本发明涉及一种金花茶中黄酮类物质，特别是一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺。
背景技术：
金花茶(camelliachrysantha(hu)tuyama)属于山茶科、山茶属植物。因其具有极其少见的黄色色泽基因kna，又被誉为“植物界的大熊猫”。金花茶中含有较多的牡荆素(vitesin)、槲皮素、山奈酚等黄酮类物质，其中以槲皮素和山萘酚为主。相关研究表明，金花茶叶提取物具有明显降血糖，以及较强的清除羟基自由基(·oh)、超氧离子(o2)能力，且效果与剂量呈正比关系。但目前金花茶的提取基本处于研究的初级阶段，且现有技术中金花茶中的黄酮类物质提取率低，提取物的清除能力差，不利于金花茶的开发利用。
综上所述，现有技术存在金花茶中的黄酮类物质提取率低，提取物的清除能力差，不利于金花茶的开发利用的技术问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺。本发明具有金花茶中的黄酮类物质提取率高，在最优工艺条件，金花茶黄酮类物质的提取率达5.41％，金花茶黄酮类物质对dpph自由基和abts自由基的清除能力增大，分别到达了74％和84％，提取物的清除能力强，有较好的抗氧化能力，使得金花茶得到广泛的开发利用，有良好的经济效益和社会效益。
本发明的技术方案：一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺，按照下述步骤进行制备：
a、将金花茶干燥后，粉碎，低温密封保存，得a品；
b、将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为50-90％，a品与乙醇的物料比为1:10-50g·ml-1,提取温度为40-90℃，提取时间为10-30min，得金花茶黄酮提取液。
前述的超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺中，所述步骤a中，是将金花茶在100-110℃干燥箱中干燥20-40min后，于超高速粉碎机中粉碎至50-70目，在3-5℃下低温密封保存；通过低温密封保存防止金花茶茶叶中黄酮类物质氧化，并防止水气进入导致霉变。
前述的超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺中，所述步骤a中，是将金花茶在105℃干燥箱中干燥30min后，于超高速粉碎机中粉碎至60目，在4℃下低温密封保存。
前述的超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺中，所述步骤b中，将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为53-80％，a品与乙醇的物料比为1:12-40g·ml-1,提取温度为50-87℃，提取时间为22-28min。
前述的超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺中，所述步骤b中，将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为55-70％，a品与乙醇的物料比为1:15-30g·ml-1,提取温度为60-85℃，提取时间为23-27min。
前述的超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺中，所述步骤b中，将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为60％，a品与乙醇的物料比为1:20g·ml-1,提取温度为80℃，提取时间为25min。
与现有技术相比，本发明通过具有以下有益效果：
1、目前提取金花茶中黄酮类物质方面的技术还未成熟，本发明利用有机溶剂浸提方法，进行乙醇体积分数、提取时间、提取温度、物料比等单因素试验和正交试验优化设计，旨在于探究金花茶中黄酮类物质最佳提取工艺及体外抗氧化活性，以期为金花茶开发利用提供一定参考。
2、本发明的正交实验结果说明，不同的因素对金花茶黄酮提取率的影响是：乙醇体积分数>提取温度>物料比>提取时间，即超声波辅助提取法提取金花茶黄酮类物质的最优工艺条件为：乙醇体积分数为60％，提取温度为80℃，物料比为1:20g·ml-1，提取时间为25min，在此条件下，金花茶黄酮类物质的提取率达5.41％。
3、本发明的金花茶黄酮提取物清除abts自由基能力低于vc，但其清除率随黄酮浓度的增加而增大，且强于李多等]通过超声波提取的藜麦糠黄酮提取物，可见其仍表现出较强的清除能力。此外，体外抗氧化实验表明：随着金花茶总黄酮浓度的升高，其对dpph自由基和abts自由基的清除能力增大，分别到达了74％和84％。
4、随着人们生活水平的日益提高和保健意识的不断增强，以金花茶为原料，从金花茶中提取黄酮，既可以满足于当代医学上、食品添加剂及化妆品对黄酮的需要，又使得金花茶得到广泛的开发利用，因此探究茶叶的工艺研究具有良好的经济效益和社会效益。且目前金花茶的提取基本处于研究的初级阶段；因此需要对金花茶黄酮类物质的提取进入深入的研究，努力提高产量和效率，实现研究从实验室走向生产实际，使金花茶在发展国民经济、促进人类健康中发挥积极的作用。
发明人进行了如下实验：
1实验目的
利用有机溶剂浸提方法，进行乙醇体积分数、提取时间、提取温度、物料比等单因素试验和正交试验优化设计，旨在于探究金花茶中黄酮类物质最佳提取工艺及体外抗氧化活性，以期为金花茶开发利用提供一定参考。
2材料与方法
2.1试验材料
2.1.1原料
金花茶茶叶：采于贵州都匀市罗甸县
2.1.2试剂
无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠等均为分析纯；芦丁标准品，纯度≥98％；dpph，sigma；abts，sigma。
2.1.3仪器
(1)紫外分光光度计：uv5200，上海仪电分析仪器公司；
(2)超声波洗涤机：sg2200hpt，上海冠特超声仪器公司；
(4)其他仪器：电子分析天平、茶叶粉碎机、容量瓶(100ml、50ml10ml)、锥形瓶(200ml)、移液枪等。
2.2试验方法
2.2.1样品制备
将所购金花茶在105℃干燥箱中干燥30min，于超高速粉碎机中粉碎至60目，于4℃低温密封环境中保存备用。
2.2.2样品检测
(1)标准曲线的绘制：以浓度x和y进行回归分析，得回归方程y＝5.3771x+0.0280。
(2)黄酮类物质的提取：称取金花茶粉末2.000g(m)置于200ml的带盖玻璃瓶中，按照表2.1，对金花茶进行超声提取，将金花茶黄酮提取液抽滤到100ml(v1)容量瓶中，70％c2h5oh定容至刻度线，摇匀备用。
取1ml(v2)金花茶黄酮提取液于10ml(v3)容量瓶中，加入所需试剂，测定吸光度a510nm，同一测定设计3个平行试验，取平均值，求出黄酮得率，公式如下：
t提取率(％)＝(x×v1×v3)/(v2×m×10)
2.2.3单因素试验
表2.1单因素试验方案
取金花茶粉末2.000g，分别研究提取时间(10、15、20、25、30min)，提取温度(40、50、60、70、80℃)，乙醇体积分数(50％、60％、70％、80％、90％)，物料比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)g·ml-1对金花茶黄酮类物质提取的影响，详见表2.1。
2.2.4正交试验
参照表2.2因素水平，采用l9(34)正交表设计，考察金花茶黄酮类物质提取率，得出最佳提取工艺条件，同一测定设计3个平行试验，取平均值。
表2.2正交试验因素水平设计表
2.2.5金花茶黄酮类物质体外抗氧化研究
(1)dpph清除能力测定：取2×10-4mol/l的dpph溶液，分别加入不同浓度的金花茶黄酮提取液，摇匀，于无光环境中放置30min。测定吸光值a1(517nm)，及黄酮提取液与水的吸光值a2，再测定dpph溶液的吸光值a0。计算方式如下：
dpph自由基清除率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]×100
(2)abts清除能力测定：吸取不同浓度的黄酮提取液，加入abts工作液摇匀，于734nm处测定吸光值a1，以abts工作液与水作空白吸光值a0，金花茶黄酮提取液与水混合均匀吸光度为a2。按以下公式计算：
abts自由基清除率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]×100
2.3数据分析
采用sas9.2软件对数据进行统计分析，所有数据均以x±std表示，p>0.05表示差异不显著，0.01<p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极其显著；origin9.0软件作图。
3结果与分析
3.1简单试验方差分析
3.1.1提取时间对金花茶中黄酮提取率的影响
表3.1显著性分析表
根据表3.1知，不同提取时间对金花茶茶叶中黄酮类物质提取率差异的f统计量为241.1，p值为<0.0001，大于在0.01水平上的f值，可知不同提取时间对金花茶中黄酮提取率的影响有极其显著的差异。
由图1不同提取时间对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较可知，在0.01的水平上，处理3与处理1、2、4、5有极其显著差异，不同提取时间对金花茶中黄酮提取率的影响为处理3>处理2>处理4>处理1>处理5；对于金花茶的黄酮提取率来说，处理3最多，其次是处理2，且两者有极其显著差异性；综合考虑处理3对金花茶中黄酮提取率的影响最优，即：提取温度60℃、物料比1:30g·ml-1、提取时间20min、乙醇体积为70％，其黄酮类物质提取率达到4.463％。
3.1.2提取温度对金花茶中黄酮提取率的影响
表3.2显著性分析表
根据表3.2知，不同提取温度对金花茶中黄酮提取率差异的f统计量为262.57，p值为<0.0001，大于在0.01水平上的f值，可知不同提取温度对金花茶中黄酮提取率的影响有极其显著的差异。
由图2不同提取温度对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较可知，在0.01的水平上，处理3与处理1、2、4、5有极其显著差异，不同提取温度对金花茶中黄酮提取率的影响为处理3>处理2>处理4>处理1>处理5；对于金花茶的黄酮提取率来说，处理3最多，其次是处理2，且两者有极其显著差异性；综合考虑处理3对金花茶中黄酮提取率的影响最优，即：物料比1:30g·ml-1、提取温度60℃、提取时间60min、乙醇体积为70％，其黄酮提取率达到5.849％。
3.1.3乙醇体积对金花茶中黄酮提取率的影响
表3.3显著性分析表
根据表3.3知，不同乙醇体积对金花茶中黄酮提取率差异的f统计量为705.23，p值为<0.0001，大于在0.01水平上的f值，可知不同乙醇体积对金花茶中黄酮提取率的影响有极其显著的差异。
由图3不同乙醇体积对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较可知，在0.01的水平上，处理5与处理1、2、3、4有极其显著差异，不同乙醇体积对金花茶中黄酮提取率的影响为处理3>处理2>处理4>处理1>处理5；对于金花茶的黄酮提取率来说，处理3最多，其次是处理2，且两者有极其显著差异性；综合考虑处理3对金花茶中黄酮提取率的影响最优，即：乙醇体积70％、物料比1:30g·ml-1、提取温度60℃、提取时间20min，其黄酮提取率达到4.587％。
3.1.4物料比对金花茶中黄酮提取率的影响
表3.4显著性分析表
根据表3.4知，不同物料比对金花茶中黄酮提取率差异的f统计量为872.6，p值为<0.0001，大于在0.01水平上的f值，可知不同物料比对金花茶中黄酮提取率的影响有极其显著的差异。
由图4不同物料比对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较可知，在0.01的水平上，处理1与处理2、3、4、5有极其显著差异，不同物料比对金花茶中黄酮提取率的影响为处理3>处理4>处理2>处理5>处理1；对于金花茶的黄酮提取率来说，处理3最多，其次是处理4，且两者有极其显著差异性；综合考虑处理3对金花茶中黄酮提取率的影响最优，即：物料比1:30g·ml-1、提取温度60℃、提取时间为60min、乙醇体积为70％，其黄酮提取率达到5.058％。
3.2正交试验方差分析
表3.5正交试验结果
在上述实验的基础上，以总黄酮提取率为考察指标，进行l9(34)正交试验，因素水平如表2.2所示，正交试验结果与数据分析见表3.5。
正交实验结果说明，不同的因素对金花茶黄酮提取率的影响是：乙醇体积分数>提取温度>物料比>提取时间，最佳工艺条件为a2b3c1d3，即乙醇体积分数为60％，提取温度为80℃，物料比为1:20g·ml-1，提取时间为25min。
3.3金花茶黄酮体外抗氧化研究
3.3.1dpph自由基清除能力
由图5dpph自由基清除率可知，金花茶中黄酮类物质对dpph自由基清除率明显低于vc，这可能是该提取物为混合物，纯度低、杂质较多，抑制了其活性；但其清除率随着浓度的增加而不断增大，可达到74％，说明金花茶中黄酮类物质具有较好的抗氧化活性。
3.3.2abts自由基清除能力
由图6abts自由基清除率可知，金花茶黄酮提取物清除abts自由基能力低于vc，但其清除率随黄酮浓度的增加而增大，可达到84％，且强于李多等通过超声波提取的藜麦糠黄酮提取物，可见其仍表现出较强的清除能力。
4.1讨论
单因素试验结果表明，在提取温度60℃、物料比1:30g·ml-1、乙醇体积分数70％的条件下，金花茶黄酮最佳提取时间为20min，提取率达到4.463％；在提取时间20min、物料比1:30g·ml-1、乙醇体积分数70％的条件下，金花茶黄酮最佳提取温度为60℃，提取率达到5.849％；在提取时间20min、提取温度60℃、物料比1:30g·ml-1的条件下，金花茶黄酮最佳乙醇体积分数为70％，提取率达到4.587％；在提取时间20min、提取温度60℃、乙醇体积分数70％的条件下，金花茶黄酮最佳物料比为1:30g·ml-1，提取率达到5.058％。
正交试验结果表明，对金花茶黄酮提取率的影响因素顺序为：乙醇体积分数>提取温度>物料比>提取时间。
4.2结论
采用超声波辅助提取法提取金花茶中的黄糖类物质具有良好的效果，超声波辅助提取法提取金花茶黄酮类物质的最优工艺条件为：乙醇体积分数为60％，提取温度为80℃，物料比为1:20g·ml-1，提取时间为25min，在此条件下，金花茶黄酮类物质的提取率达5.41％。且金花茶黄酮对dpph自由基、abts自由基的清除能力均随着浓度的升高而变强，说明其具有较好的抗氧化能力。
综上所述，本发明具有金花茶中的黄酮类物质提取率高，在最优工艺条件，金花茶黄酮类物质的提取率达5.41％，金花茶黄酮类物质对dpph自由基和abts自由基的清除能力增大，分别到达了74％和84％，提取物的清除能力强，有较好的抗氧化能力，使得金花茶得到广泛的开发利用，有良好的经济效益和社会效益的有益效果。
附图说明
图1是本发明的不同提取时间对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较；
图2是本发明的不同提取温度对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较；
图3是本发明的不同乙醇体积对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较；
图4是本发明的不同物料比对金花茶中黄酮提取率影响的多重比较；
图5是本发明金花茶中黄酮类物质的dpph自由基清除率；
图6是本发明金花茶中黄酮类物质的abts自由基清除率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1。一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺，按照下述步骤进行制备：
a、将金花茶在100℃干燥箱中干燥20min后，于超高速粉碎机中粉碎至50目，在3℃下低温密封保存，得a品；
b、将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为50％，a品与乙醇的物料比为1:10g·ml-1,提取温度为40℃，提取时间为10min，得金花茶黄酮提取液。
实施例2。一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺，按照下述步骤进行制备：
a、将金花茶在105℃干燥箱中干燥30min后，于超高速粉碎机中粉碎至60目，在4℃下低温密封保存，得a品；
b、将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为60％，a品与乙醇的物料比为1:20g·ml-1,提取温度为50℃，提取时间为23min，得金花茶黄酮提取液。
实施例3。一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺，按照下述步骤进行制备：
a、将金花茶在110℃干燥箱中干燥20min后，于超高速粉碎机中粉碎至70目，在3℃下低温密封保存，得a品；
b、将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为70％，a品与乙醇的物料比为1:30g·ml-1,提取温度为60℃，提取时间为25min，得金花茶黄酮提取液。
实施例4。一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺，按照下述步骤进行制备：
a、将金花茶在100℃干燥箱中干燥40min后，于超高速粉碎机中粉碎至50目，在5℃下低温密封保存，得a品；
b、将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为80％，a品与乙醇的物料比为1:40g·ml-1,提取温度为70℃，提取时间为28min，得金花茶黄酮提取液。
实施例5。一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺，按照下述步骤进行制备：
a、将金花茶在105℃干燥箱中干燥30min后，于超高速粉碎机中粉碎至60目，在4℃下低温密封保存，得a品；
b、将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为60％，a品与乙醇的物料比为1:20g·ml-1,提取温度为80℃，提取时间为25min，得金花茶黄酮提取液。
实施例6。一种超声波辅助提取金花茶中黄酮类物质的工艺，按照下述步骤进行制备：
a、将金花茶在110℃干燥箱中干燥40min后，于超高速粉碎机中粉碎至70目，在5℃下低温密封保存，得a品；
b、将a品采用乙醇进行超声提取，乙醇体积分数为90％，a品与乙醇的物料比为1:50g·ml-1,提取温度为90℃，提取时间为30min，得金花茶黄酮提取液。