97h肝癌细胞给药后显微镜下细胞数量图；

图12为l02正常肝细胞给药前显微镜下细胞数量图；

图13为l02正常肝细胞给药后显微镜下细胞数量图；

图14为不同浓度的卤化ⅱ型聚酮类抗生素对hepg2肝癌细胞存活率的影响图；

图15为不同浓度的卤化ⅱ型聚酮类抗生素对hep1肝癌细胞存活率的影响图；

图16为不同浓度的卤化ⅱ型聚酮类抗生素对mhcc97h肝癌细胞存活率的影响图；

图17为不同浓度的卤化ⅱ型聚酮类抗生素对l02正常肝细胞存活率的影响图；

具体实施方式

本发明基于卤化ⅱ型聚酮类抗生素对肝癌细胞增殖抑制效应的分析，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

整合素调控肝癌生长、侵袭和转移，是肝癌靶向药物治疗的重要靶点，卤化ⅱ型聚酮类抗生素通过与肝癌细胞表面受体整合素a亚基lfa-1a/itgal结合，激动整合素lfa-1，从而使pi3k/akt通路下游促进肝癌细胞凋亡和分裂的pparγ基因、mapk基因、creb基因以及gsk3b基因的基因表达水平提高，加速肝癌细胞的凋亡和分裂，达到抑制肝癌细胞增殖的作用。

如图1所示，图中的曲线从上到下依次代表1.0μmol/l的a亚基lfa-1a/itgal分别与0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9μmol/l的卤化ⅱ型聚酮类抗生素的荧光淬灭效果分析，从图中可以看出，随着卤化ⅱ型聚酮类抗生素浓度的增加，荧光强度越来越弱，因此，可以判断随着卤化ⅱ型聚酮类抗生素浓度的增加，含有整合素a亚基lfa-1a/itgal的蛋白质被结合的越来越多，剩余的蛋白质含量越来越少，表明卤化ⅱ型聚酮类抗生素与a亚基lfa-1a/itgal之间存在相互作用。

如图2至5所示，control代表不加卤化ⅱ型聚酮类抗生素的细胞对照；8h、12h、16h代表向细胞加入浓度为20μm/ml的卤化ⅱ型聚酮类抗生素孵育8h、12h、16h。

pparγ基因、mapk基因、creb基因以及gsk3b基因均为pi3k/akt通路的下游基因，且以上四种基因均是肝癌细胞的促凋亡基因，从图中可以看出，加入卤化ⅱ型聚酮类抗生素后，parγ基因、mapk基因、creb基因以及gsk3b的基因表达水平均有明显的提高，从而可以判断卤化ⅱ型聚酮类抗生素可以提升pparγ基因、mapk基因、creb基因以及gsk3b基因的基因表达水平

为了更好的理解本发明的实质，下面将用卤化ⅱ型聚酮类抗生素的药理实验来说明其在抑制肝癌细胞增殖中的应用。

(1)细胞复苏：取出-80℃冻存的人体肝癌细胞株hepg2、hep1、mhcc97h和正常肝细胞l02，迅速放入37℃水浴中解冻；将细胞悬液转移至含2ml的完全培养基的15ml离心管中，800rpm，离心3min。取1ml完全培养基重新悬浮沉淀的细胞，并转移至含3ml完全培养基的细胞培养瓶中吹散均匀，置于37℃co2培养箱培养。

(2)细胞传代：弃去培养瓶中的培养基，pbs液清洗2次，加入1ml0.25％胰蛋白酶消化倒置显微镜下观察细胞形态，收缩变圆时用3ml完全培养培养基终止消化。轻轻吹散细胞培养瓶内的贴壁细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管，800rpm，离心3min。取1ml完全培养基重新悬浮沉淀的细胞，并转移至含3ml完全培养基的细胞培养瓶中吹散均匀，置于37℃、5％co2培养箱中培养。

(3)细胞冻存：取出铺展至细胞培养瓶底部面积80％的细胞，pbs清洗2次，加入1ml0.25％胰蛋白酶消化倒置显微镜下观察细胞形态，收缩变圆时用3ml完全培养培养基终止消化。轻轻吹散细胞培养瓶内的贴壁细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管，800rpm，离心3min。细胞沉淀用1ml冻存液重新悬浮后转移至1.8ml冻存管内，4℃放置30min，-20℃放置1h，置于-80℃保存。

(4)细胞给药：取出传代的细胞，弃掉培养瓶内的培养基，pbs清洗2次，加入1ml0.25％胰蛋白酶消化，当细胞收缩变圆时，3ml完全培养培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使细胞培养瓶内的贴壁细胞充分脱落，收集细胞悬液转移至15ml离心管，800rpm，离心3min。细胞沉淀用完全培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，取100μl细胞悬液，分别加入96孔板培养孔，置于37℃co2培养箱培养24h。待细胞生长至培养孔的80％时，取6μl的卤化ⅱ型聚酮类抗生素母液加入到1.5ml离心管中，用完全培养基稀释至1ml。依次将该药物孔稀释成2μm、4μm、8μm、16μm、32μm、64μm、128μm、256μm等8个浓度作为测试浓度，每个药物组平行6个复孔，37℃、5％co2培养箱作用24h后结束培养。

(5)吸光度测定：弃去96孔板内的液体，pbs清洗每个孔板至无残留，加入90μl完全培养基和10μlcck8试剂，37℃继续孵育4h后终止培养，酶标仪于490nm处测定od值。

不同浓度的卤化ⅱ型聚酮类抗生素作用于，hepg2肝癌细胞、hep1肝癌细胞、mhcc97h肝癌细胞以及l02正常肝细胞24h后，观察hepg2肝癌细胞、hep1肝癌细胞、mhcc97h肝癌细胞以及l02正常肝细胞24h的细胞数量变化，并使用cck8测定药物对细胞增殖的影响。

如图6至图13所示，从图6至图13可以看出，在hepg2肝癌细胞、hep1肝癌细胞以及mhcc97h肝癌细胞中加入卤化ⅱ型聚酮类抗生素后，细胞数量明显减少，而在l02正常肝细胞中加入卤化ⅱ型聚酮类抗生素后，细胞数量只是稍微减少。

如图14至图17所示，从图14至图17中可以看出，卤化ⅱ型聚酮类抗生素的浓度越大，hepg2肝癌细胞、hep1肝癌细胞、mhcc97h肝癌细胞以及l02正常肝细胞的细胞存活率就越低，当卤化ⅱ型聚酮类抗生素浓度控制在2μm/ml到32μm/ml之间时，卤化ⅱ型聚酮类抗生素对l02正常肝细胞的细胞存活率影响较小，而对hepg2肝癌细胞、hep1肝癌细胞以及mhcc97h肝癌细胞存活率影响较大。

根据各组od490值的平均值和标准差，按公式计算细胞生长抑制率。

ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)是指药物的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序，如细胞死亡一半时的浓度或剂量，ic50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。

实验数据处理采用spss18.0及graphpadprism6.0统计软件，计算药物的半抑制浓度ic50，详见表1。表1为不同浓度卤化ⅱ型聚酮类抗生素对不同肝癌细胞和正常肝细胞的细胞抑制率分析表，从表1中可以看出，卤化ⅱ型聚酮类抗生素的浓度越高，对hepg2肝癌细胞、hep1肝癌细胞、mhcc97h肝癌细胞的抑制率则越高。

表1