一种包载分子靶向药物脂质体及其在制备治疗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种包载分子靶向药物的脂质体及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

现有技术公开了分子靶向药物主要针对恶性肿瘤发生、发展的关键靶点进行治疗干预，由于其可选择性杀伤肿瘤细胞，其耐受性好、毒性反应小，相对于传统的细胞毒类抗肿瘤药物有更大优势。据报道，一些分子靶向药物在相应的肿瘤治疗中已表现出较佳疗效。分子靶向药物可分为单靶点抑制剂和多靶点抑制剂，目前已知的单靶点抑制剂包括bcr-abl激酶抑制剂(如伊马替尼、达沙替尼、普纳替尼等)、表皮生长因子(egfr)抑制剂(如吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼、奥希替尼等)、血管内皮生长因子(vegf)抑制剂(如阿帕西普等)、血管内皮生长因子受体(vegfr)抑制剂(如阿帕替尼、呋喹替尼、托西尼布、西地尼布等)、周期蛋白依赖性激酶4/6(cdk4/6)抑制剂(如帕博西尼、瑞博西尼、abemaciclib等)、聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂(如他拉唑帕尼、奥拉帕尼、iniparib、尼拉帕利等)、hedgehog抑制剂(如维莫德吉、索尼德吉、daurismo等)、雷帕霉素靶蛋白(mtor)抑制剂(如依维莫司、azd8055、azd2014、替西罗莫司、scc-31等)等。已知的多靶点抑制剂如al3180、舒尼替尼、瑞戈替尼、索拉菲尼、凡德他尼、卡博替尼、乐伐替尼、帕唑帕尼、维罗非尼、阿昔替尼、达拉非尼、利尼伐尼、尼达尼布等；有研究报道，因多数分子靶向药物存在溶解度差而影响其生物利用度，或难以穿透生物屏障(如血-脑屏障bbb、血-肿瘤屏障bbtb等)而影响其对脑部肿瘤和部分实体瘤的疗效。

脂质体(liposomes)是由磷脂、胆固醇等材料制得的类似生物膜结构的磷脂双分子层小囊泡。脂质体可以将药物包埋在其磷脂双分子层或内水相中，达到提高药物的溶解性能、保护药物活性基团、延长药物的半衰期、提高药物的治疗指数、减少药物的毒副反应等目的。此外，对脂质体进行靶向分子修饰可使脂质体具备主动靶向递送药物的能力，如：通过肿瘤靶向分子修饰的脂质体可实现对肿瘤细胞的靶向递药，从而增强药物的抗肿瘤疗效，同时降低对正常组织的毒副作用；该主动靶向策略对于脑部肿瘤的治疗尤为重要。临床实践显示，脑部肿瘤分为原位脑肿瘤(如脑胶质瘤)和转移脑肿瘤(如肺癌和乳腺癌的脑转移瘤)，是最具有挑战性的恶性肿瘤之一，因其存在bbb和bbtb，多数药物难以透过，故而极大地削弱了其药效；另有研究显示，通过bbb或/和bbtb靶向分子修饰的脂质体包载抗肿瘤药物如阿霉素、紫杉醇等用于脑胶质瘤的治疗已表现出显著的优势。

脂质体应用领域广泛，涉及药品、基因治疗、医用材料、疫苗、生物制剂、农药、化妆品和保健品等，且市场前景广阔。目前国内外已获批上市的脂质体药物有多种，如盐酸多柔比星脂质体注射液(doxil或caelyx)、盐酸伊立替康脂质体注射剂(onivyde)、两性霉素b脂质体(ambiosome)、紫杉醇脂质体(力扑素)、布比卡因脂质体(exparel)、长春新碱脂质体(marqibo)、柔红霉素脂质体(daunoxome)等。

基于现有技术的基础及现状，鉴于脂质体技术在其他药物中的成功运用，本申请的发明人拟将分子靶向药物制成脂质体制剂以助力分子靶向药物拓展临床适应症并提高疗效，具体提供一种包载分子靶向药物的脂质体及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的基础及现状，提供一种包载分子靶向药物的脂质体及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。本申请中，将分子靶向药物制成脂质体制剂将助力分子靶向药物拓展临床适应症并提高疗效。

本发明通过：1)制备分子靶向药物脂质体使药物在模拟生理条件下具备良好的溶解性能和/或缓释效果；2)制备分子靶向药物脂质体实现对肿瘤靶向递药，显著增强分子靶向药物抗肿瘤尤其是抗脑部肿瘤的效果；本发明经实验证实，分子靶向药物脂质体有相对于游离分子靶向药物更好的缓控释性能及肿瘤靶向治疗效果。

本发明的目的通过下述具体技术方案施现：

本发明一方面公开了一种载分子靶向药物的脂质体，所述分子靶向药物为抗肿瘤的分子靶向药物。

优选地，所述抗肿瘤分子靶向药物为亲水性分子靶向药物或疏水性分子靶向药物。

优选地，所述亲水性或疏水性抗肿瘤分子靶向药物可以是伊马替尼、达沙替尼、普纳替尼、吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼、奥希替尼、阿帕西普、阿帕替尼、呋喹替尼、托西尼布、西地尼布、帕博西尼、瑞博西尼、abemaciclib、他拉唑帕尼、奥拉帕尼、iniparib、尼拉帕利、维莫德吉、索尼德吉、daurismo、依维莫司、azd8055、azd2014、替西罗莫司、al3810、scc-31、舒尼替尼、瑞戈替尼、索拉菲尼、凡德他尼、卡博替尼、乐伐替尼、帕唑帕尼、维罗非尼、阿昔替尼、达拉非尼、利尼伐尼、尼达尼布中的一种或任意组合。

应当理解，本发明的分子靶向药物并不限于上述列举的分子靶向药物，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的分子靶向药物来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。

本发明第二个方面公开了载分子靶向药物的脂质体的基本处方及制备方法，所述脂质体为肿瘤主动靶向脂质体或被动靶向脂质体。

优选地，所述靶向或非靶向脂质体由磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺(mpeg-dspe)和/或靶向分子修饰的聚乙二醇-二硬脂酰乙醇胺(peg-dspe)组成。

优选地，所述靶向分子修饰的peg-dspe，修饰peg-dspe的靶向分子为小分子化合物，如：叶酸，对羟基苯甲酸(pha)及其衍生物，脂肪酸，其中脂肪酸优选肉豆蔻酸(mc)。

优选地，所述靶向分子修饰的peg-dspe，修饰peg-dspe的靶向分子为多肽分子或蛋白分子，其中多肽分子为：vap、cvap、^svap、^dvap，pha-vap、pha-^svap及pha-^dvap，mc-vap、mc-^svap及mc-^dvap，d8、d8-vap、d8-^svap及d8-^dvap，wsw、^dwsw、wsw-vap、^dwsw-^svap及^dwsw-^dvap，tgn、^dtgn、tgn-vap、^dtgn-^svap及^dtgn-^dvap；a7r、ca7r、^da7r，pha-a7r及pha-^da7r，mc-a7r及mc-^da7r，d8-a7r及d8-^da7r，wsw-a7r及^dwsw-^da7r，tgn-a7r及^dtgn-^da7r；rgd多肽、stapled-rgd多肽，pha-rgd多肽，mc-rgd多肽，d8-rgd多肽，wsw-rgd多肽，tgn-rgd多肽；rw、mn，pha-rw及pha-mn，mc-rw及mc-mn，d8-rw及d8-mn，wsw-rw及^dwsw-mn，tgn-rw及^dtgn-mn；t7及^dt7；rap12及^drap12。其中蛋白分子为转铁蛋白和乳铁蛋白等，上述多肽分子或蛋白分子中可以一种或任意种组合使用。

表1为本发明所述的多肽氨基酸序列表。

表1

优选地，所述载分子靶向药物脂质体的制备方法为薄膜分散法或乙醇注入法。

优选地，所述载分子靶向药物脂质体的药物包载方法为主动载药或被动载药。

应当理解，本发明的脂质体基本处方并不限于磷脂、胆固醇、mpeg-dspe和/或靶向分子修饰的peg-dspe，本发明的修饰peg-dspe的靶向分子并不限于上述的小分子化合物、多肽分子和蛋白分子，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适处方及合适配比的脂质体来完成本发明，均在本发明的保护范围之内。

本发明第三个方面公开了分子靶向药物脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的分子靶向药物脂质体可进一步与其它药用成分和/或稀释剂组成药物组合，制成各种制剂，用于肿瘤的靶向治疗，优选地，所述制剂为注射剂。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明首次公开的分子靶向药物脂质体能够增加亲水性或疏水性分子靶向药物在生理条件下的溶解性能和/或缓控释性能，可适应液体制剂的要求，提高了分子靶向药物剂型设计及给药方式的灵活性，并且，相对于游离药物，靶向多肽修饰的分子靶向药物脂质体可实现对肿瘤靶向递药，尤其是穿透生物屏障膜的肿瘤靶向递药，显著增强分子靶向药物靶向治疗肿瘤的效果，使分子靶向药物的临床适应症进一步拓展、药用价值得到更好发挥，为以分子靶向药物为基础的脂质体递药系统组合物的设计和未来临床应用提供了依据。

附图表说明

图1：脂质体/scc-31和^dvap-脂质体/scc-31的粒径、pdi、包封率、载药量及tem电镜图。

图2：脂质体/scc-31和^dvap-脂质体/scc-31的体外释放曲线。

图3：脂质体/scc-31和^dvap-脂质体/scc-31的体外u87细胞抑制效果。

图4：脂质体/scc-31和^dvap-脂质体/scc-31的体内药效试验生存曲线

图5：脂质体/scc-31和^dvap-脂质体/scc-31的体内药效试验体重变化曲线

图6：各载al3810脂质体的粒径表征。

图7：各载al3810脂质体在37℃下粒径稳定性的表征。

图8：各载al3810脂质体在50％大鼠血清、37℃下粒径稳定性的表征。

图9：各载al3810脂质体在pbs缓冲液中的体外释放试验。

图10：各载al3810脂质体在30％大鼠血清中的体外释放试验。

图11：各载al3810脂质体的体外huvec细胞摄取试验。

图12：各载al3810脂质体的体外u87细胞抑制试验。

表1：多肽氨基酸序列表。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1、主动载药法制备脂质体/scc-31及表征

本实施例公开了主动载药法制备脂质体/分子靶向药物scc-31及表征，具体包括以下步骤：

脂质体/scc-31的膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe(50:45:5，摩尔比)。分别称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除有机溶剂得均匀脂质膜，真空干燥24h。加入一定体积的0.2m柠檬酸溶液，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。超声波细胞粉碎机超声10min(80w，超声2s，间隔1s)，得空白脂质体。生理盐水洗脱通过sephadexg-50凝胶柱更换空白脂质体外水相。按照药脂比1:5(摩尔比)加入scc-31游离碱固体粉末，55℃水浴1h。生理盐水洗脱过sephadexg-50凝胶柱，除去游离药物，得scc-31脂质体。通过马尔文激光散射粒度仪测定脂质体/scc-31的粒径为112.6nm，pdi为0.141，透射电镜下脂质体形态圆整(粒径和电镜结果见图1)。hplc测得脂质体的包封率为97.04％，载药量为11.27％，脂质体混悬液所含药物浓度为4.12mg/ml，而同时测得的0.9％生理盐水中scc-31游离碱的溶解度仅约为0.15mg/ml，证明主动载药法制备的脂质体scc-31可显著增加scc-31在生理盐水中的溶解度。透析袋法考察脂质体/scc-31在50％大鼠血清中的体外释放结果如图2所示，证明主动载药法制备的脂质体/scc-31有缓释特征。

实施例2、主动载药法制备^dvap-脂质体/scc-31及表征

本实施例公开了主动载药法制备^dvap-脂质体/分子靶向药物scc-31及表征，具体包括以下步骤：

^dvap-脂质体/scc-31膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe/^dvap-peg3400-dspe(50:45:3:2，摩尔比)。分别称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除有机溶剂得均匀脂质膜，真空干燥24h。加入一定体积0.2m的柠檬酸溶液，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。超声波细胞粉碎机超声10min(80w，超声2s，间隔1s)，得空白脂质体。生理盐水洗脱通过sephadexg-50凝胶柱更换空白脂质体外水相。按照药脂比1:5(摩尔比)加入scc-31游离碱固体粉末，55℃水浴1h。生理盐水洗脱过sephadexg-50凝胶柱，除去游离药物，得^dvap-脂质体scc-31。通过马尔文激光散射粒度仪测定^dvap-脂质体scc-31的粒径为122.2nm，pdi为0.090，透射电镜下脂质体形态圆整(粒径和电镜结果如图1所示)，hplc测得脂质体的包封率为95.32％，载药量为10.43％，脂质体混悬液所含药物浓度为3.68mg/ml，而同时测得的0.9％生理盐水中scc-31游离碱的溶解度仅约为0.15mg/ml，证明主动载药法制备的^dvap-脂质体scc-31可显著增加scc-31在生理盐水中的溶解度。透析袋法考察^dvap-脂质体scc-31在50％大鼠血清中的体外释放结果如图2所示，证明主动载药法制备的^dvap-脂质体scc-31有缓释特征。

实施例3、被动载药法制备脂质体/scc-31及表征

本实施例公开了被动载药法制备脂质体/分子靶向药物scc-31及表征，具体包括以下步骤：

脂质体/scc-31的膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe(50:45:5，摩尔比)，分别称取上述膜材料溶于乙醇，磁力搅拌条件下逐滴注入0.9％生理盐水中。超声波细胞粉碎机超声10min(80w，超声2s，间隔1s)，得脂质体/scc-31。通过马尔文激光散射粒度仪测定脂质体/scc-31的粒径为124.27nm，pdi为0.201。hplc测得脂质体的包封率为85.56％，载药量为8.91％，脂质体混悬液所含药物浓度为2.15mg/ml，而同时测得的0.9％生理盐水中scc-31游离碱的溶解度仅约为0.15mg/ml，证明被动载药法制备的脂质体/scc-31可显著增加scc-31在生理盐水中的溶解度。透析袋法考察脂质体/scc-31在50％大鼠血清中体外释放4h后scc-31释放完全，证明被动载药法制备的脂质体/scc-31在模拟体内环境下释药迅速。

实施例4、^dvap-脂质体/scc-31的体外抗脑胶质瘤试验

mtt法考察主动载药法制备的^dvap-liposomes/scc-31对体外u87细胞的抑制作用。取对数生长期的u87细胞，消化并制备密度为2×10⁴个/ml的u87单细胞悬液并接种于96孔板，每孔体积100μl，移入co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)培养24h，弃去原培养基，更换为200μl含药或不含药培养基进行细胞培养。试验组有5组：1)生理盐水，2)游离scc-31，3)脂质体/scc-31，4)^dvap-脂质体/scc-31，5)不含药培养基。各制剂hplc定量后均稀释到以scc-31计相同的浓度(2mg/ml)，超净台内再次过滤，培养基稀释，每个制剂得9个给药浓度，最高浓度200μg/ml(350μmol)，其余浓度依次稀释5倍，每个浓度3复孔。37℃、5％co2孵箱内孵育4h后，各4h给药组均弃掉含药培液，pbs洗三次，加入新的不含药培养基继续培养至72h。72h后每孔加20μl5mg/ml的mtt溶液，37℃继续孵育4h后弃尽上清，每孔加150μldmso，37℃空气摇床震荡10min，于酶标仪570nm波长处测定各孔od值。试验重复3次。按下式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(ods-odblank)/(odcontrol-odblank)×100％。式中：ods为给药组的吸光度，odcontrol为空白对照组的吸光度，odblank为空白孔吸光度。用细胞存活率对不同药物浓度通过graphpadprism7.0软件绘制生长曲线，并计算ic50(如图3所示)，结果表明，^dvap-脂质体/scc-31相对于游离药物及无靶脂质体可发挥更好的体外u87细胞杀伤作用。

实施例5、^dvap-脂质体/scc-31的体内抗脑胶质瘤试验

(1)原位脑胶质瘤模型鼠构建

取对数生长期的u87细胞，消化、计数，用适量pbs缓冲液混悬，每只裸鼠接种5×10⁵个细胞(5μl体积)。脑立体定位仪上固定微量注射器，75％乙醇消毒，无菌pbs润洗，吸取5μlu87细胞悬液备用。小鼠麻醉，固定于脑立体定位仪，灭菌手术器械剖开小鼠头顶皮肤，10％双氧水消化头皮，露出白色十字架状前囟。微量注射器针头对准前囟中心并以此为原点，通过脑立体定位仪调整微量注射器针头的位置，右移1.8mm上移0.6mm，即小鼠纹状体正对的位置。三棱针在针头正对的头骨处钻孔，通过脑立体定位仪向下调整微量注射器，注射器针头进入头骨小孔时开始计数，针头下调4mm，上调1mm。1min内将细胞缓慢注射完，等3min，1min内缓慢上提1mm，再等2min，2min后将针完全提出，封骨蜡，手术缝合，术后小鼠于spf环境继续培养，每天观察小鼠状态，待状态稳定后进行相关实验。

(2)抗原位脑胶质瘤药效试验

种瘤后小鼠随机分分为4组(9只/组)，第7天开始给药(各组剂量均为以scc-31计24mg/kg/次)，隔天给药，共给药16次，每次给药后，小鼠称重，并记录小鼠生存时间，绘制生存曲线。具体分组如下：1)生理盐水，2)游离scc-31，3)脂质体/scc-31，4)^dvap-脂质体/scc-31。其中脂质体均通过主动载药法制备。小鼠生存期及体重结果如图4和图5所示，结果表明，^dvap-脂质体/scc-31可显著增强scc-31的体内抗脑胶质瘤效果。

实施例6、主动载药法制备脂质体/al3810及表征

本实施例也公开了主动载药法制备脂质体/分子靶向药物al3810及表征，具体包括以下步骤：

脂质体/al3810膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe(52:43:5，摩尔比)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得到的均匀脂质膜真空干燥过夜。加入0.32m硫酸铵溶液63℃水化1h，用探头超声仪超声后使用生理盐水过g50凝胶柱。然后加入al3810的柠檬酸溶液，用1m磷酸氢二钠调节ph至6.1左右，63℃水浴摇床孵育2h，后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶g-50柱分离除去游离药物，并置换掉柠檬酸溶液得al3810脂质体。通过马尔文激光散射粒度仪测定脂质体/al3810的粒径约为110nm且分布均匀(粒径结果如图6a所示)，37℃条件下脂质体稳定性良好(如图7所示)，即使与等体积大鼠血清37℃共孵育脂质体/al3810粒径及pdi亦无显著变化(如图8所示)，透析袋法考察脂质体/al3810在ph7.4pbs缓冲液及模拟生理条件的30％大鼠血清中的体外释放结果分别如图9和图10所示，证明主动载药法制备的脂质体/al3810有缓释特征。

实施例7、主动载药法制备c(rgdyk)-脂质体/al3810及表征

本实施例也公开了主动载药法制备c(rgdyk)-脂质体/分子靶向药物al3810及表征，具体包括以下步骤：

c(rgdyk)-脂质体/al3810膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe/c(rgdyk)-peg3400-dspe(52:43:3:2，摩尔比)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得到的均匀脂质膜真空干燥过夜。加入0.32m硫酸铵溶液63℃水化1h，用探头超声仪超声后使用生理盐水过g50凝胶柱。然后加入al3810的柠檬酸溶液，用1m磷酸氢二钠调节ph至6.1左右，63℃水浴摇床孵育2h，后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶g-50柱分离除去游离药物，并置换掉柠檬酸溶液得c(rgdyk)-脂质体/al3810。通过马尔文激光散射粒度仪测定c(rgdyk)-脂质体/al3810的粒径约为110nm且分布均匀(粒径结果如图6b所示)，37℃条件下脂质体稳定性良好(如图7所示)，即使与等体积大鼠血清37℃共孵育c(rgdyk)-脂质体/al3810粒径及pdi亦无显著变化(如图8所示)，透析袋法考察c(rgdyk)-脂质体/al3810在ph7.4pbs缓冲液及模拟生理条件的30％大鼠血清中的体外释放结果分别如图9和图10所示，证明主动载药法制备的c(rgdyk)-脂质体/al3810有缓释特征。

实施例8、主动载药法制备rw-脂质体/al3810及表征

本实施例也公开了主动载药法制备rw-脂质体/分子靶向药物al3810及表征，具体包括以下步骤：

rw-脂质体/al3810膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe/rw-peg3400-dspe(52:43:3:2，摩尔比)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得到的均匀脂质膜真空干燥过夜。加入0.32m硫酸铵溶液63℃水化1h，用探头超声仪超声后使用生理盐水过g50凝胶柱。然后加入al3810的柠檬酸溶液，用1m磷酸氢二钠调节ph至6.1左右，63℃水浴摇床孵育2h，后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶g-50柱分离除去游离药物，并置换掉柠檬酸溶液得rw-脂质体/al3810。通过马尔文激光散射粒度仪测定rw-脂质体/al3810的粒径约为110nm且分布均匀(粒径结果如图6c所示)，37℃条件下脂质体稳定性良好(如图7所示)，即使与等体积大鼠血清37℃共孵育rw-脂质体/al3810粒径及pdi亦无显著变化(如图8所示)。透析袋法考察rw-脂质体/al3810在ph7.4pbs缓冲液及模拟生理条件的30％大鼠血清中的体外释放结果分别如图图9和图10所示，证明主动载药法制备的rw-脂质体/al3810有缓释特征。

实施例9、主动载药法制备mn-脂质体/al3810及表征

本实施例也公开了主动载药法制备mn-脂质体/分子靶向药物al3810及表征，具体包括以下步骤：

mn-脂质体/al3810膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe/mn-peg3400-dspe(52:43:3:2，摩尔比)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得到的均匀脂质膜真空干燥过夜。加入0.32m硫酸铵溶液63℃水化1h，用探头超声仪超声后使用生理盐水过g50凝胶柱。然后加入al3810的柠檬酸溶液，用1m磷酸氢二钠调节ph至6.1左右，63℃水浴摇床孵育2h，后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶g-50柱分离除去游离药物，并置换掉柠檬酸溶液得mn-脂质体/al3810。通过马尔文激光散射粒度仪测定mn-脂质体/al3810的粒径约为110nm且分布均匀(粒径结果如图6d所示)，37℃条件下脂质体稳定性良好(如图图7所示)，即使与等体积大鼠血清37℃共孵育mn-脂质体/al3810粒径及pdi亦无显著变化如图图8所示，透析袋法考察mn-脂质体/al3810在ph7.4pbs缓冲液及模拟生理条件的30％大鼠血清中的体外释放结果分别如图9和图10所示，证明主动载药法制备的mn-脂质体/al3810有缓释特征。

实施例10、包载al3810脂质体的体外靶向性和体外抑制脑胶质瘤细胞生长试验(1)huvec对al3810脂质体的摄取

培养、制备密度为2×10⁵个/ml的huvec单细胞悬液并接种于12孔板，每孔体积1ml，移入co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)培养24h，弃去原培养基，分别更换为1ml含药培养基进行细胞培养。实验组包括4组(n＝3)：1)ls/al3810，2)rw-ls/al3810，3)mn-ls/al3810，4)c(rgdyk)-ls/al3810。各制剂hplc定量后过滤，并用培养基稀释至以al3810剂量为180μg/ml给药，每孔给药1ml。37℃、5％co2孵箱内孵育4h后，弃掉含药培液，pbs洗三次，胰酶消化收集各孔细胞。1000rpm离心，弃上清，将每孔细胞定容至1ml，细胞计数仪进行细胞计数，得每孔的细胞数(ncell)，1000rpm再次离心，弃上清，细胞定容至0.1ml。水浴超声粉碎细胞，加0.2ml乙腈沉淀细胞中的蛋白，12000rpm离心15min，取上清液hplc进样检测药物浓度c。每10⁴细胞的药物摄取量计算式为：细胞药物摄取量/10⁴个(ng)＝(c×3×0.1)/(ncell×10⁴)。结果(如图11所示)表明，各有靶脂质体rw-ls/al3810、mn-ls/al3810和c(rgdyk)-ls/al3810被huvec摄取良好，细胞内药物浓度明显高于无靶组ls/al3810，具有显著性差异。

(2)al3810脂质体对u87细胞生长的抑制试验

培养、制备密度为2×10⁴个/ml的u87单细胞悬液并接种于96孔板，每孔体积100μl，移入co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)培养24h，再加入100μl含药或不含药培养基进行细胞培养。实验组包4组(n＝3)：1)ls/al3810，2)rw-ls/al3810，3)mn-ls/al3810，4)c(rgdyk)-ls/al3810。各脂质体制剂hplc定量后稀释到以al3810计相同的浓度，超净台内过滤，用培养基稀释成梯度浓度给药，培养4h或72h后每孔加20μl5mg/ml的mtt溶液，37℃继续孵育4h后弃尽上清，每孔加150μldmso，37℃空气摇床震荡10min，于酶标仪570nm波长处测定各孔od值。按下式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(ods-odblank)/(odcontrol-odblank)×100％。式中：ods为给药组的吸光度，odcontrol为空白对照组的吸光度，odblank为空白孔吸光度。用细胞存活率对不同药物浓度通过graphpadprism7.0软件绘制生长曲线，并计算ic50(如图12所示)，结果表明，各有靶脂质体包载的al3810相对于游离药物、无靶脂质体可发挥更好的体外u87细胞杀伤作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。