一种具有美白作用的组合物及其制备方法与流程

本发明涉及化妆品领域，尤其涉及一种具有美白作用的组合物及其制备方法。

背景技术：

黑色素是人体最大器官-皮肤的重要保护物质，可保护皮肤免遭紫外线的损伤，但黑色素代谢异常会引起黑色素瘤、色斑等色素沉着症，影响广大爱美人士的身心健康。

黑色素是由黑素细胞产生的一种致密的高分子量棕色色素，浓度越高颜色越深，主要分布在表皮基底层，偶尔也可见于真皮层。酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶，l-酪氨酸在酪氨酸酶的催化下经历多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等中间体才能转化为真黑色素，因此抑制酪氨酸酶活性可显著抑制黑色素的形成。此外，抑制黑素细胞增殖、抑制黑色素转移、清除自由基也是重要的减少黑色素的途径。

中药是创新药物的中药源泉，我国拥有丰富的中药资源，从传统中药中开发具有美白作用的产品相比于过氧化氢、氯化氨基汞等传统美白剂，具有好的安全性、接受性。目前，从中药中发现的具有美白的产品有熊果苷、曲酸及其衍生物、对苯二酚、维生素c及其衍生物等，然而现有中药美白物质均存在一定缺点，例如：曲酸的稳定性较差，对光、热较敏感，而且易与金属离子螯合，容易氧化、变色；对苯二酚可能引发“白斑”现象，并可导致过敏；维生素c稳定性差等。随着人们物质生活水平的的提高，安全、高效的的美白化妆品将会受到越来越多消费者的青睐。

因此，亟需研发一种稳定性好、不易被氧化、不容易过敏的具有美白作用的组合物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有美白作用的组合物及其制备方法，组合物具有美白作用、稳定性好、不易被氧化、不容易过敏。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种具有美白作用的组合物，包括二氢高良姜醇、(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮、高良姜素、1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮、(5r)-5-羟基-1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-庚酮和山柰酚-4′-甲醚。

优选地，所述的具有美白作用的组合物，包括以下重量百分比的组分：高良姜素15-25％、1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮10-20％、(5r)-5-羟基-1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-庚酮10-20％和山柰酚-4′-甲醚15-30％。

优选地，还包括以下组分：氢高良姜醇和(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮。

优选地，包括以下重量百分比的组分：氢高良姜醇15-30％和(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮10-20％。

优选地，所述的具有美白作用的组合物，包括以下重量百分比的组分：二氢高良姜醇15-25％、(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮15-20％、高良姜素15-20％、1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮12-15％、(5r)-5-羟基-1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-庚酮15-20％、山柰酚-4′-甲醚15-25％。

一种具有美白作用的组合物的制备方法，包括以下步骤：

将高良姜粉碎，加80-95％乙醇提取，得到提取液；

浓缩，过滤，用d101大孔树脂吸附；

再依次用水、乙醇洗脱，收集乙醇洗脱后的溶液；

浓缩，减压干燥，经hplc检测，得到具有美白作用的组合物。

优选地，所述提取采用乙醇渗漉提取或乙醇热回流提取中的一种；所述提取的次数为2-5次。

优选地，所述洗脱的过程为：采用质量百分浓度为30-80％的乙醇溶液中两种不同质量百分浓度的乙醇溶液分两次洗脱；所述收集的是收集较高质量百分浓度乙醇洗脱后的溶液。

一种具有美白作用的化妆品，包含具有美白作用的组合物。

一种具有美白作用的化妆品，所述具有美白作用的化妆品的剂型为溶液、啫喱、乳液或膏霜状。

优选地，所述具有美白作用的的组合物占所述所述具有美白作用的化妆品的重量百分比为0.5％-2％。

本发明的有益技术效果是：

(1)本发明的组合物具有抑制黑色素能力强、稳定性好、不易被氧化、不容易过敏的优点，其制备方法简单，制备成本低。

(2)本发明的组合物是在无毒的剂量下使用的，高效安全，而且对细胞形态没有影响。

(3)本发明的组合物来源于天然植物来源，对人体无刺激性，不损伤皮肤。

(4)本发明的组合物含有二氢高良姜醇、高良姜素和山柰酚-4′-甲醚等3个黄酮类成分，该类成分具有明显抗氧化作用，所以本组合物除美白作用外还具有显著抗氧化作用。

附图说明

图1为实施例1的具有美白作用的组合物对黑色素瘤b16f10细胞的细胞毒性；

图2为黑色素瘤b16f10细胞的显微镜照片；

图3为实施例1的具有美白作用的组合物浓度-对黑色素瘤b16f10细胞的黑色素含量；

图4为实施例1的具有美白作用的组合物的指纹图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种具有美白作用的组合物的制备方法，包括以下步骤：

取高良姜5kg粉碎，加8倍重量95％乙醇渗漉提取3次，合并提取液，浓缩，过滤后采用d101大孔树脂吸附，再依次用水、30％乙醇、50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部位，浓缩，减压干燥，经hplc检测，得到二氢高良姜醇、(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮、高良姜素、1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮、(5r)-5-羟基-1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-庚酮、山柰酚-4′-甲醚含量为75％。

实施例2

一种具有美白作用的组合物的制备方法，包括以下步骤：

取高良姜5kg粉碎，加6倍重量80％乙醇热回流提取2次，合并提取液，浓缩，过滤后用d101大孔树脂吸附，再依次用水、30％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部位，浓缩，减压干燥，经hplc检测，得到二氢高良姜醇、(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮、高良姜素、1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮、(5r)-5-羟基-1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-庚酮、山柰酚-4′-甲醚含量为82％。

实施例3

一种具有美白作用的组合物的制备方法，包括以下步骤：

取高良姜5kg粉碎，加10倍重量80％乙醇热回流提取2次，合并提取液，浓缩，过滤后用d101大孔树脂吸附，依次用水、40％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱部位，浓缩，减压干燥，经hplc检测，得到二氢高良姜醇、(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮、高良姜素、1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮、(5r)-5-羟基-1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-庚酮、山柰酚-4′-甲醚含量为84％。

以下是本发明具有美白作用的组合物主要成分结构鉴定：

(1)二氢高良姜醇，结构式如下：

核磁数据：1h-nmr(dmso-d6)δ：7.52(2h,dd,j＝8.0,1.8hz),7.42(3h,m),5.94(1h,d,j＝2.0hz),5.90(1h,d,j＝2.0hz),5.18(1h,d,j＝11.0hz),4.62(1h,d,j＝11.0hz)。13c-nmr(dmso-d6)δ：197.6,166.9,162.5,137.3,128.7,128.2,128.1,100.5,96.2,95.1,82.9,71.5。

(2)(5r)-5-羟基-1,7-二苯-3-庚酮，结构式如下：

核磁数据：1h-nmr(dmso-d6)δ：8.01(2h,m),7.58(3h,m),6.46(1h,d,j＝2.0hz),6.23(1h,d,j＝2.0hz),3.81(3h,s)。13c-nmr(dmso-d6)δ：178.1,164.4,161.3,156.6,155.1,138.7,131.0,130.0,128.7,128.1,104.4,98.7,93.8,60.0。

(3)高良姜素，结构式如下：

核磁数据：1h-nmr(dmso-d6)δ：8.15(2h,d,j＝8.0hz),7.47-7.57(3h,m),6.47(1h,d,j＝2.0hz),6.22(1h,d,j＝2.0hz)。13c-nmr(dmso-d6)δ：176.3,164.2,160.8,156.4,145.7,137.1,131.0,129.9,128.5,127.5,103.2,98.3,93.6。

(4)1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮，结构式如下：

核磁数据：1h-nmr((cd3)2co)δ：7.14-7.28(5h,m),6.90(1h,dt,j＝16.0,6.8hz),6.83(1h,d,j＝2.0hz),6.74(1h,d,j＝8.0hz),6.11(1h,dt,j＝16.0,1.5hz),2.70(2h,t,j＝7.6hz),2.61(2h,m)。13c-nmr((cd3)2co)δ：199.1,148.2,147.1,145.8,142.5,133.3,131.4,129.2,129.1,126.7,115.7,112.8,41.9,35.2,34.7,30.7。

(5)(5r)-5-羟基-1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-庚酮，结构式如下：

核磁数据：1h-nmr((cd3)2co)δ：7.15-7.29(5h,m),6.84(1h,d,j＝1.8hz),6.82(1h,d,j＝8.0hz),6.70(1h,dd,j＝8.0,1.8hz),4.13(1h,m),3.80(3h,s),2.57-2.89(8h,m),1.77(2h,m)。13c-nmr((cd3)2co)δ：210.1,148.0,145.3,142.2,134.5,129.1,129.0,126.6,121.5,115.7,112.8,67.8,56.2,50.6,45.3,32.0。

(6)山柰酚-4′-甲醚，结构式如下：

核磁数据：1h-nmr(dmso-d6)δ：8.14(2h,d,j＝9.0hz),7.11(2h,d,j＝9.0hz),6.46(2h,d,j＝2.0hz),6.20(2h,d,j＝2.0hz),3.84(3h,s)。13c-nmr(dmso-d6)δ：176.0,164.0,160.7,160.5,156.2,146.2,136.0,129.3,123.3,114.0,103.1,98.2,93.5,55.3。

以下通过实验验证本发明的组合物具有美白作用：

实施例1具有美白作用的组合物的药理实验

1.细胞毒性实验

取4×10³个/ml处于对数生长期黑色素瘤细胞b16f10接种于96孔培养板中，每孔加100μl。在37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养24h后加入组合物。空白对照组换入新鲜培养液，实验组换入不同浓度的组合物培养液，每组设8个平行孔。再将细胞置于培养箱中继续培养。培养24h后，弃去培养液，以pbs洗涤一次，每孔加30μlmtt(5mg/ml)，然后放入培养箱作用4h，再弃去mtt，每孔加入100μldmso(二甲基亚砜)，轻拍板缘使其反应产物充分溶解。用酶标仪在570nm波长处测量各孔的吸光度(oplicaldensity,od)值，再代入以下公式计算组合物对b16f10细胞的活力影响。

细胞活力(％)＝实验组平均a值/对照组平均a值×100％

2.形态学研究

取4×10³个/ml处于对数生长期黑色素瘤细胞b16f10接种于96孔培养板中，每孔加100μl。在37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养24h后加药。每孔加组合物无毒剂量作用于细胞，培养24h后，与镜下观察b16f10细胞形态，拍照。

3.黑色素含量测定

取4×10⁴个/ml处于对数生长期黑色素瘤细胞b16f10接种于96孔培养板中。在37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养24h后加药。每孔加不同浓度提取物，每一浓度设4个复孔作用于细胞24h，弃去上清，用pbs洗两遍，加入300μl含10％dmso的1mnaoh，在80℃溶解0.5h，于450nm处测量吸光度(a)，测定细胞内黑色素总量。黑色素含量(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100％

4.组合物对酪氨酸酶活性抑制的影响

取1ml的中药萃取提取液，加入0.9mlph6.8的磷酸缓冲液及1ml0.03％的酪氨酸溶液于试管中混合，并置于37℃的恒温槽中10min，再加入0.1ml的酪氨酸酶(350units/ml)水溶液，将溶液混合均匀，置于恒温槽中反应25min后，以紫外分光光度计测定475nm时的吸光度(b)。空白组步骤与处理组相同，但以等体积的磷酸缓冲液取代酪氨酸酶溶液(b0)。对照组步骤与处理组相同，但以等体积提取液所使用的溶剂取代萃取液(a)。总空白组步骤与处理组相同，但以等体积提取液所使用的溶剂取代萃取液，以等体积的磷酸缓冲液取代酪氨酸酶溶液(a0)。

抑制率(％)＝[(a-a0)-(b-b0)]/(a-a0)

a：处理组样品在475nm处的吸光度；

a0：空白组样品在475nm处的吸光度；

b：对照组样品在475nm处的吸光度；

b0：总空白组样品在475nm处的吸光度。

实验结果

1.组合物对于b16f10细胞增殖的影响

首先采用mtt法观察了组合物在黑色素瘤细胞b16f10中的细胞毒性。如图1所示，组合物对黑色素瘤细胞b16f10呈剂量依赖性抑制黑色素瘤细胞增殖。在浓度为0.156mg/ml以下剂量作用b16f10细胞24h后，对细胞没有明显的细胞毒性(存活率>90％)。考虑到安全无毒的基础上，选择无毒剂量进行后续实验。

2.黑色素瘤b16f10细胞形态观察

选择组合物不同浓度的非毒剂量，观察组合物对黑色素瘤细胞形态的影响，体外培养的b16f10细胞呈梭形贴壁生长，有树突、紧密连接形成单层细胞。如图2所示，给予组合物非毒剂量的黑色素瘤细胞型态与空白组相比，没有明显差别，表明组合物在非毒剂量下对黑色素瘤细胞的形态并没有明显影响。

3.组合物对b16f10细胞内黑色素含量的影响

为了验证组合物的美白效果，选择组合物的非毒剂量观察其对于黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响。如图3所示，组合物作用下的b16f10细胞黑色素含量均小于空白对照组，在非毒剂量高浓度(0.156mg/ml)下，与空白组相比，可降低黑色素含量分别至56％，在0.039mg/ml时对黑色素的抑制趋于稳定。总之，以上结果得出组合物具有较好的抑制黑色素能力。