一种黄精总黄酮提取物及其提取方法和应用

1.本发明涉及黄精成分提取技术领域，尤其涉及一种黄精总黄酮提取物及其提取方法和应用。


背景技术：

2.现代药理学研究表明黄精中由于黄酮、黄精多糖和皂苷等多种营养成分的存在，使黄精具备调节血脂血糖、增强免疫、抗氧化、抗衰老等多种药理活性，其中，黄酮具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种积极作用，具有非常广泛的应用前景，所以提供一种有效的黄精总黄酮的提取方法是非常有必要的。
3.目前现有技术中，黄精总黄酮的提取方法主要有浸提法、超声波辅助提取、微波辅助提取等，然而由于生黄精中总黄酮含量低，且上述方法需要进行高压或高温处理会造成黄精有效成分的损失，导致上述方法提取获得黄精总黄酮含量低，不利于黄精总黄酮的进一步应用和研究。
4.为此，本发明提供一种黄精总黄酮提取物及其提取方法和应用。


技术实现要素：

5.为了解决上述现有技术中的不足，本发明提供一种黄精总黄酮提取物及其提取方法和应用。
6.本发明的一种黄精总黄酮提取物及其提取方法和应用是通过以下技术方案实现的:
7.本发明的第一个目的是提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，包括以下步骤:
8.本发明的第一个目的是提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，包括以下步骤:
9.步骤1，将生黄精清洗后浸于酒水混合物a中至完全泡发，过滤，获得泡发后的生黄精；用酒水混合物b将泡发后的生黄精蒸制7～9h，然后闷润8～12h，再次蒸制7～9h，获得酒黄精；
10.步骤2，将酒黄精干燥后进行粉碎处理，获得酒黄精粉末；
11.步骤3，将酒黄精粉末均匀分散于醇溶液中，并采用缓冲溶液调节ph为4.7～4.9后，加入纤维素酶，冰浴38～42℃下进行活化处理后于48～52℃下进行超声提取，随后灭活、过滤，滤液中即含有酒黄精总黄酮。
12.进一步地，所述酒水混合物a和所述酒水混合物b均为酒与水的混合物，且酒与水的质量比为1:9～11。
13.进一步地，所述酒水混合物a和酒水混合物b中，酒为黄酒，且黄酒的酒精度为11％。
14.进一步地，所述生黄精与所述酒水混合物a的料液比为1g:1～3ml。
15.进一步地，采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为缓冲溶液，且所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.08～0.12mol/l。
16.进一步地，所述酒黄精粉末与所述醇溶液的料液比为1g:5～30ml。
17.进一步地，所述纤维素酶的用量为酒黄精的1.5％～3.5％。
18.进一步地，所述活化处理的时间为20～40min。
19.进一步地，所述灭活处理的时间为5～20min。
20.进一步地，所述超声提取的超声功率为450～500w，超声频率为30～50khz，超声时间为5～45min。
21.本发明的第二个目的是提供一种上述提取方法获得的黄精总黄酮提取物。
22.本发明的第三个目的是提供一种上述黄精总黄酮提取物在用于制备顺铂诱导的急性肾损伤药物中的应用。
23.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
24.中医认为，黄酒气味苦、甘、辛、大热，主行药势，有百邪恶毒、通经络、行血脉、脾胃、养皮肤、散湿气、扶肝、除风下气、活血、利小便等功效。本发明以酒作为有机溶媒，通过用酒水混合物对生黄精进行处理，并且在处理过程中，采用常压蒸制获得酒黄精，不仅有助于黄精中黄酮类、脂类、挥发油、生物碱及其盐类等黄酮类的溶出，同时还能够减轻黄精的刺激性，增强黄精补脾润肺的效果，以实现减毒增效，从而使得黄精经酒制后黄酮含量较生品和饮片，总黄酮含量提高；同时本发明在酒制黄精的过程中，采用常压蒸制的方式，能够避免负压液浓度和负压时间可能会对酒黄精饮片外观性状的影响，也避免了高压蒸制对设备的高要求极可能对有效物质的损失，以提高黄精中总黄酮的提取效果。然后，再将酒黄精粉碎后置于醇溶液中，通过超声协同醇溶液对酒黄精中的总黄酮进行提取，能够显著提高黄精中总黄酮的提取率，并且，本发明在超声协同醇溶液对酒黄精中的总黄酮进行提取的过程中，还加入了纤维素酶，可以增加植物细胞破壁率，提高黄酮得率，进而使得总黄酮得率可达1.19mg
·
g-1
。
25.本发明的提取方法简单易操作，且提取效果稳定，可重复性高，提取方法可靠，有利于用于研究黄精总黄酮的药理活性。
26.本发明提取方法提取获得的黄精总黄酮可清除dpph，羟自由基和abts，具备显著的抗氧化能力，尤其是其对羟自由基的ic50几乎是维生素c的5倍、bht(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的11倍，故本发明提取方法提取获得的黄精总黄酮是一种潜在的天然自由基强清除剂，且其体外可剂量依赖性抗a549细胞增殖，能够缓解顺铂致小鼠急性肾损伤，为协同顺铂增效减毒治疗非小细胞肺癌提供新的思路。
附图说明
27.图1为实施例1-实施例5的总黄酮提取率；
28.图2为实施例1、以及实施例6-实施例13的总黄酮提取率；
29.图3为实施例1、以及实施例14-实施例17的总黄酮提取率；
30.图4为实施例1、以及实施例19-实施例26的总黄酮提取率；
31.图5为本发明提取的酒黄精总黄酮清除dpph自由基的能力；
32.图6为本发明提取的酒黄精总黄酮清除羟自由基的能力；
33.图7为本发明提取的酒黄精总黄酮清除abts自由基的能力；
34.图8为不同剂量的本发明提取的酒黄精总黄酮对a549细胞增殖活力的影响；
35.图9为小鼠尿液照片；
36.图10为小鼠肾脏照片；
37.图11为本发明提取的酒黄精总黄酮对顺铂诱导急性肾损伤的影响；
38.图12为各组实验后的小鼠血清中的mda含量，其中，组别1为空白组；组别2为急性肾损伤模型组；组别3为酒黄精黄酮提取物低剂量组；组别4为酒黄精黄酮提取物中剂量组；组别5为酒黄精黄酮提取物高剂量组；##表示p《0.01,与空白组比较；**表示p《0.01，*表示p《0.05，与急性肾损伤模型组比较；
39.图13为各组实验后的小鼠肾组织中的mda含量，其中，组别1为空白组；组别2为急性肾损伤模型组；组别3为酒黄精黄酮提取物低剂量组；组别4为酒黄精黄酮提取物中剂量组；组别5为酒黄精黄酮提取物高剂量组；##表示p《0.01，与空白组比较；**表示p《0.01，*表示p《0.05，与急性肾损伤模型组比较。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
41.实施例1
42.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，包括以下步骤:
43.步骤1，将生黄精清洗后浸于酒水混合物a中至完全泡发，过滤，获得泡发后的生黄精；用酒水混合物b将泡发后的生黄精蒸制8h，然后闷润10h，再次蒸制8h，获得酒黄精；先蒸制，再闷润再蒸制的目的在于增加黄精的补气效果，制得的酒黄精黑里透红，油润软糯，味道甘甜。
44.需要说明的是，本发明不限制酒水混合物a的具体用量，只要能够将生黄精完全泡发即可。可选的，本实施例中，采用的酒水混合物a与生黄精的用量比为2ml:1g。且本实施例中，优选的以酒与水的质量比为1:10的混合物作为酒水混合物a。
45.步骤2，将酒黄精干燥后进行粉碎处理，获得酒黄精粉末；
46.需要说明的是，本发明不限制干燥处理的具体工艺，只要能够去除酒黄精多余的酒水混合物，便于后续进行粉碎处理即可，可选的，本实施例的干燥温度为-80℃冷冻干燥，干燥时间为72h。
47.本发明不限制粉碎处理的具体工艺，只要能够将酒黄精粉碎至能够6号筛，即100目筛即可。
48.步骤3，将酒黄精粉末均匀分散于醇溶液中，并采用缓冲溶液调节ph为4.8后，加入纤维素酶，冰浴40℃下进行活化处理，灭活后过滤，滤液即为含有酒黄精总黄酮的黄精总黄酮提取液；
49.需要说明的是，本发明不限制醇溶液的具体用量，但是考虑到对于酒黄精粉末中总黄酮的提取效果，可选的，本实施例以浓度为45％的乙醇作为醇溶液，且使酒黄精粉末与所述醇溶液的料液比为1g:5ml。
50.本发明不限制缓冲溶液的具体类型，只要能够将溶液体系的ph调节为4.8左右即可，可选的，本发明以浓度为0.1mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为缓冲溶液。
51.本实施例中，纤维素酶的用量为1.5％，且活化时间根据实际活化的温度进行灵活
调整即可，如于40℃下进行活化处理30min。本实施例中，超声提取温度为50℃，超声功率为500w，超声频率为40khz，超声时间为5min；且灭活处理的时间为10min。
52.实施例2
53.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，包括以下步骤：
54.步骤1，将生黄精清洗后浸于酒水混合物a中至完全泡发，过滤，获得泡发后的生黄精；用酒水混合物b将泡发后的生黄精蒸制7h，然后闷润8h，再次蒸制7h，获得酒黄精。
55.本实施例中，采用的酒水混合物a与生黄精的用量比为1ml:1g。且本发明优选的以酒与水的质量比为1:9的混合物作为酒水混合物a。
56.步骤2，将酒黄精干燥后进行粉碎处理至100目筛，获得酒黄精粉末；
57.本实施例的干燥温度为-70℃冷冻干燥，干燥时间为80h。
58.步骤3，将酒黄精粉末均匀分散于醇溶液中，并采用缓冲溶液调节ph为4.7后，加入纤维素酶，冰浴38℃下进行活化处理，灭活后过滤，滤液即为含有酒黄精总黄酮的黄精总黄酮提取液；
59.本实施例中，以浓度为55％的乙醇作为醇溶液，且使酒黄精粉末与所述醇溶液的料液比为1g:15ml。
60.本实施例中，以浓度为0.08mol
·
l-1
的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为缓冲溶液。
61.本实施例中，纤维素酶的用量为2.5％，活化处理时间为40min。
62.本实施例中，超声提取温度为48℃，超声功率为500w，超声频率为30khz，超声时间为20min；且灭活处理的时间为5min。
63.实施例3
64.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，包括以下步骤：
65.步骤1，将生黄精清洗后浸于酒水混合物a中至完全泡发，过滤，获得泡发后的生黄精；用酒水混合物b将泡发后的生黄精蒸制9h，然后闷润12h，再次蒸制9h，获得酒黄精。
66.本实施例中，采用的酒水混合物a与生黄精的用量比为1ml:1g。且本发明优选的以酒与水的质量比为1:11的混合物作为酒水混合物a。
67.步骤2，将酒黄精干燥后进行粉碎处理至100目筛，获得酒黄精粉末；
68.本实施例的干燥温度为-90℃冷冻干燥，干燥时间为48h。
69.步骤3，将酒黄精粉末均匀分散于醇溶液中，并采用缓冲溶液调节ph为4.9后，加入纤维素酶，冰浴42℃下进行活化处理，灭活后过滤，滤液即为含有酒黄精总黄酮的黄精总黄酮提取液；
70.本实施例中，以浓度为85％的乙醇作为醇溶液，且使酒黄精粉末与所述醇溶液的料液比为1g:30ml。
71.本实施例中，以浓度为0.12mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为缓冲溶液。
72.本实施例中，纤维素酶的用量为3.5％，活化处理时间为40min。
73.本实施例中，超声提取温度为52℃，超声功率为500w，超声频率为50khz，超声提取时间为45min；且灭活处理的时间为20min。
74.实施例4
75.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于：
76.本实施例中，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:15ml，醇溶液为浓度为70％的乙
醇，纤维素酶用量为1.5％，超声时间为15min。
77.实施例5
78.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例4的区别仅在于：
79.本实施例中，纤维素酶用量为2％。
80.实施例6
81.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例4的区别仅在于：
82.本实施例中，纤维素酶用量为2.5％。
83.实施例7
84.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例4的区别仅在于：
85.本实施例中，纤维素酶用量为3％。
86.实施例8
87.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例4的区别仅在于：
88.本实施例中，纤维素酶用量为3.5％。
89.实施例9
90.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于：
91.本实施例中，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:15ml，纤维素酶用量为2.5％，超声时间为15min，乙醇的浓度为45％。
92.实施例10
93.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
94.乙醇的浓度为50％。
95.实施例11
96.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
97.本实施例中，乙醇的浓度为55％。
98.实施例12
99.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
100.本实施例中，乙醇的浓度为60％。
101.实施例13
102.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
103.本实施例中，乙醇的浓度为65％。
104.实施例14
105.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
106.本实施例中，乙醇的浓度为70％。
107.实施例15
108.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
109.本实施例中，乙醇的浓度为75％。
110.实施例16
111.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
112.本实施例中，乙醇的浓度为80％。
113.实施例17
114.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例9的区别仅在于：
115.本实施例中，乙醇的浓度为85％。
116.实施例18
117.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于：
118.本实施例中，纤维素酶用量为2.5％，乙醇的浓度为70％，超声时间为15min，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:5ml。
119.实施例19
120.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例18的区别仅在于：
121.本实施例中，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:10ml。
122.实施例20
123.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例18的区别仅在于：
124.本实施例中，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:15ml。
125.实施例21
126.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例18的区别仅在于：
127.本实施例中，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:20ml。
128.实施例22
129.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例18的区别仅在于：
130.本实施例中，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:25ml。
131.实施例23
132.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例18的区别仅在于：
133.本实施例中，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:30ml。
134.实施例24
135.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于：
136.纤维素酶用量为2.5％，乙醇的浓度为55％，酒黄精粉末与醇溶液的料液比为1g:15ml，超声提取时间为5min。
137.实施例25
138.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
139.超声提取时间为10min。
140.实施例26
141.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
142.本实施例中，超声提取时间为15min。
143.实施例27
144.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
145.本实施例中，超声提取时间为20min。
146.实施例28
147.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
148.本实施例中，超声提取时间为25min。
149.实施例29
150.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
151.本实施例中，超声提取时间为30min。
152.实施例30
153.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
154.本实施例中，超声提取时间为35min。
155.实施例31
156.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
157.本实施例中，超声提取时间为40min。
158.实施例32
159.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例24的区别仅在于：
160.本实施例中，超声提取时间为45min。
161.实施例33
162.本实施例提供一种黄精总黄酮提取物的提取方法，其与实施例1的区别仅在于：
163.本实施例中，纤维素酶用量1.5％，乙醇浓度45％，超声时间16min，料液比1g:21ml。
164.试验部分
165.1.不同纤维素用量对总黄酮含量的影响
166.本发明以实施例4-实施例8制备的黄精总黄酮提取液为例，分别对其总黄酮含量进行测试以探究不同纤维素用量对总黄酮含量的影响，其测试结果如图1所示，可以看出，随着纤维素酶含量的增加总黄酮提取率也随之提高，但是当纤维素酶含量增加到一定程度后，总黄酮提取率反而会下降，故本发明优选的纤维素用量为2％～3％。
167.2.不同醇浓度对总黄酮含量的影响
168.本发明以实施例9-实施例17制备的黄精总黄酮提取液为例，分别对其总黄酮含量进行测试以探究不同醇浓度对总黄酮含量的影响，其测试结果如图2所示，可以看出，随着醇浓度的增加总黄酮提取率也随之提高，但是当醇浓度增加到一定程度后，总黄酮提取率反而会下降，故本发明优选的醇浓度范围为50％～60％。
169.3.提取时不同料液比对总黄酮含量的影响
170.本发明以实施例18-实施例22制备的黄精总黄酮提取液为例，分别对其总黄酮含量进行测试以探究提取时不同料液比对总黄酮含量的影响，其测试结果如图3所示，可以看出，随着提取时料液比的增加总黄酮提取率也随之提高，但是当提取时料液比增加到一定程度后，总黄酮提取率反而会下降，故本发明优选的，酒黄精粉末与醇溶液的固液比1g:10～25ml。
171.4.提取时不同超声时间对总黄酮含量的影响
172.本发明以实施例24-32制备的黄精总黄酮提取液为例，分别对其总黄酮含量进行测试以探究提取时不同超声时间对总黄酮含量的影响，其测试结果如图3所示，可以看出，随着提取时超声时间的增加总黄酮提取率也随之提高，但是当提取超声时间增加到一定程度后，总黄酮提取率反而会下降，故本发明优选的，提取超声时间为5～25min。
173.5.体外抗氧化能力
174.本发明以实施例33的方法提取获得的总黄酮提取物为例，将其冷冻干燥后(-80℃下冷冻干燥48h)，配置成不同浓度的溶液(0，12.5，25，50，100μg/ml)，并对其分别进行以下
测试，以测定其抗氧化能力。
175.abts工作液的配制：将7mmol/labts溶液和140mmol/l过硫酸钾水溶液按50:1混合，避光反应16h，用乙醇稀释到a732nm约0.7备用。
176.各实验设置样品组(as，加入样品的dpph无水乙醇溶液)，样品对照组(a
bs
，加入乙醇(蒸馏水)的提取液)，空白对照组(a
bc
，等体积无水乙醇(蒸馏水)代替样品的dpph(羟自由基工作液，abst)溶液)，阳性对照组(维生素c(vc)或2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht))。每组实验平行重复3次。
177.5.1dpph自由基清除能力的测定
178.吸取上述配制好的不同浓度酒黄精总黄酮溶液各100μl，加0.1mmol/l dpph无水乙醇溶液100μl，混匀，室温避光30min，517nm测定a值。dpph自由基清除率＝[1-(a
s-a
bs
)/a
bc
]
×
100％，其测试结果如图5所示。
[0179]
5.2羟基自由基清除能力的测定
[0180]
吸取上述配制好的不同浓度酒黄精总黄酮溶液50μl，依次加入50μl6mmol/lfeso4、100μl6mmol/lh2o2，充分摇匀后室温放置10min；再加入50μl6mmol/l水杨酸，充分摇匀室温放置30min，510nm测定a值。羟自由基清除率＝(a
bs-as)/a
bs
×
100％，其测试结果如图6所示。
[0181]
5.3abts总抗氧化能力的测定
[0182]
吸取上述配制好的不同浓度酒黄精总黄酮溶液50μl，加入100μlabts，避光10min，734nm测定a值。总抗氧化化能力＝[1-(a
s-a
bs
)/a
bc
]
×
100％，其测试结果如图7所示。
[0183]
由图5-图7可以看出，本发明提取获得的酒黄精总黄酮提取物具有较强的抗氧化能力，可以剂量依赖性清除dpph、羟自由基、abst自由基，其ic50分别是(19.43
±
0.96)μg/ml，(4.46
±
0.14)μg/ml和(31.57
±
0.14)μg/ml，尤其是对羟自由基具有较维生素c(ic50＝22.23
±
0.99μg/ml)和bht(ic50＝54.83
±
0.95μg/ml更强的清除能力。其对dpph，abts的清除能力在低浓度时较维生素c低，但当浓度达到100μg/ml时，作用与维生素c相当，比bht强。
[0184]
6.体外抗a549增殖能力
[0185]
本发明以实施例33的方法提取获得的总黄酮提取物为例，将其冷冻干燥后(-80℃下冷冻干燥48h)，配置成不同浓度的溶液(0，0.06
×
103，0.12
×
103，0.24
×
103，0.48
×
103，0.96
×
103，1.92
×
103μg/ml)，获得不同浓度的酒黄精黄酮提取物，并分别以上述不同浓度的酒黄精黄酮提取物于37℃，5％co2下，处理a549细胞24h(48，72h)，每孔加入10μlcck-8溶液，孵育3.5h，600nm测定吸光值(od)，细胞生存率％＝[(ods-odb)/(od
c-odb)]
×
100％。每组重复测定5次，测试结果如图8所示。
[0186]
从图8可以看出，酒黄精黄酮提取物作用a549细胞后，细胞出现不同程度的皱缩，坏死。其可以剂量依赖性抑制a549细胞，其ic50依次是18.97
±
3.48(24h)，2.77
±
0.99(48h)，2.01
±
0.43(72h)μg/ml。
[0187]
7.对顺铂诱导的小鼠急性肾损伤保护作用
[0188]
7.1顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型制备
[0189]
依文献(潘笑悦.不同剂量顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型观察及生物学指标检测[d].新乡医学院，2015)中的方法，模型组和酒黄精给药组单日腹腔注射顺铂(20mg/kg)，造成小鼠急性肾损伤模型。
[0190]
7.2分组及给药
[0191]
将24只雄性昆明小鼠随机分为空白组、模型组、酒黄精组(低，中，高)，每组8只。空白组、模型组连续生理盐水灌胃7d，酒黄精组(参照2020年版《中国药典》方法换算小鼠等效剂量3.08mg/kg，设置低、中、高剂量为3.08，9.25，27.74mg/kg)连续提取物灌胃7d。除空白组外，每组小鼠按0.02ml/g腹腔注射顺铂。空白组腹腔注射等量0.9％氯化钠注射液。
[0192]
7.3小鼠尿液及肾脏对比
[0193]
如图9所示，观察各组小鼠尿液变化发现:空白组尿液呈淡黄色，清澈透明，既不浑浊也无沉淀物。与空白组相比，模型组颜色最黄，且有些许浑浊，说明肾脏受到损伤最严重。酒黄精提取物给药组尿液颜色与空白组相差不大。
[0194]
7.4各组肾脏形态差异
[0195]
如图10所示，取各组实验后的小鼠肾脏，经过4％多聚甲醛固定，脱水透明后石蜡包埋，取肾脏切片进行he染色，在显微镜下观察肾小管及周围细胞变化。
[0196]
如图11所示，通过急性肾损伤模型组与酒黄精提取物组肾脏组织he染色，观察到急性肾损伤组织肾小管上皮细胞颗粒或空泡样变形，官腔扩张，刷状缘脱落，可看到基底膜断裂，官腔内可见透明、颗粒或细胞管型，有上皮细胞凋亡现象。而酒黄精提取物组肾小管空泡样变形，上皮细胞颗粒均较模型组缓解，肾小管上皮脱落减轻，管腔内脱落的细胞核固缩上皮细胞明显减少。
[0197]
本实验从小鼠肾脏图片与空白组对比来看，模型组肾脏受到顺铂影响最大，颜色最浅；空白组给予的生理盐水对小鼠肾脏没有损伤，颜色最深，说明造模成功。酒黄精提取物给药组从肾脏图片分析，高剂量颜色与空白组最接近。并且从图片可以观察到与空白组相比，模型组小鼠肾脏最肿大，低、中、高酒黄精提取物给药组肾脏依次与空白组比较接近，说明顺铂对于肾脏有保护影响。
[0198]
7.5血清和肾组织丙二醛(mda)检测
[0199]
对各组实验后的小鼠进行眼球取血，均以3000r/min的转速离心20min获得血清。将肾组织和生理盐水按1:9比例制备10％的肾组织匀浆，匀浆于离心机12000r离心10min，取上层清液，bca蛋白浓度试剂盒测定肾脏组织蛋白浓度。依次对血清、肾组织按试剂盒说明书步骤，532nm处通过比色法在酶标仪上检测并计算得出mda含量，且其测试结果分别如图12和图13所示，其中，图12为各组实验后的小鼠血清中的mda含量，图13为各组实验后的小鼠肾组织中的mda含量。
[0200]
由图12和图13可以看出，与空白组对比，模型组小鼠氧化应激与抗氧化失衡，表现为血清mda增加1.03倍，肾组织mda增加6.71倍。与模型组比较，酒黄精组血清mda下降41.3％(低剂量组)、39.9％(中剂量组)、29.9％(高剂量组)，各给药组均有显著差异(p《0.01)。与模型组比较，酒黄精肾组织mda下降35.7％(低剂量组)、43.3％(中剂量组)、19.2％(高剂量组)，中、低剂量组有显著差异(p《0.05)，也就是说，表明不同剂量酒黄精总黄酮提取物能减轻顺铂诱导小鼠急性肾损伤氧化应激水平。
[0201]
需要说明的是，上述总黄酮含量的测定均采用以下方法进行:
[0202]
本发明采用nano
2-al(no3)
3-naoh比色法测定总黄酮含量，分别吸取1.0ml上述各个实施例获得的黄精总黄酮提取液，并分别测定各个实施例的黄精总黄酮提取液的吸光度，代入总黄酮的标准曲线测得浓度后，计算总黄酮提取率。
[0203]
总黄酮提取率％＝(总黄酮浓度
×
药液体积)/药材质量
×
100％。
[0204]
其中，总黄酮的标准曲线的制备如下:用色谱甲醇溶解芦丁标准品制成0.2mg/ml的对照品储备液。精密吸取芦丁对照品储备液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，置25ml容量瓶，以芦丁浓度为横坐标，吸光度a为纵坐标，绘得标准曲线y＝10.239x+0.0272(r2＝0.9976)，线性范围0.0080～0.0480mg/ml。
[0205]
本发明通过测定获得的酒黄精总黄酮的抗氧化能力，通过与水溶性抗氧化剂维生素c和人工合成脂溶性抗氧化剂bht相比，具有更强的清除羟基自由基能力。且与维生素c清除dpph自由基，abts的能力相当，比bht清除二者的能力更强。本发明提供的酒黄精总黄酮是一种强天然抗氧化剂。
[0206]
目前顺铂仍是治疗非小细胞肺癌的一线首选药物。但不可避免的是顺铂引起的急性肾损伤，限制了患者的受益。目前顺铂防治顺损伤的方法主要有水化、利尿、补充电解质，分词给药、控制给药时间，给予血管紧张素转化酶抑制剂(该类药有升高血钾、致畸作用，故双侧肾动脉狭窄患者及孕妇禁用)，补充微量元素，合用谷胱甘肽等抗氧化剂(谷胱甘肽注射部位有时会出现轻度的疼痛。用于滴眼时局部有刺激感、瘙痒、结膜充血、视物模糊等副作用)。而本发明提取得到的酒黄精黄酮提取物可以显著降低顺铂诱导的小鼠急性肾损伤，口味甘甜，无刺激性。且本发明提取得到黄精总黄酮仍体现出较优良的体外抗非小细胞肺癌增殖作用，因此，为临床应用顺铂治疗非小细胞肺癌提供了新的增效减毒物质，能够用于制备缓解顺铂诱导的急性肾损伤的药物。
[0207]
综上，经本发明方法提取的黄精总黄酮提取物不仅总黄酮含量高，且具有强大的清除自由基能力，可通过抗机体脂质过氧化速率和强度，降低顺铂对肾组织的氧化损伤。其清除自由基的能力较目前研究较多的肾保护作用的黄精多糖成分清除自由基能力更强。
[0208]
显然，上述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。