一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法和应用与流程

本发明属于酶电极技术领域，涉及一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法和应用。

背景技术：

血糖监测是糖尿病管理中的重要组成部分，其结果有助于评估糖尿病患者糖代谢紊乱程度，制定合理的降糖方案，防止并减少并发症的产生。传统血糖监测采用血糖试条对末梢血糖的浓度进行检测，即指血测糖。但是，它一次只能给出一个时间点的血糖数值(即瞬间血糖)，存在着一定的片面性，并且由于瞬间血糖值容易受运动、饮食、药物、情绪波动等诸多因素影响，采用该方法无法反映出患者全面的“血糖谱”，也很难发现无症状的高血糖和低血糖。而同时获得多个血糖数据就得忍受频繁针刺的疼痛感，为患者带来了很差的体验。

连续动态的血糖监测系统(continuesglucosemonitoringsystem,cgms)通过在患者皮下组织植入或者佩戴长时间的葡萄糖传感器，来实现24小时不间断地测定人体葡萄糖浓度变化。该系统平均每几分钟记录一个葡萄糖数值，连续提供患者每日血糖图波动趋势，同时能够减轻患者频繁指血测糖的痛苦。它还可以捕捉到末梢血糖无法发现的不知觉低血糖、餐后血糖的峰值、高低血糖持续时间等相关信息，更加有利于患者了解自身血糖变化状况，也能够为临床医师选择药物、判断疗效、制订合理的饮食结构提供最科学的依据，进而达到既严格控制血糖又可避免血糖大幅度波动目的，使病人的血糖控制接近正常生理水平，从而有效防止或延缓并发症发生。

目前主流的植入式动态血糖检测方法采用氧气依赖的葡萄糖氧化酶电极对皮下的葡萄糖进行连续监测，给出的血糖动态变化值。但是，由于皮下组织葡萄糖浓度较高，而氧气浓度又相对较低(一般低于30μm)，因此采用氧气作为天然电子传递剂的酶电极反应受制于皮下组织的氧气浓度影响，需要严格抑制葡萄糖在电极上的扩散速度，才能得到较好的电极检测范围。而且该类型电极也易受皮下氧气浓度波动的影响，引起葡萄糖浓度的读数误差。除此之外，氧气依赖酶电极反应生成的底物是过氧化氢，而过氧化氢具有较大的生物毒性，因此，基于氧气依赖的植入式葡萄糖氧化酶电极并不是动态血糖监测的理想选择。基于葡萄糖脱氢酶的电极虽然不受氧气浓度变化的影响，但是由于其受到体内外的常见的干扰物质影响过大，酶催化效率低且特异性不高，也不适用于植入式的动态葡萄糖的监测。因此，依赖人工加入电子传递剂的氧化酶电极应用于皮下低氧环境下持续的葡萄糖监测受到了强烈的关注。人工加入的电子传递剂能够代替氧气接受酶催化反应过程中的电子，增加电子传递速率，提高电极反应效率。而且基于电子传递剂的酶电极反应过程中并不会产生过氧化氢，降低了电极可能产生的生物毒性。

一般常用的电子传递剂包括有机金属氧化还原物质如二茂铁及其衍生物、具有醌式结构的罗蓝或者靛酚、无机氧化还原物质如铁氰化物或者钌的氧化物等，而一些具有氧化还原性质的高分子聚合物也可作为酶电极反应过程中的电子传递剂。二茂铁及其衍生物因其具有良好的电子结构及氧化还原性质是一种常用的酶电极的电子传递剂。二茂铁属于有机小分子不易容易水，目前主要采用分步修饰的方法将溶于有机溶剂的二茂铁首先修饰到电极上然后再进一步修饰酶层，但是这样会阻碍二茂铁与酶之间的电子传递，大大降低了酶电极的反应效率，且二茂铁小分子没有进行固定，非常容易从电极层上流失。一些研究利用一些高分子膜物质形成网状结构来承载二茂铁小分子，虽然能一定程度提高二茂铁在电极上的稳定性，但二茂铁分子较小，依旧容易流失。而一些研究则通过类似主客体的方法将二茂铁溶于环糊精的有机官能团的中心，而利用环糊精良好的水溶性将该二茂铁与酶进行复合，而环糊精聚合物能够以稳定的状态存在电极表面。然而，事实上，在酶电极反应过程中，二茂铁失去电子后被氧化后的产物处于阳离子带正电荷的状态，极性发生了巨大变化，其与环糊精的结合能力则大大降低，若将其用于长时间的酶电极催化反应，依然存在二茂铁流失的问题。而采用带负电的高分子聚合物或者是纳米粒子仅仅能够有效吸附二茂铁阳离子氧化产物不会流失，但是又无法阻止零价态的二茂铁的流失。

总之，现有的方法大部分只是对单一状态的二茂铁或者二茂铁阳离子进行固定，无法对酶电极反应中两种形态的二茂铁进行固定，二茂铁的流失不仅会造成基于该电子传递剂的酶电极及其他相关电极检测性能的下降，同时流失的二茂铁也可能对生物体产生毒性，这是限制二茂铁电子传递剂应用于酶电极检测的主要瓶颈问题。

技术实现要素：

针对现有技术中固定修饰二茂铁电子传递剂方法存在的技术缺陷，本发明得目的在于提供一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法，通过同时对两种价态的二茂铁进行固定，来提高酶电极的稳定性；本发明的目的还在于提供该多步固定修饰的酶电极在长期动态检测血糖中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供一种基于多步固定修饰的酶电极的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一，将β-环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液a；向溶液a中加入二茂铁和/或二茂铁衍生物混合溶解，得到溶液b；

步骤二，将溶液b与nafion溶液(购买于杜邦公司，浓度为20％)混合至沉淀消失后得到透明的溶液c；

步骤三，向溶液c中加入牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶和戊二醛的水溶液进行充分交联反应，得到溶液d；

步骤四，将溶液d修饰到基底电极的工作电极区域的表面，得到初步修饰的酶电极；

步骤五，将有机高分子聚合物溶液修饰到酶电极的工作电极区域的表面，烘干成膜后得到固定修饰的酶电极。

本发明中，发明人通过对二茂铁及其衍生物采取三步固定修饰制备获得酶电极。采用主客体的方式对二茂铁及其衍生物进行初步的修饰固定，使二茂铁及其衍生物能够初步吸附在环糊精的有机官能团中心；进一步将二茂铁及其衍生物的环糊精的溶液与nafion进行共混合，nafion作为带强烈负电的高分子聚合物能够将阳离子态的二茂铁牢牢吸附在电极表面，防止其从电极上流失，实现第二步的修饰固定；通过与酶液混合，得到最终的酶修饰液，实现酶与电子传递剂直接混合的单层生物响应传感层，提高二茂铁及其衍生物与酶之间的电子传递效率；然后通过有机高分子聚合物溶液对生物传感层表面继续修饰一层致密的有机高分子膜层，进一步减缓二茂铁主客体及其他酶电极组成成分的流失，实现第三步的修饰固定，采取三步固定法能够有效防止零价态和阳离子氧化态二茂铁的流失。本发明采用环糊精与nafion对两种价态二茂铁的吸附固定作用产生的叠加效应，有效解决了电子传递剂酶电极固定二茂铁与其阳离子产物无法兼顾的缺点；此外，采用更加致密的有机高分子聚合物的膜结构对二茂铁的生物酶层统一包覆，进一步提高了二茂铁酶电极的稳定性。本发明利用多组分、多步骤固定的方式将二茂铁及其衍生物稳定修饰在酶电极上，得到的电极能够用于葡萄糖长时间的稳定监测。

上述的制备方法，优选地，所述二茂铁衍生物可以包括乙烯基二茂铁和/或甲基二茂铁等。

上述的制备方法，优选地，在步骤一的溶液b中，所述β-环糊精的浓度为10-70mg/ml；所述二茂铁和/或二茂铁衍生物的总浓度为0.5-2mg/ml；所述戊二醛的质量分数为5％-10％；所述戊二醛的水溶液的浓度为50％。

上述的制备方法，优选地，步骤一具体步骤为：将β-环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液a；向溶液a中加入二茂铁和/或二茂铁衍生物并在18℃-25℃温度下用以400-2000转/min的速度搅拌12-24h，使其充分溶解，得到溶液b。

上述的制备方法，优选地，在步骤二的溶液c中，所述nafion的质量分数为1％-2.25％。

上述的制备方法，优选地，步骤二的具体步骤为：将溶液b与nafion溶液充分混合，并在18-25℃温度下以400-2000转/min的速度搅拌12-24h，混合均匀，得到溶液c。

上述的制备方法，优选地，在步骤三的溶液d中，所述牛血清白蛋白的浓度为5-20mg/ml；所述葡萄糖氧化酶的浓度为5-10mg/ml；所述戊二醛的质量分数为0.05％-0.1％；所述戊二醛水溶液的浓度为10％。

上述的制备方法，优选地，所述溶液d修饰的方式包括滴涂法、喷涂法或浸泡法等。初步修饰后的酶电极需要放置4℃冰箱内晾干保存备用。

上述的制备方法，优选地，所述基底电极为柔性片状电极和/或柱状金属电极。

本发明的制备方法中，用于修饰的基底电极可采用柔性片状电极，其材质可以由常用的聚对苯二甲酸乙二酯膜作为基底，通过印刷、溅射、滴涂等方法将导电材质如金，铬，铂等导电材料修饰到基底上；也可通过类似方法将碳纳米管或者石墨导电层修饰到基底，再通过如光刻或者掩膜刻蚀等方式对导电部分进行绝缘，使基底只暴露出工作电极区域、参比电极区域和对电极区域，最后可用切割等方式得到单独的植入的柔性基底电极。此外工作电极也可以采用铂铱丝或者金丝作为基底，可以用绝缘膜通过喷涂的方式对导电部分进行绝缘，只露出柱状工作电极表面部分，再通过在柱状电极表面喷涂银氯化银浆的方式，得到柱状电极的参比电极。

上述的制备方法，优选地，所述有机高分子聚合物溶液的制备方法为：将有机高分子聚合物溶解于丙酮中，均匀搅拌12-24h后获得；所述有机高分子聚合物的浓度为1％～5％。

上述的制备方法，优选地，所述有机高分子聚合物包括醋酸纤维素、聚氨酯和聚碳酸酯中的一种或多种的组合。

上述的制备方法，优选地，所述有机高分子聚合物溶液修饰的方式包括滴涂法、喷涂法或浸泡法等。

上述的制备方法，优选地，所述烘干的温度为37℃。

由于固定的二茂铁的环糊精聚合物其分子量较小，且有一定的水溶性，同时nafion成膜后空隙较大，依然容易造成环糊精包裹的二茂铁及其他生物传感成分的从电极上的流失，因此，采取有机高分子聚合物溶液初步修饰的酶电极进行第三次固定，在其表面进一步修饰稚密的醋酸纤维素高分子层，进一步减缓二茂铁主客体及其他酶电极组成成分的流失，同时醋酸纤维素也能够提高电极的生物相容性和检测的线性范围。

另一方面，本发明还提供一种多步固定修饰的酶电极，其是采用上述制备方法制备得到的。

再一方面，本发明还提供上述多步固定修饰的酶电极在长期动态检测血糖中的应用。所述应用是基于固定后的二茂铁电子传递剂应用于皮下长期检测葡萄糖相关物质的应用，将该固定修饰的酶电极发展成为一种低成本、稳定的持续动态葡萄糖检测的分析方法，对于血糖持续监测和糖尿病的动态分析管理具有重要的意义；也适用于其他生物环境的检测如脑内植入或者血管内植入的葡萄糖检测的应用。

本发明的有益效果：

本发明多步固定修饰的酶电极具有很好的稳定性，在溶液中能够稳定15天，对葡萄糖具有很好的响应；将该固定修饰的酶电极发展成为一种低成本、稳定的持续动态葡萄糖检测的分析方法，对于血糖持续监测和糖尿病的动态分析管理具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1中酶电极在pbs溶液中的电化学响应图；

图2a为实施例1中酶电极对于葡萄糖的时间线性图；

图2b为实施例1中酶电极对于葡萄糖的浓度线性图；

图3为实施例1中酶电极对于葡萄糖的抗干扰图；

图4a为实施例1中获得的酶电极长时间稳定性的测试图；

图4b为对比例1中获得的酶电极长时间稳定性的测试图；

图4c为对比例1中获得的酶电极长时间稳定性的测试图；

图4d为对比例1中获得的酶电极长时间稳定性的测试图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的β-环糊精，二茂铁，购于sigma-aldrich公司，其他未说明也至少为分析纯。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。

实施例1

本实施例提供一种多步固定修饰的酶电极及其制备方法，该酶电极的制备方法如下：

步骤一，首先将50％戊二醛溶解于去离子水中，充分搅拌后，加入β-环糊精，然后充分搅拌24小时，使β-环糊精能够充分溶解，得到溶液a；随后将二茂铁加入到溶液a中并在20℃以500rpm的转速搅拌24小时，随后得到溶液b，其中溶液b中，二茂铁的浓度为2mg/ml，β-环糊精的浓度为20mg/ml，戊二醛的质量分数为8.5％。

步骤二，向1.8ml溶液b中加入0.2ml杜邦20％的nafion溶液，并继续混合搅拌24小时，待溶液完全均匀混合无沉淀后，得到透明的溶液c，溶液c中nafion的浓度为2％。

步骤三，向2ml溶液c中加入20mg葡萄糖氧化酶，并加入10mg牛血清白蛋白，随后加入10mg的10％戊二醛水溶液进行充分交联反应，得到溶液d，放置于4℃的冰箱内，保存备用；

步骤四，将溶液d采取采用滴涂的方式修饰到片状柔性工作电极的表面。除此之外，也可采用浸泡等方式将酶液修饰到电极表面；最后，得到的电极在4℃的冰箱内晾干保存备用；

其中，片状柔性工作电极是通过以下方法制备的：用于修饰的基底电极可采用柔性片状电极，其材质可以由聚对苯二甲酸乙二酯膜作为基底，通过溅射的方法将0.1um厚度的金沉积到基底上，再通过光刻掩膜刻蚀的方式对导电部分进行绝缘，使基底只暴露出工作电极、参比电极与对电极区域，最后切割得到单独的植入的柔性基底电极。

步骤五，取醋酸纤维素溶解于丙酮中充分溶解，得到5％的醋酸纤维素溶液。随后将得到的醋酸纤维素溶液利用滴涂的方式修饰到上述步骤四酶电极的工作电极区域的表面，并在干燥箱中37℃烘干1h，即可得到具有良好的稳定性和电化学响应的电极。

参见图1可以看出，在加入葡萄糖后，该实施例1的酶电极对于葡萄糖具有非常好的电化学响应电流，说明二茂铁在此过程中起到了增加电子转移速率的作用。

参见图2a和图2b，该实施例1的酶电极具有很好的线性范围，其最大线性检测浓度能够达到30mm。

参见图3，该实施例1的酶电极对于依次加入的0.4mm尿酸、0.1mm抗坏血酸、0.2mm对乙酰氨基酚、0.1mm半胱氨酸等都具有很好的抗干扰能力。

最重要的是，本发明采用多步固定的方法得到的基于人工加入的电子传递剂的酶电极具有良好的稳定性。具体参见图4a，可以看出酶电极上的二茂铁响应电流非常稳定，即使浸泡15天，依然保持着较佳的稳定性能。

实施例2

本实施例提供一种多步固定修饰的酶电极及其制备方法，该酶电极的制备方法如下：

步骤一，首先将50％戊二醛溶解于去离子水中，充分搅拌后，加入β-环糊精，然后充分搅拌24小时，使环糊精能够充分溶解，得到溶液a；随后将二茂铁加入到溶液a中并在20℃以500rpm的转速搅拌24小时，随后得到溶液b，其中，溶液b中二茂铁的浓度为1mg/ml，β-环糊精的浓度为10mg/ml，戊二醛的质量分数为5％。

步骤二，向1.9ml溶液b中加入0.1ml的杜邦20％的nafion溶液，并继续混合搅拌24小时，待溶液完全均匀混合无沉淀后，得到透明的溶液c，溶液c中nafion浓度为1％。

步骤三，向溶液2ml的溶液c中加入10mg葡萄糖氧化酶，并加入20mg牛血清白蛋白，10mg的10％戊二醛水溶液进行充分交联反应，得到溶液d，放置于4℃的冰箱内，保存备用；

步骤四，将溶液d采取浸泡的方式修饰到柔性柱状电极的表面。最后，得到的电极在4℃的冰箱内晾干保存备用；

其中，柱状柔性工作电极是通过以下方法制备的：采用铂铱丝或者金丝作为基底，可以用通过喷涂绝缘膜的方式对导电部分进行绝缘，只露出柱状工作电极表面部分，再通过在柱状电极表面喷涂银氯化银浆的方式，得到柱状电极的参比电极。

步骤五，取聚氨酯溶解于丙酮中充分溶解，得到3％的聚氨酯溶液。随后将得到的聚氨酯溶液利用浸泡的方式修饰到上述步骤四酶电极的工作电极区域的表面，并在干燥箱中37℃烘干1h，即可得到具有良好的稳定性和电化学响应的电极。

对比例

发明人设计了3种对比例，3种对比例均采用2种固定修饰方式。

对比例1只采用β-环糊精与nafion的组合(即：省略了实施例1中的步骤五，无需进行有机高分子聚合物溶液对酶电极进一步修饰)；

对比例2只采用β-环糊精与醋酸纤维素的组合(即：省略了实施例1中的步骤二，溶液b无需与nafion溶液混合而直接进行步骤三)；

对比例3只采用nafion与醋酸纤维素的组合(即：省略了实施例1中的步骤一，即二茂铁直接参与步骤二，与nafion溶液混合)。

实验结果如图4a(实施例1)、图4b(对比例1)、图4c(对比例2)图4d(对比例3)所示。可以看出：采用对比例1-3的修饰方法，酶电极上的二茂铁响应电流在短时间的浸泡中都会迅速衰减，而实施例1的修饰方法中，酶电极上的二茂铁响应电流非常稳定，即使浸泡15天，依然保持着较佳的稳定性能，也进一步说明了采取本发明的三步固定修饰酶电极的方法所产生的协同作用和叠加效应能够有效抑制二茂铁在电极层上的流失，缺少任意一种固定修饰的步骤，都无法保证二茂铁在酶层中的稳定性。