车前子提取物的制备方法及其在制备治疗/预防高尿酸相关疾病的药物/保健品方面的应用与流程

本发明涉及一种植物提取物的制备方法及其在制备治疗/预防高尿酸相关疾病的药物/保健品方面的应用，尤其涉及车前子提取物的制备方法及其在制备治疗/预防高尿酸相关疾病的药物/保健品方面的应用。

背景技术：

随着现代生活习惯和饮食结构的改变，高尿酸血症的发病率升高。高尿酸血症的发生是由于体内尿酸的产生增加，肾尿酸的排泄减少，使得体内尿酸浓度高于血液溶解能力(>360μmol/l)。尿酸以晶体形式在关节中沉积，并导致反复发作导致痛风性关节炎和尿酸性肾结石。这些沉积结晶引起软组织、关节和骨组织反复发炎性剧烈疼痛，严重降低患者生活质量。

高尿酸相关疾病的治疗需要降低体内血尿酸浓度。在肾单位的细胞上的特定转运蛋白(如肾尿酸转运蛋白urat1)是高尿酸血症的重要靶点。阿片类药物，如丙磺舒，磺吡酮和苯溴马隆均是直接作用于肾小管靶点的药物，通过抑制尿酸盐增加尿酸的肾排泄，通过与一种或多种转运蛋白相互作用而重吸收蛋白质，但是由于过敏反应等不良副作用而使用受限。黄嘌呤氧化酶(xod)是另一个重要的靶标，主要分布在肝脏和肠道，并在嘌呤代谢途径中将次黄嘌呤和黄嘌呤氧化成尿酸。现抑制xod的降尿酸药物可分为嘌呤和非嘌呤类。别嘌呤醇是最常用的临床xod嘌呤类抑制剂，但其因史蒂文斯—约翰逊综合征、肾毒性等毒副作用而备受争议。非布索坦作为非嘌呤xod抑制剂也会导致心血管并发症，食品和药物管理局(fda)也要补充该药物的警示性声明。

因此，迫切需要开发有效和安全的新型降尿酸药物。

植物提取物作为一种治疗药物候选物，由于其可能的副作用较小的优点而受到广泛关注，但是植物提取物作为药物候选物，通常存在治疗效果较差以及提取率太低而无法工业化的问题。

技术实现要素：

针对以上不足，本发明提供一种车前子提取物的制备及其在制备治疗/预防高尿酸相关疾病的药物/保健品方面的应用。

本发明通过以下方案达到上述目的：

第一方面，提供一种车前子提取物的制备方法，包括：

(1)将干燥的车前子粉碎；

(2)在0-100℃的水浴中用1-20l/(100g车前子)的乙醇萃取0.1-10小时，后过滤分离滤渣和滤液，重复一至三次；

(3)将步骤(2)所得的滤液合并后减压蒸馏浓缩至25-35ml/(100g车前子)，冻干得到车前子醇提物；

(4)在0-100℃的水浴中用水作为溶剂萃取醇提后的车前子残渣0.1-10小时，后过滤分离滤渣和滤液，重复一至三次；

(5)将步骤(4)所得的滤液合并后减压蒸馏浓缩至25-35ml/(100g车前子)，冻干得到车前子水提取物。

在第二方面，提供一种上述制备方法制备得到的车前子提取物，包括车前子醇提物和车前子水提物。

在第三方面，提供一种上述车前子提取物在治疗/预防高尿酸相关疾病方面的应用。

在第四方面，提供一种上述车前子提取物在制备治疗/预防高尿酸相关疾病的药物/保健品方面的应用。

在第五方面，提供一种治疗/预防高尿酸相关疾病的药物，包括上述的车前子提取物及辅料。

利用本发明制得的车前子提取物在小鼠体内进行降尿酸试验，结果表明，用车前子提取物连续灌胃7天，可将高尿酸小鼠的血液尿酸浓度降低到正常小鼠尿酸水平。

本发明的有益效果在于：

1、本发明所述车前子提取物的制备工艺简单，成本低；

2、本发明采用乙醇、水或者乙醇和水的混合溶剂作为溶剂提取车前子，不存在有机溶剂污染或残留的问题，安全环保；

3、本发明车前子提取物具有显著的降尿酸作用，且副作用小，能够用于制备缓解痛风病症的药物，为改善目前痛风病药物副作用大的现象提供了新的方向。

附图说明

图1为试验例1的各组小鼠血清尿酸水平。

图2为试验例1的各组小鼠血清尿素氮水平。

图3为试验例1的各组小鼠血清肌酐水平。

图4为试验例1的各组小鼠体重。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

第一方面，提供一种车前子提取物的制备方法，包括：

(1)将干燥的车前子粉碎；

(2)在0-100℃的水浴中用1-20l/(100g车前子)的乙醇萃取0.1-10小时，后过滤分离滤渣和滤液，重复一至三次；

(3)将步骤(2)所得的滤液合并后减压蒸馏浓缩至25-35ml/(100g车前子)，冻干得到车前子醇提物；

(4)在0-100℃的水浴中用水作为溶剂萃取醇提后的车前子残渣0.1-10小时，后过滤分离滤渣和滤液，重复一至三次；

(5)将步骤(4)所得的滤液合并后减压蒸馏浓缩至25-35ml/(100g车前子)，冻干得到车前子水提取物。

优选的，所述步骤(2)中的提取温度为60℃。

优选的，所述步骤(4)中的提取温度为85℃。

在一个优选的实施例中，一种车前子提取物的制备方法，包括：

(1)将干燥的车前子粉碎；

(2)在60℃的水浴中用2l/(100g车前子)乙醇萃取2小时，后过滤分离滤渣和滤液，重复三次；

(3)将步骤(2)所得的滤液合并后减压蒸馏浓缩至25-35ml/(100g车前子)，冻干得到液状车前子醇提物；

(4)在85℃的水浴中用水作为溶剂萃取醇提后的车前子残渣2小时，后过滤分离滤渣和滤液，重复三次；

(5)将步骤(4)所得的滤液合并后减压蒸馏浓缩至25-35ml/(100g车前子)，冻干得到车前子水提取物。

优选的，所述步骤(2)中的萃取为超声提取。

优选的，所述步骤(4)中的萃取为超声提取。

使用上述方法和参数，车前子提物提取率能够达到5％左右，这样的提取物率使得工业化成为可能。并且上述方法和参数可以避免使用昂贵的柱子，提取方法简单并且成本低，降低人力成本，提高经济效益。

本发明制备车前子提取物的方法简洁、安全、有效且能有效控制成本。制备方法使用资源丰富、价格便宜、环境友好的乙醇、水或者乙醇和水混合物作为溶剂，达到降低生产成本、避免有机溶剂污染的目的。

车前子(plantaginissemen)是多年生草本植物车前或平车前的干燥成熟种子，为常用中药材。它含有车前子酸(planterolicacid)、车前子甙(plantaginin)、车前烯醇酸(plantenolicacid)、琥珀酸(succinicacid)、腺嘌呤(adenine或6-aminopurine)、胆碱(choline)、梓醇(catalpol)、酸性黏多糖车前聚糖(plantasan)、维生素a、维生素b1等，以及各种蛋白质和脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等)。有利水通淋、渗湿止泻、清肝明目、清热化痰的功效。

在第二方面，提供一种上述制备方法制备得到的车前子提取物，包括车前子醇提物和车前子水提物。

在第三方面，提供一种上述车前子提取物在治疗/预防高尿酸相关疾病方面的应用。

在第四方面，提供一种上述车前子提取物在制备治疗/预防高尿酸相关疾病的药物/保健品方面的应用。

在第五方面，提供一种治疗/预防高尿酸相关疾病的药物，包括上述的车前子提取物及辅料。

优选的，所述辅料包括可药用的载体。

在上述应用和药物中，车前子醇提物的优选给药浓度为10-200mg/kg。

在上述优选的给药浓度10-200mg/kg浓度范围内，车前子醇提物对降尿酸百分率可以达到20％以上。

在上述应用和药物中，车前子水提物的优选浓度为10-200mg/kg。

在上述优选的10-200mg/kg浓度范围内，车前子水提物对降尿酸百分率可以达到20％以上。

上述明显的效果和简单的制备方法使得药用化具有现实性。

在上述应用和药物中，高尿酸相关疾病包括但不限于高尿酸血症、高尿酸血症肾炎、高尿酸血症高血压、高尿酸血症心脏病、痛风肾结石、痛风。

利用本发明制得的车前子提取物在小鼠体内进行降尿酸试验，结果表明，用车前子提取物连续灌胃7天，可将高尿酸小鼠的血液尿酸浓度降低到正常小鼠尿酸水平。

进一步发现，车前子提取物不影响小鼠体重且对肾无毒性，特别是在一定给药浓度范围内具有更加显著的效果。

因此，本发明还提供一种上述车前子提取物在制备治疗/预防高尿酸相关疾病而且不影响小鼠体重且对肾无毒性的药物/保健品方面的应用。

因此，进一步地，本发明还提供一种上述车前子水提物在制备治疗/预防高尿酸相关疾病而且不影响小鼠体重且对肾无毒性的药物/保健品方面的应用。

因此，进一步地，本发明还提供一种上述车前子醇提物在制备治疗/预防高尿酸相关疾病而且不影响小鼠体重且对肾无毒性的药物/保健品方面的应用。

实施例1车前子乙醇提取物的制备

取车前子100g，使用粉碎机粉碎后加入锥形瓶中，并加入2l乙醇，将混合物在60℃下水浴提取2小时后使用400目滤网过滤，提取实验重复三次，将所得滤液合并后减压蒸馏浓缩，并经冻干机浓缩得到液状车前子醇提物。

实施例2车前子提取物的制备

在85℃的水浴中用2l水作为溶剂萃取醇提后的车前子残渣2小时，后减压过滤分离滤渣和滤液，提取实验重复三次，将所得滤液合并后减压蒸馏浓缩并冻干得到车前子水提取物7.29g，产率为3.65％。

试验例1

车前子提取物降尿酸药理实验

(1)取48只雄性spf昆明小鼠(21±2g)，随机分为6组：正常对照组，高尿酸血症模型组，别嘌呤醇和苯溴马隆对照组以及车前子醇提物实验组和车前子水提物实验组。除正常对照组腹腔注射生理盐水和灌胃无菌蒸馏水外，其他组按照300mg/kg/d的剂量腹腔注射氧嗪酸钾盐，同时灌胃500mg/kg/d剂量的次黄嘌呤造模。造模前一个小时禁食不禁水，造模后1小时，用别嘌呤醇(5mg/kg)和苯溴马隆(7.8mg/kg)分别对别嘌呤醇对照组和苯溴马隆对照组的小鼠进行灌胃。用实施例1制得的车前子醇提物(50mg/kg)和实施例2制得的车前子水提物(50mg/kg)，分别对车前子醇提物实验组和车前子水提物实验组的小鼠进行灌胃。正常组和高尿酸血症模型组则灌胃相同体积的无菌蒸馏水，连续7天，并在第1，3，5，7天给小鼠称重记录。

(2)第7天灌胃给药1小时后，取小鼠的血液和尿液，并将血液样本在3500r/min下离心10min分离得到血清样本，存于-20℃。

(3)取(2)中所得血清，测定血清尿酸水平、尿素氮和肌酐水平。

(4)使用spss17.0对数据进行统计分析。所有数据表示为平均值±标准差(s.d.)，并通过单因素方差分析(anova)进行分析，并通过双尾student'st检验比较组平均值。差异有统计学意义(p<0.05或p<0.01)的用以下符号表示：与正常组对照有差异：^*p<0.05，^**p<0.01；与氧嗪酸钾和次黄嘌呤诱导的高尿酸血症模型组对照有差异：^#p<0.05，^##p<0.01；与别嘌呤醇组对照有差异，^△p<0.05，^△△p<0.01。

血尿酸是评价降尿酸效果的直接指标，结果如图1所示。氧嗪酸钾和次黄嘌呤联合给药导致高尿酸血症模型组血清尿酸水平升高，与正常小鼠(121μmol/l)相比，高尿酸血症小鼠显著升高至439μmol/l(p<0.01)，说明造模成功。别嘌呤醇(251mol/l，p<0.01)和苯溴马隆(137μmol/l，p<0.01)对照组的血尿酸水平下降也证实了高尿酸血症造模的成功。重要的是，车前子醇提物和车前子水提物实验组中，高尿酸血症小鼠的血尿酸水平分别下降到159和201μmol/l(p<0.01)。车前子醇提物和车前子水提物都在这个模型中表现出显著的降血尿酸作用。

为研究车前子醇提物和车前子水提物对肾功能的影响，我们还测定高尿酸血症小鼠肾功能参数。尿素氮(bun)是肾功能主要指标之一。尿素氮是人体蛋白质代谢的主要终末产物，主要由肾小球(肾脏的重要组成部分)滤过排出体外。在肾功能损害早期，血尿素氮可在正常范围。当肾小球滤过率下降到正常的50％以下时，血尿素氮的浓度才迅速升高。因此，血尿素氮水平反映了肾功能的状况：血尿素氮的水平越高，肾功能的损伤程度越严重。结果如图2所示，高尿酸模型组(2.61mmol/l)与正常小鼠(2.48mmol/l)的bun没有明显差异(p>0.05)。别嘌呤醇组的bun(5.88mmol/l，p<0.01)比模型组更高，表明别嘌呤醇使高尿酸血症小鼠的肾功能受损。与别嘌呤醇组相比，用车前子醇提物和车前子水提物实验组血清bun参数分别为3.15和3.31mmol/l(p<0.01)，显著低于别嘌醇的对照。

肌酐，是含氮有机代谢物的代谢终产物，由肾小球滤过，随尿液排出。但肾功能受损失，肌酐含量上升。因此肌酐值成为评价肾功能的主要指标之一。如图3所示，与正常组小鼠(51.81mmol/l)相比，别嘌呤醇组小鼠的血清肌酸酐水平有所升高(65.18mmol/l，p<0.05)。苯溴马隆对照组(53.52mmol/l，p<0.05)和车前子醇提物实验组(50.48mmol/l，p<0.01)血清肌酸酐水平明显低于别嘌呤醇组。

各组小鼠体重变化如图4所示，试验进行3天后各组小鼠的体重均明显低于正常对照组。试验进行第7天车前子醇提物和车前子水提物实验组小鼠体重明显高于别嘌呤醇阳性对照组(p<0.05)。

上述结果说明，本发明所提取的车前子的乙醇和水提取物，可使高尿酸血症小鼠的血清中的尿酸含量水平显著降低。另外，车前子提取物对肾无毒性，可以用于降尿酸和改善痛风的药物、保健品或辅助药剂的制备。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。