不含铝的抑制腋臭的组合物的制作方法

本发明属于生物医药领域、涉及五环三萜类化合物和锌盐等组合物在制备腋臭治疗药物中的用途。

背景技术：

腋臭气味难闻，污染衣服，是一个令人痛苦和麻烦的问题。某些人对不愉快的气味表现出恐惧、厌恶或心理过敏，甚至导致有些人嗅觉恐惧症。腋臭严重影响工作、生活和社交。在日本，腋臭被认为是一种疾病，是国家健康保险的项目。腋臭人群在中国等亚洲人中大约有20%。

目前，市面上的抗腋臭药物多为抑汗剂，通过抑制腋下的大汗腺排汗，抑制腋臭的产生，其中主要的抑汗剂为碱式氯化铝或碱式氯化锆铝，这些抑汗剂的缺点是：1）机制不明；2）铝可能影响神经系统，存在不确定的安全性；3）有皮肤变黑或过敏等副作用。由于铝的安全的不确定性，因此，开发不含铝的腋臭治疗药物，是目前腋臭治疗药物制剂研发的主要方向。

技术实现要素：

针对现有技术的缺点和市场需要，本发明的目的在于提供一种不含铝的抑制腋臭的组合物。旨在克服铝的安全的不确定性。

本发明从以下几个方面入手，1）抑制腋下大汗腺排汗，降低汗液量，即降低臭物质前体的分泌量；2）抑制mrp8的活性，降低体味物前体向体外转运；即降低汗液中臭物质前体的量；3）杀灭能分解臭物质前体的细菌。

抑制排汗，降低腋下体臭物质的量，能起抑制腋臭的作用。体内排汗受一个复杂的机制控制。研究表明，钙离子激活的氯离子通道cftr(lérias,pintoetal.,cellularsignalling,2018,10-19)和tmem16a(wilsonandmetzler‐wilson,experimentaldermatology,2015,177-178)在初级汗液的形成过程起着重要的作用。tmem16a在顶分泌液腺中表达，多汗症与顶分泌液腺中的该基因的转录子剪切多样性有关。理论上，抑制tmem16a可能对抑制排汗起着重要的作用。

人体气味是一种复杂挥发性有机物（vocs）的混合物(takeuchi,yabukietal.,flavour&fragrancejournal,2013,223–230)。腋臭是由c2-c11的正、分支和不饱和有机酸组成的复杂混合物，其主要成分是€-3-甲基-2-己烯酸(e-3m2h)、3-羟基-3-甲基己酸(3h3m)、3-羟基-3-甲基己酸(hmha)、以及挥发性硫化合物，特别是3-甲基-3-硫-1-醇(3m3sh)(martin,saathoffetal.,journalofinvestigativedermatology,2010,529-540)，这种含硫化合物通常存在于很低的水平上，但具有很高的气味影响力(即低嗅觉阈值)。挥发性甾体，如5α-雄激素-16-烯-3-酮(雄甾酮)和5α-雄甾-16-烯-3β-醇(雄烯甾醇)，最初被认为与腋臭有关，但后来发现对感官和分析的贡献很小(prokop-prigge,greeneetal.,jchemecol,2016,33-39)。腋窝顶分泌液在分泌时其本身是无臭的，但由于顶分泌液中含腋臭前体物，在皮肤表面的腋窝微生物群落相互作用下，会产生3m2h、hmha和3m3sh等异味物质。3m2h、hmha等臭物质的谷氨酰胺结合物，如：3m2h-gln、hmha-gln，以及3m3sh的cys-gly-(s)共轭物(barzantny,bruneetal.,internationaljournalofcosmeticscience,2012,2-11)（如图2），被认为是关键的体味物的前体(martin,saathoffetal.,journalofinvestigativedermatology,2010,529-540,baumann,bergmannetal.,experimentaldermatology,2014,247–252)。腋窝中的密度较大的细菌种群主要有两种类型，金黄色葡萄球菌（staphylococcusepidermidis)(leyden,mcginleyetal.,journalofinvestigativedermatology,1981,413-416)和和棒状杆菌(corynebacteriumxerosis)(barzantny,bruneetal.,internationaljournalofcosmeticscience,2012,2-11)。业已发现密度较大的棒状杆菌和强烈的腋臭之间有很强的相关性(prokop-prigge,greeneetal.,jchemecol,2016,33-39)。因此，能杀灭或抑制这些细菌生长的物质，有抑制腋臭作用。

研究表明，体味物前体的分泌与人的abcc11基因有关，在人的大汗腺内的极化细胞中，这个基因表达一个体味物质前体的转运蛋白质mrp8，而没有腋臭的人群中，这个基因发生了538g>a突变(蛋白质上为g180r)。在有腋臭的病人腋窝内汗腺中能检测到abcc11的基因表型为538gg和538ga的蛋白质表达。而在基因型为aa的人腋窝汗腺中检测不到abcc11的表达(toyoda,takadaetal.,intjmolsci,2017)，是因为g180r突变损害了mrp8在细胞外环上的asn838和asn844两个残基上的n-糖基化，降低了蛋白质的稳定性，从而变得容易降解(saito,osumietal.,aapsjournal,2009,581)。abcc11编码的mrp8蛋白在腋顶腺的排泄功能中起着重要的作用。杂合子(ga)和纯合子(gg)个体能将这些体味前体物分泌出体外，然后，在细菌作用下，代谢成臭味物质。aa纯合子人的腋顶腺的abcc11功能缺失，特异性气味物质氨基酸结合物（体味物前体）的分泌被阻断，体味物质及其前体的分泌明显减少。这些数据表明mrp8在分泌汗腺中的气味及其前体中起着关键作用(martin,saathoffetal.,journalofinvestigativedermatology,2010,529-540)。拥有等位基因g是腋臭表达的先决条件。因此，理论上，抑制mrp8活性，能降低体味物质前体的转运；α-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制蛋白质的n-糖基化，能降低mrp8蛋白质的稳定性，从而降低其蛋白质水平，能达到抑制腋臭的目的。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种不含铝的抑制腋臭的组合物，其特征在于包括如下组份：1）抑汗剂，抑制大汗腺排汗；2）mrp8抑制剂，抑制臭物质前体的转运；3）抗菌剂，能抑制表皮金黄色葡萄球菌（staphylococcusepidermidis）和棒状杆菌（corynebacteriumxerosis）生长；4）辅料。

1）抑汗剂

所述抑汗剂是一类锌盐，这类化合物含有两个或两个以上配基的多配基锌盐，其中包括氨基酸锌，即甘氨酸锌、丙氨酸锌、蛋氨酸锌、谷氨酰胺锌、天冬氨酸锌、谷氨酸锌、赖氨酸锌，缬氨酸锌、亮氨酸锌、异亮氨酸锌、苯丙氨酸锌、脯氨酸锌、色氨酸锌、丝氨酸锌、酪氨酸锌、半胱氨酸锌、蛋氨酸锌、谷氨酰胺锌、苏氨酸锌、精氨酸锌、组氨酸锌、牛磺酸锌；和多元有机酸锌盐，即柠檬酸锌，洒石酸锌，苹果酸锌，丙二酸锌、草酸锌等，但不限于这些化合物。这些化合物的每个分子中含一个或多个羧基或胺基，能与zn²⁺形成多个配位键。

这些锌盐还包括单配基的锌盐，即葡萄糖酸锌、乳酸锌、苯磺酸锌、硫酸锌、氯化锌和乙酸锌等，但不限于这些化合物。

zn²⁺可抑制氯离子通道tmem6a的活性，能抑制初级汗液的形成。最好是由一种或多种有含两个或两个以上配基锌盐与一种或多种可溶性的单配基的锌盐复配。用量为0.5%-20%。

2）mrp8抑制剂

所述mrp8的抑制剂是一类五环三萜类化合物，包括：甘草次酸（glycyrrheticacid）、山楂酸（maslinicacid）、齐墩果酸（oleanolicacid）、熊果酸（ursolicacid）、科罗索酸(corosolicacid)和积雪草酸（asiaticacid），及其盐和其衍生物。这类化合物能直接作用于mrp8蛋白质上，与mrp8结合，抑制其活性，在配方中，可以是其中的一种或几种组合，其用量占总重量的0.01%-5%。

所述的mrp8的抑制剂也可以是一类α-葡萄糖苷酶抑制剂，可以包括：1-脱氧野尻霉素及其衍生物，如：1-脱氧野尻霉素、米格鲁特、米格列醇，以及含1-脱氧野尻霉素的天然提取物，如：桑叶提取物等，这类物质通过抑制α-葡萄糖苷酶，抑制mrp8的n-糖基化，降低mrp8稳定性，从而降低mrp8水平，达到抑制体味物质前体转运的目的，其用量占总重量的0-5%。

zn²⁺能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，含有上述两个或两个以上配基的多配基锌盐、单配基的锌盐及其复配物同时也是mrp8的抑制剂，能降低mrp8水平，有抑制体味物质前体转运的作用。

3）抗菌剂

所述抗菌剂为五环三萜类化合物，包括：甘草次酸（glycyrrheticacid）、山楂酸（maslinicacid）、齐墩果酸（oleanolicacid）、熊果酸（ursolicacid）、科罗索酸(corosolicacid)和积雪草酸（asiaticacid），以及其衍生物等。

所述抗菌剂可以是一类抗菌促进剂，即锌盐，含有上述两个或两个以上配基的多配基锌盐、单配基锌盐及其复配物同时也一类抗菌促进剂。

4）辅料

所述辅料可以是表面活性剂、助表面活性剂、油脂、调理剂、防腐剂、酸度调节剂中的一种或几种的复配。

表面活性剂：所述表面活性剂，是一类非离子表面活性剂，如：脂肪醇（8-18个碳）聚氧乙烯醚（12-20）(如：steareth-20，isosteareth-12，isoceteth-20、ceteareth-20等)；聚氧乙烯醚（12-25）脂肪酸（8-18个碳）酯（如：聚乙二醇(23)异硬脂酸酯、聚乙二醇(14)油酸酯、co40）；聚乙二醇（6-23）脂肪酸（8-18个碳）甘油酯（如：聚乙二醇(20)月桂酸甘油酯、聚乙二醇(20)油酸甘油酯等）；聚乙二醇脱水山梨糖醇单脂肪酸（8-18个碳）酯（tw-20、tw-80等）；脂肪酸单糖或多糖酯；或是两性表面活性剂，如：卵磷酯；阴离子表面活性剂：如：十二烷基硫酸钠等；可以是其中一种或几种复配。

助表面活性剂：可以是短链醇（c2-c6）如：乙醇、丙醇、丁醇，1-己醇等；多元醇如：丙二醇、1,2-丁二醇，1,2-戊二醇，1,2-己二醇，1,2-辛二醇，丙三醇、1,3-丁醇等等；短链酸如：丙酸、丁酸，油酸；聚二醇类如：二乙二醇乙醚(卡必醇)、聚乙二醇400（peg400），甲酰胺，乳酸丁酯等；氨基酸类，如：赖氨酸等。抗菌剂spectrastatphl也具有良好的助表面活性剂作用，可以是其中一种或几种复配。

油脂：所述油脂，可以是短链的酯类，如：肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、碳酸二辛酯、辛酸/癸酸甘油三酯、甘油三乙酯、三丁酸甘油酯、三辛酸甘油酯、丙二醇辛酸酯，丙二醇二辛癸酯、已二酸二异丙酯、已二酸二丁酯、棕榈酸异丙酯、油酸乙酯、油酸正丁酯、乙酰化单甘酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、注射级大豆油等。可是一些有一定亲水性的油酯，如：甘油单酯(单月桂酸甘油酯，单油酯甘油酯、单异硬酯酸酯、单肉豆蔻酸甘油酯等、单辛酸甘油酯)、乳酸酯（如：月桂醇乳酸酯、肉豆蔻醇乳酸酯、c12-13醇乳酸酯、异硬脂醇乳酸酯等）等，可以是其中一种或几多复配。

调理剂：可以是甘油、丙二醇、挥发性硅油、维生素e等，抗菌剂spectrastatphl也具有调理作用。

防腐剂：可以是一些刺激性小，温和的防腐剂，如：1,2-己二醇、spectrastatphl等。

酸度调节剂，助渗剂和抗氧剂：酸度调节剂可选用三乙醇胺;助渗剂可选择氮酮；抗氧剂选ve。

本发明的有益效果是：1）机制明确，成分明确，2）不含铝，不含可释放甲醛的乌托品，长期使用安全；3）起效快，效果持久。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的描述。

图1是能用于抑制腋臭的化合物化学结构图。a是五环三萜类化合物。b是1-脱氧野尻霉素（1-dnj）及其衍生物。

图2是腋窝顶分泌液中的体味物前体化学结构图。

图3是本发明实施例的组份示意图。

图4是五环三萜类化合物抑制mrp8对甲氨蝶呤的外排示意图。

图5是五环三萜类化合物抑制mrp8对甲氨蝶呤的外排的ic50（μm）示意图。

图6是测试样品的对两种腋臭相关细菌的最小抑制浓度(mic)(μg/ml)示意图。

图7是几个化合物调节细胞中mrp8水平图。

图8是各实施例中组合物复配组份示意图。

具体实施方式

参见图3，本发明一种不含铝的抑制腋臭的组合物实施例，是一种微乳液，所述组份组成包括基础微乳液、活性成分和其它助剂的三部分混合，其占总重量中组份为：

基础微乳液：月桂醇乳酸酯（la-20）1%-10%、peg40蓖麻油（co40）0.5%-10%、丙三醇1%-20%、无水乙醇1%-30%、水30%-80%；基础微乳液透明，可无限稀释，并可根据所载活性物的溶解性，选择la-20与其它油脂复配，如：la-20与油酸乙酯，la-20与碳酸二酯；

活性成分：五环三萜类化合物单体或单体组合物0.01%-5%、可溶性单配基或多配基锌盐或其组合物0.5%-10%、1-脱氯野尻霉素或其衍生物0-5%。

其它助剂：十二烷基硫酸钠（k12）0-3.0%、脂肪酸蔗糖酯（se）0-3.0%、spectrastatphl0.1%-4%、氮酮0.1%-3%、ve0-1%、赖氨酸0.5%-4%、三乙醇胺0.5%-5%，水加至100%。这些助剂能增强五环三萜类化合物的加载量，提高了多配基锌盐的溶解性。

本实施例是在基础微乳液配方的基础上加载活性成分和其它助剂制得。

实验1：五环三萜类化合物对mrp8外排转运的抑制作用

为了测定五环三萜类化合物对mrp8的抑制作用，先制备mrp8过表达的细胞。首先克隆abcc11基因，参考文献(leier,jedlitschkyetal.,journalofbiologicalchemistry,1994,27807-27810,bera,leeetal.,molecularmedicine,2001,509-516)方法，采用5‘-cctagtactgatcacctgcgcatcgct-3’和5‘-agcgatgcgcaggtgatcactagg-3’两条引物进行racepcr，将4.1kb的pcr产物克隆到pcdna3.1载体，得质粒pcdna3.1\abcc11，再转染llc-pk1细胞，g418筛选制得过表达mrp8的llc-pk1-abcc11稳定细胞株。五环三萜类化合物对mrp8外排抑制作用，采用lc-ms/ms(tun-yhong,chinpaisaletal.,antimicrobialagents&chemotherapy,2017,aac.01725-01716)方法。首先，将表达mrp8的稳定细胞株以3×10⁵个接种于12孔板，其中含m199培养基，3%热灭活的胎牛血清，100μg/ml双抗和2μg/ml的嘌呤霉素盐酸盐。细胞于37℃，5%的co2培养箱中培养24h，溶于dmso中的样品用培养基稀释，然后细胞用终浓度为10μm的五环三萜类化合物于37℃，5%co2孵育1h，再加入160μm甲氨蝶呤（methotrexate，mtx）,于37℃，5%co2摇床孵育1h，用冰育过的pbs洗涤细胞3次，除去细胞外的药物，对细胞进行计数，然后，用100μl70%（v/v）冰育过的甲醇重浮细胞，-20℃孵育过夜，加入内标溶液5μl（氯霉素1.6μg/ml），10,000g离心15min，除去细胞碎片，采用lc-ms/ms测定其中甲氨蝶呤的含量。液相色谱分离使用的流动相为：乙腈：1mm甲酸铵(含0.1%甲酸)为18:82（v/v)，流速为0.4ml/min，采用分析柱(c18zorbaxeclipsexdb,agilent™,u.s.a.)，柱温35℃。

实验证明(参见图4)，在表达mrp8的llc-pk1细胞中，当没有五环三萜类化合物存在时，甲氨蝶呤因被mrp8外排，细胞中的含量很低。10μm的甘草次酸（glycyrrheticacid，ga）、山楂酸（maslinicacid，ma）、齐墩果酸（oleanolicacid，oa）、熊果酸（ursolicacid，ua）、科罗索酸(corosolicacid,ca)和积雪草酸（asiaticacid，aa）都能显著的抑制mrp8对甲氨蝶呤的转运，提高细胞对甲氨蝶呤的摄取，因此这些五环三萜类化合物能抑制mrp8的转运（参见图5）。

实验2：五环三萜类化合物对表皮金黄色葡萄球菌和棒状杆菌的抗菌活性

五环三萜类化合物对黄色葡萄球菌和棒状杆菌的抗菌活性，实验用细菌种类有：表皮金黄色葡萄球菌（staphylococcusepidermidis)和棒状杆菌(corynebacteriumxerosis)，为腋臭主要相关菌种。测试样品为：甘草次酸（glycyrrheticacid，ga）、山楂酸（maslinicacid，ma）、齐墩果酸（oleanolicacid，oa）、熊果酸（ursolicacid，ua）、科罗索酸(corosolicacid,ca)和积雪草酸（asiaticacid，aa）等，以卡那霉素硫酸盐为阳性对照，以甲醇为阴性对照。测定方法参考文献方法(rahmanm.&graya.,phytochemistry,2005,66:1601-1606)。待测试样品、卡那霉素硫酸盐分别溶于甲醇(meoh)中，配制成为lmg/ml的溶液。将100μg/ml的刃天青指示剂加入到96孔细胞培养板的第12列孔中，7.5ml100μg/ml的刃天青溶液和5ml含细菌(106cfu/ml,od=o.07)的培养液混匀，然后分别加入到第1-11列中，每个培养孔中加入100μl上述刃天青和细菌培养液的混合物。溶于dmso中的样品，用培养基稀释，再往培养板中每列的第一个孔中加入100μl浓度为lmg/ml的测试样品，混匀，从中吸取100μl溶液打到第二个孔中，依此类推，一直到第十个孔，最后移走100μl。测试样品的浓度变化为：500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.2μg/ml、15.6μg/ml、7.8μg/ml、3.9μg/ml、1.9μg/ml、和0.9μg/ml；然后将培养板放在37⁰c的培养箱中培养5-6小时，未由蓝色变为粉红色表示有抗菌活性。当第11列培养液由蓝色变为粉红色时，最后一个未由蓝色变为粉红色的孔中样品浓度为测试样品的最小抑制浓度(mic)。结果表明（图6），这些五环三萜类化合物对黄色葡萄球菌和棒状杆菌有良好的抗菌活性。

实验3：1-脱氧野尻霉素（1-dnj）和zn²⁺对mrp8的抑制作用

1-脱氧野尻霉素是α-葡萄糖苷酶抑制剂。我们检测了1-脱氧野尻霉素、桑叶提取物和zn²⁺对mrp8的稳定性的抑制剂作用。mdckii细胞在dmem中（含小牛血清10%，双抗1%）于37℃5%co2的孵箱中培养。将质粒pcdna3.1\abcc11转染mdckii细胞，转染48小时后，细胞分别加入4.0μg/ml的1-脱氧野尻霉素、400μg/ml的桑叶提取物、50μg/ml葡萄糖酸锌、10μg/ml硫酸锌，再孵育24h。裂解细胞，加入糖苷酶pngasef，于37℃处理10min，然后进行蛋白质westernblot分析。

结果如图7。本实验证明，1-脱氧野尻霉素可以调节mrp8水平，这是因为1-脱氧野尻霉素是α-葡萄糖苷酶抑制剂，可以抑制mrp8在838位和844位上的n-糖基化。桑叶提取物中含1%-5%的1-脱氧野尻霉素。1-脱氧野尻霉素的n取代物，如：米格鲁特、米格列醇，也是n-糖基化的抑制剂，应能降低mrp8的水平。

50μg/ml葡萄糖酸锌和10μg/ml硫酸锌也能降低mrp8水平，这可能与zn²⁺能抑制α-葡萄糖苷酶有关，从而降低mrp8的n-糖基化水平。

由于这些物质能抑制mrp8的n-糖基化，从而降低mrp8的稳定性，降低其蛋白质水平，因此，1-脱氧野尻霉素和zn²⁺能抑制臭物质的转运。

实验4：zn²⁺抑制tmem16a诱导的氯离子外流

抑制汗腺细胞中的cl^-外流可以抑制初级汗液的形成，达到抑制排汗的目的。人类汗腺细胞系ncl-sg3在william'se培养基中（含小牛血清10%，双抗1%），细胞密度为20,000cells/well，于黑色的96孔板中，于37℃5%co2的孵箱中培养。将黄色荧光蛋白的实变体质粒pcdna3.1-yfp(h148q/i152l/f46l)转入细胞中。第二天，每孔用200μl的pbs洗涤3次，每孔加入50μlpbs、0.5μl待测化合物dmso溶液，10min后，在fliprtetr上测定细胞内的本底荧光（激化光500±10nm，发射光535±15nm），本底荧光作阳性对照(抑制率为0%)，然后，加入50μl含140mmnai和200μmatp溶液（用于测定tmem16a，ca²⁺激活）6min后，测定每个孔的荧光。当细胞中的tmem16a被atp激活时，细胞外的i-离子进入细胞，cl^-流出细胞，细胞中yfp的黄色荧光被i^-淬灭，荧光强度降低，以atp存在下的无待测化合物条件下的测定值为阴性对照（抑制率为100%）。化合物的抑制率为：1-（待测化合物的值-阳性对照值）/（阴性对照值-阳性对照值）x100%，并计算ic50。葡萄糖酸锌抑制cl^-外流的ic50值为80.85±0.28μm，硫酸锌为10.85±0.28μm，因此，含zn²⁺化合物有抑汗作用。

本发明可以是一种霜剂、或一种酊剂、或一种喷剂、或一种rollon剂。

生产方法

根据所述实施例的配方（图8），用以下方法进行生产。

实施例1：

按配比混合，装装入喷雾瓶，为喷剂。本剂方透明，稳定。

实施例2：

按配比，将甘草次酸（ga）、1-脱氧野尻霉素（1-dnj）、鲸蜡硬脂醇醚-6(a6)、鲸蜡硬脂醇/鲸蜡硬脂醇醚-25（a25）、脂肪酸蔗糖酯（se）、月桂醇乳酸酯(la20)、pgcc、spectrastatphl、氮酮、维生素e(ve)、三乙醇胺、甘油、无水乙醇混合至全溶，将赖氨酸加入到10%的可溶单配基锌盐溶液中溶解，再加入到前面的混合液中，搅拌半小时，得透明的微乳液，装入喷雾瓶中，为喷剂。

实施例3：

按配比，将甘草次酸（ga）、1-脱氧野尻霉素（1-dnj）、co40、月桂醇乳酸酯(la20)、spectrastatphl、氮酮、维生素e(ve)、三乙醇胺、甘油、无水乙醇混合至全溶，将赖氨酸加入到10%的可溶单配基锌盐溶液中溶解，再加入到前面的混合液中，搅拌半小时，得透明的微乳液，装入喷雾瓶中，为喷剂。

实施例4：

按配比，将甘草次酸（ga）、co40、月桂醇乳酸酯(la20)、spectrastatphl、氮酮、维生素e(ve)、三乙醇胺、甘油、无水乙醇混合至全溶，再加入脂肪酸蔗糖酯（se）、赖氨酸、可溶单配基锌盐和多配基锌盐溶液中溶解，加水至100%，搅拌半小时，得透明的乳液，装入喷瓶，为喷剂。